A lo largo de la Tesis Doctoral se ha remarcado la dificultad que presenta el estudio del sistema bacteria-planta y la falta de datos para entender el desarrollo de estas interacciones a nivel molecular. Esto es debido, en gran parte, a que la mayoría de las investigaciones se centran en el estudio de un efecto en concreto sin llegar a conocer su alcance real y las sinergias y antagonismos que tienen lugar durante la interacción. Un ejemplo concreto es la observación de que la producción de IAA en grandes cantidades puede afectar negativamente al crecimiento vegetal debido a la estimulación de la síntesis de etileno (Burg y Burg, 1966; Spaepen et al., 2007; Glick, 2012). De hecho, presentar una gran batería de propiedades PGP no siempre implica un gran efecto en la promoción del crecimiento vegetal, habiéndose observado que bacterias que poseen un reducido número de propiedades PGP también consiguen aumentar el crecimiento vegetal (Smyth et al., 2011). Por todo lo comentado anteriormente, el hecho de comprobar la existencia de varias propiedades PGP en Azoarcus sp. CIB (ver más arriba) no era una prueba suficiente para poder clasificar a esta bacteria como promotora del crecimiento vegetal.
Los experimentos de colonización de Azoarcus sp. CIB sobre arroz demostraron que las plantas inoculadas con la cepa CIB producían alrededor de un 30% más de biomasa (Fig. 22), sin que este aumento de la biomasa se tradujera en una mayor longitud radicular o del tallo. Además, para poder confirmar que el efecto PGP se debía a alguna de las propiedes presentes en Azoarcus sp. CIB y descartar un posible efecto fertilizador de la materia orgánica aportada por las bacterias, se llevó como control la inoculación de arroz por E. coli (cepa no endófita) que no produjo ningún efecto significativo sobre el crecimiento vegetal (Fig. 22). Resultados similares se han descrito tras inocular arroz con Serratia sp., una PGPB fijadora de nitrógeno en la que se observó un aumento significativo de la biomasa del arroz sin afectar al crecimiento radicular y aéreo (Sandhiya et al., 2005). Asimismo, los datos existentes sobre el crecimiento del arroz al inocular con Azoarcurs sp. DQS-4 mostraron un incremento de biomasa, tanto del tallo como de la raíz, en torno al 50% (Faoro et al., 2017) aunque, desafortunadamente,
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en ese trabajo no se presentaron los datos de longitud del tallo y raíz. Curiosamente, la inoculación de arroz con la cepa BH72 tan solo mejoró un 15% el crecimiento de las plántulas, e incluso lo redujo un 25% si las plantas crecían en medio suplementado con malato (Hurek et al., 1994; Reinhold-Hurek y Hurek, 1997). Esta observación se achacó a una gran concentración de bacterias en el meristemo apical lo que causaría un perjuicio a la planta (Hurek et al., 1994), confirmando la complejidad de factores a tener en cuenta cuando se estudian las relaciones beneficiosas-perjudiciales entre plantas y bacterias. Finalmente, el aumento de biomasa observado cuando se inocula el arroz con la cepa CIB sugiere que la promoción del crecimiento se debe más a un proceso de biofertilización debido a la fijación de nitrógeno por Azoarcus sp. CIB, que a la producción de IAA la cual redundaría en un mayor crecimiento radicular o una inhibición, dependiendo del nivel de producción de IAA bacteriano (Sandhiya et al., 2005; Spaepen et al., 2007). No obstante, la determinación del factor(es) implicado en la promoción del crecimiento del arroz por parte de Azoarcus sp. CIB deberá ser objeto de estudio futuro.
Con el objetivo de obtener una cepa con mayor potencial como promotora del crecimiento vegetal se introdujo una nueva propiedad PGP en Azoarcus sp. CIB. Así, de entre las principales propiedades PGP descritas y no presentes en Azoarcus sp. CIB, ni en ninguna bacteria del género Azoarcus caracterizadas hasta la fecha, se decidió implementar la actividad ACC desaminasa (ver apartado 2.3.1 de la Introducción) debido a: (i) su amplia distribución entre bacterias que interaccionan con planta, (ii) el efecto visible sobre la planta, incluso con bajos niveles de expresión, (iii) la facilidad de introducción en Azoarcus sp. CIB al estar codificada por un único gen, y (iv) la posibilidad de testar rápidamente la actividad ACC desaminasa mediante un ensayo enzimático estandarizado (Penrose y Glick, 2003; Glick, 2005, 2014; Santoyo et al., 2016). Por ello, se clonó en un plásmido multicopia el gen acdS de la bacteria modelo B. phytofirmans PsJN (Tabla 4) y se comprobó su funcionalidad demostrando la adquisición de la actividad ACC desaminasa en la cepa recombinante Azoarcus sp. CIB (pSEVA237acdS) (Fig. 23). Estos resultados constituyen el primer ejemplo que se describe en la literatura de clonación y expresión funcional de un gen acdS heterólogo en una bacteria del orden Rhodocyclales. El plásmido pSEVA237acdS representa así una nueva
Discusión
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herramienta genética para intentar expandir la actividad ACC desaminasa a bacterias que carecen de dicha actividad.
Para confirmar si la nueva cepa recombinante Azoarcus sp. CIB (pSEVA237acdS) tenía realmente incrementado su potencial PGP, se probó si su inoculación en arroz confería un mayor crecimiento vegetal en condiciones de estrés que desencadenan altas concentraciones de etileno en la planta. Con este fin, se utilizó cadmio, metal que había sido previamente descrito como inductor de estrés, especialmente estrés oxidativo, y que aumenta los niveles de etileno en plantas (Steffens, 2014). Bacterias productoras de fitohormonas, como el IAA, y con actividad ACC desaminasa promueven el crecimiento de arroz en condiciones de estrés a cadmio, aunque los mecanismos moleculares no han podido ser completamente dilucidados (Treesubsuntorn et al., 2017). Además, también en arroz, se había estudiado el papel del gen acdS en la promoción del crecimiento en condiciones de estrés a metales pesados, en este caso níquel, al comprobar que tras inocular con una cepa mutante, sin capacidad ACC desaminasa, no se observaba una mejora del crecimiento del arroz (Han et al., 2015). La relación entre metales pesados y etileno ya había sido también descrita y revisada por Arshad y colaboradores (2007) en plantas transgénicas que expresan el gen bacteriano acdS por lo que tienen concentraciones menores de etileno que las plantas silvestres, y eran capaces de resistir mejor el estrés mediado por metales pesados que las plantas silvestres. Los resultados presentados en este trabajo revelan que la expresión del gen acdS en Azoarcus sp. CIB permite un mayor crecimiento del arroz en presencia de cadmio, ya que las plantas inoculadas con Azoarcus sp. CIB (pSEVA237acdS) mostraron una mayor biomasa que las inoculadas con la cepa control Azoarcus sp. CIB, y que, por supuesto, el control sin inocular (Tabla 8, Fig. 24).
Como se ha indicado anteriormente, existe una relación directa entre los niveles de ROS celular y los niveles de etileno en la planta. Así, plantas mutantes de A. thaliana insensibles a etileno mostraban una menor formación de aniones superóxido (ROS) en condiciones de estrés oxidativo que las plantas silvestres (Keunen et al., 2016). De igual forma, se ha descrito una reducción de la actividad superóxido dismutasa en plantas inoculadas con PGPBs con actividad ACC
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desaminasa en condiciones de estrés oxidativo mediado por metales y compuestos aromáticos (Weyens et al., 2010, 2015). Por ello, para tratar de confirmar que la promoción del crecimiento del arroz inoculado con Azoarcus sp. CIB (pSEVA237acdS) en presencia de cadmio estaba directamente relacionada con una disminución de los niveles de etileno en la planta, se procedió a valorar ROS midiendo la actividad SOD en planta. Como cabría esperar, la presencia de cadmio aumentaba significativamente la actividad SOD en la planta (Fig. 25). Sin embargo, las plantas inoculadas con la cepa Azoarcus sp. CIB (pSEVA237acdS) mostraban unos niveles de actividad SOD claramente inferiores a los de la planta inoculada con la cepa silvestre o a los de la planta sin inocular (Fig. 25). Estos resultados sugieren, por lo tanto, una disminución de los niveles de etileno en la planta inoculada con la cepa recombinante que expresa el gen acdS, lo que finalmente redunda en un mayor crecimiento vegetal en condiciones de estrés tales como la presencia de metales tóxicos. No obstante, no puede descartarse que parte del efecto de promoción del crecimiento observado pueda deberse no tanto a la reducción de los niveles de etileno en la planta sino a un efecto biofertilizante debido al incremento del amonio biodisponible en la rizosfera por acción de la enzima ACC desaminasa producida por la cepa recombinante Azoarcus sp. CIB (pSEVA237acdS) (Esquivel-Cote et al., 2013).
En conjunto, todos estos resultados demuestran por primera vez que la clonación y expresión heteróloga de un gen acdS en una bacteria que interacciona con arroz es una estrategia exitosa para promover el crecimiento de la planta en ambientes contaminados con cadmio.