Como se ha indicado en la Introducción (apartado 3), el di-GMPc es un segundo mensajero bacteriano que está implicado en la regulación de multitud de funciones celulares. Sin embargo, su papel en las interacciones beneficiosas planta-bacteria y, más concretamente, en relaciones endófitas, apenas ha sido estudiado. En los apartados anteriores se ha demostrado la implicación de algunos componentes celulares (pili tipo IV, flagelo y exopolisacárido) en la colonización de las raíces del arroz por Azoarcus sp. CIB (Römling et al., 2013). Por ello se decidió investigar cómo afecta la variación de los niveles intracelulares de di- GMPc a la colonización endofítica de Azoarcus sp. CIB y analizar si estas variaciones afectaban directamente a la expresión de los genes que codifican los pili, el flagelo y el exopolisacárido.
Para la realización de estos experimentos se utilizaron cepas de Azoarcus sp. CIB que producen diferentes niveles de di-GMPc al ser portadoras de plásmidos que expresan enzimas de síntesis (diguanilato ciclasa, DGC) o degradación (fosfodiesterasa, PDE) de di-GMPc. Las tres cepas seleccionadas contienen los plásmidos (Tabla 5): (i) pIZ1016, plásmido control; (ii) pIZ2133, plásmido derivado de pIZ1016 que expresa, bajo control del promotor Ptac y el regulador LacIq, el gen PA2133 de P. aeruginosa PAO1 que codifica una
fosfodiesterasa de di-GMPc previamente caracterizada (Hickman et al., 2005); (iii) pIZ4959, plásmido derivado de pIZ1016 que expresa, bajo control del promotor Ptac y el regulador LacIq, el gen PP4959 de P. putida KT2440 que codifica una
diguanilato ciclasa (Matilla et al., 2011).
Las cepas Azoarcus sp. CIB (pIZ2133) y Azoarcus sp. CIB (pIZ4959) son, por tanto, cepas con niveles de di-GMPc reducidos o incrementados, respectivamente, con respecto a la cepa parental Azoarcus sp. CIB (pIZ1016) (Martín-Moldes et al., 2016). Debido a la dificultad técnica de añadir el inductor IPTG en la endosfera del arroz para asegurar la expresión de los genes PA2133 y PP4959, se comprobó, en ausencia de inductor, si se observaban los fenotipos asociados a las variaciones en los niveles de di-GMPc. En concreto, se estudió la
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variación de la movilidad de tipo swarming y swimming y la morfología de las colonias en placa (Fig. 37). Tanto en los ensayos de swarming como de swimming la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZ2133) veía aumentada su movilidad respecto a la cepa control con el plásmido vacío. Por el contrario, la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZ4959) reducía levemente su capacidad de movilidad de tipo swarming y de forma más drástica su movilidad de tipo swimming respecto a la cepa control (Fig. 37).
Figura 37. Movilidad y morfología de las colonias de cepas de Azoarcus sp. CIB que expresan genes implicados en el metabolismo del di-GMPc. Se caracterizó la movilidad de tipo swarming en placas de medio MC-piruvato al 0,2% (m/v) con agar 0,4%; de tipo swimming en placas de medio VM con agar 0,3%, y la morfología de las colonias en medio VM agar 1,5% suplementado con rojo Congo (0,5 g/l) (apartados 6.1.3 y 6.1.4 de Materiales y Métodos). Las placas se inocularon con las cepas Azoarcus sp. CIB (pIZ1016) (plásmido vacío), Azoarcus sp. CIB (pIZ2133) (expresión de la fosfodiesterasa PA2133) y Azoarcus sp. CIB (pIZ4959) (expresión de la diguanilato ciclasa PP4959). Las placas se cultivaron durante 7 días a 30ºC.
Resultados
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Los resultados obtenidos son consistentes con los fenotipos esperados cuando se disminuyen los niveles de di-GMPc (aumento de la movilidad) o se aumentan los niveles de di-GMPc (promoción del estilo de vida sésil), de acuerdo a lo descrito en la literatura (Jenal et al., 2017). Respecto a la morfología de la colonia, la cepa modificada con el plásmido pIZ2133 generó colonias más lisas y llanas, mientras que la expresión del plásmido pIZ4959 hizo que las colonias fuesen más rugosas, lo que también está de acuerdo con los datos de la literatura que indican que un aumento en los niveles de di-GMPc supone una mayor síntesis de exopolisacárido y, consecuentemente, una mejor capacidad para la formación de biofilm y formación de colonias rugosas (Jenal et al., 2017).
Para saber si la modificación de los niveles de di-GMPc afectaba a la expresión de los genes relacionados con los fenotipos diferenciales observados (movilidad y morfología de colonia), se realizó un análisis de expresión, mediante RT-PCR cuantitativa, de los genes pilY1 (gen codificante para una proteína implicada en la síntesis y estabilización de pili tipo IV), pilC (gen codificante de una proteína estructural del flagelo) y epsF (gen asociado a la síntesis de exopolisacárido). Los resultados obtenidos (Fig. 38) revelaron que la expresión del gen epsF no se ve significativamente alterada en ninguna de las dos cepas que poseen niveles modificados de di-GMPc, sugiriendo que el control del exopolisacárido por di-GMPc se efectúa a otro nivel. De igual forma, los genes pilY1 y pilC tampoco veían significativamente alterada su expresión en Azoarcus sp. CIB (pIZ2133) respecto al control con plásmido vacío. Sin embargo, los resultados de expresión de estos dos genes en la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZ4959) indicaron una represión de 3-3,5 veces respecto al control, lo que explicaría el descenso de movilidad observado tanto en los ensayos de swarming como en los de swimming.
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Figura 38. Expresión de los genes pilY1, fliC y epsF en cepas de Azoarcus sp. CIB que poseen diferentes niveles de di-GMPc. Los niveles de tránscrito de los genes pilY1, fliC y epsF, en las cepas Azoarcus sp. CIB (pIZ2133) y Azoarcus sp. CIB (pIZ4959) crecidas en medio VM aeróbico durante 24 h, se determinaron mediante RT-PCR cuantitativa a partir del RNA total extraído y procesado según se detalla en los apartados 3.4 y 3.5 de Materiales y Métodos. La expresión de los genes se relativizó, según el método ΔΔCt, a la expresión correspondiente de cada gen en la cepa control Azoarcus sp. CIB (pIZ1016) utilizándose como control interno la expresión del gen constitutivo dnaE. Se indica el valor medio y la desviación estándar correspondiente a los resultados de tres experimentos independientes.
Tras la caracterización fenotípica de las cepas de Azoarcus sp. CIB con niveles modificados de di-GMPc, se realizaron ensayos de colonización de raíces de plántulas de arroz. Como puede observarse en la figura 39, tanto la disminución como el aumento de los niveles de di-GMPc afectaban negativamente a la capacidad endofítica de Azoarcus sp. CIB. Cuando las plántulas se inocularon con Azoarcus sp. CIB (pIZ2133) se recuperaron 1,46 x 103 bacterias/g raíz, valor que
corresponde a una caída de más de un orden de magnitud respecto a los endófitos extraídos de la inoculación con la cepa control (2,5 x 104 bacterias/g raíz). La
inoculación con la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZ4959) no tuvo un efecto negativo tan drástico en la interacción con la planta, recuperándose 7,63 x 103 bacterias/g raíz,
lo que significa una pérdida de eficacia en la colonización del 70% con respecto a la cepa control. Por lo tanto, estos datos en su conjunto sugieren que la modificación de los niveles de di-GMPc, tanto su aumento como su disminución, tienen un efecto negativo sobre la capacidad de Azoarcus sp. CIB de vivir como endófito en las raíces del arroz.
Resultados
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Figura 39. Cuantificación de distintas cepas de Azoarcus sp. CIB con diferentes niveles de di-GMPc en las raíces del arroz. Se inocularon plántulas de arroz con las cepas Azoarcus sp. CIB (pIZ1016) (plásmido vacío), Azoarcus sp. CIB pIZ2133 (expresión del gen PA2133) y Azoarcus sp. CIB (pIZ4959) (expresión del gen PP4959). Las plantas se crecieron a 25 ºC durante 5 días, tras lo cual se contabilizaron las bacterias presentes en el interior de sus raíces que previamente se desinfectaron superficialmente (ver sección 6.3 de Materiales y Métodos). En el gráfico se muestran los valores de UFC por gramo de raíz (peso fresco) de tres experimentos independientes, mostrándose también la desviación estándar. Los asteriscos muestran la significancia de las diferencias observadas al comparar las cepas con niveles modificados de di-GMPc respecto a la cepa control y aplicar el método estadístico de análisis de varianza ANOVA y test de Bonferroni P<0,01 (**); P<0,05 (*).