En el apartado 2.2.1 de la Introducción se ha revisado el estado del conocimiento actual sobre los factores bacterianos relacionados con el establecimiento del estilo de vida endófito. Los estudios realizados en la bacteria modelo Azoarcus sp. BH72 han permitido concluir que tanto la movilidad como la adhesión son esenciales para una correcta interacción planta-bacteria (Böhm et al., 2007; Buschart et al., 2012). Con el objetivo de seguir profundizando en el estudio de estos mecanismos moleculares, se generaron cepas de Azoarcus sp. CIB mutantes en genes que codifican proteínas implicadas en la síntesis de los pili tipo IV o en la movilidad del flagelo. Estas cepas mutantes fueron caracterizadas fenotípicamente y se realizaron experimentos para estudiar su capacidad de colonización de raíces de arroz en comparación con la cepa silvestre.
122
4.1.- Implicación de los pili tipo IV en la interacción entre Azoarcus sp. CIB y el arroz
Como se ha indicado en el apartado 4.1 de la Introducción, Azoarcus sp. CIB posee varios clusters génicos (Tabla 2) presuntamente responsables de la síntesis de los pili tipo IV implicados en movilidad y adhesión bacteriana (Martín- Moldes et al., 2015). Estudios previos realizados en Azoarcus sp. BH72 habían demostrado el papel de la pilina menor (PilX) en la adhesión, movilidad y colonización endofítica de esta cepa (Shidore et al., 2012).
Con el objetivo de confirmar en Azoarcus sp. CIB la participación de PilX en la colonización de la raíz de arroz, se construyó la cepa mutante Azoarcus sp. CIBdpilX que contiene una disrupción insercional del gen pilX (Tabla 4), tal y como se detalla en el apartado 5 de Materiales y Métodos. Para comprobar que la mutación se había realizado correctamente y analizar posibles efectos polares sobre el gen pilY1 situado en posición 3’ a pilX (Fig. 26A), se amplificaron mediante RT-PCR fragmentos de los genes pilX y pilY1. Como puede observarse en la figura 26B, mientras que en la cepa silvestre se detectó la expresión tanto del gen pilX como de pilY1, en Azoarcus sp. CIBdpilX no se pudieron detectar tránscritos de ninguno de estos genes, confirmándose así la inactivación del gen pilX y el efecto polar de la inserción en los genes localizados en posición 3’ a dicha inserción.
Figura 26. Organización y expresión de un cluster génico de biosíntesis de los pili tipo IV en Azoarcus sp. CIB. A) El gen pilX (rojo) presuntamente codifica una pilina menor de los pili tipo IV. Los genes y los espacios intergénicos se representan a escala. B) Electroforesis en geles de agarosa de los productos de RT-PCR de los genes pilX y pilY1 obtenidos a partir de RNA extraído de las cepas Azoarcus sp. CIB (wt) y Azoarcus sp. CIBdpilX (dpilX) cultivadas en medio VM hasta una A600 de 0,6. La extracción del RNA y la técnica de RT-PCR se realizó siguiendo el protocolo
detallado en el apartado 3.5 de Materiales y Métodos, utilizando para la amplificación de los fragmentos de los genes pilX y pilY1 las parejas de oligonucleótidos 5’RTpilX/3’RTpilX y 5’RTpilY1/3’RTpilY1, respectivamente (Tabla 6).
Resultados
123
Una vez confirmada la construcción de la cepa mutante Azoarcus sp. CIBdpilX, se analizó su fenotipo de movilidad. A pesar de que el fenotipo de movilidad más estrechamente asociado a los pili tipo IV es el twitching (Mattick, 2002), no se observó este tipo de movilidad en la cepa Azoarcus sp. CIB (datos no mostrados). Sin embargo, sí se consiguió observar swarming en Azoarcus sp. CIB, un tipo de movilidad en la cual están implicados tanto el flagelo como los pili tipo IV (Kaiser, 2007). En la Fig. 27A se puede observar que la cepa mutante ve reducido su patrón de swarming en un 40% respecto al de la cepa silvestre, lo que está de acuerdo con el fenotipo esperado para un mutante en los genes pil, y sugiere que dichos genes codifican realmente un aparato de movilidad en Azoarcus sp. CIB.
Figura 27. Fenotipos de movilidad y colonización de las cepas Azoarcus sp. CIB y Azoarcus sp. CIBdpilX. A) Movilidad de tipo swarming (en medio MC 0,4% agar; ver apartado 6.1.3 de Materiales y Métodos) de las cepas Azoarcus sp. CIB (pSEVA237) (izquierda) y Azoarcus sp. CIBdpilX (derecha) y cuantificación del diámetro de los halos. N=3, la barra de error indica la desviación estándar. B) Cuantificación del número de endófitos extraídos de raíces de arroz tras la inoculación de plántulas de arroz con las cepas Azoarcus sp. CIB (pSEVA237) y Azoarcus sp. CIB dpilX. Las bacterias se aislaron de plantas crecidas a 25ºC en cámara de cultivo durante 5 días (ver sección 6.3 de Materiales y Métodos). En el gráfico se muestran los valores de UFC por gramo de raíz (peso fresco) de tres experimentos independientes, mostrándose en la gráfica la desviación estándar. Los asteriscos muestran la significancia de las diferencias observadas al comparar las cepas y aplicar el método estadístico de análisis de varianza ANOVA y test de Bonferroni P<0,01 (**); P<0,05 (*).
124
Posteriormente, se analizó la capacidad colonizadora de la cepa mutante Azoarcus sp. CIBdpilX sobre plántulas de arroz. En los ensayos de colonización realizados sobre plántulas de arroz (Fig. 27B) se observó una disminución de más de un orden de magnitud en el número de endófitos reaislados por gramo de raíz en las plántulas inoculadas con la cepa mutante (una media de 3,18 x 103
bacterias) respecto a plántulas inoculadas con la cepa parental Azoarcus sp. CIB (pSEVA237) (4,57 x 104 bacterias). Por lo tanto, estos resultados permiten concluir
que los pili tipo IV están implicados en la interacción de la cepa CIB con la planta de arroz.
4.2.- El flagelo de Azoarcus sp. CIB es necesario para la colonización
Estudios previos han sugerido la necesidad de la presencia de un flagelo funcional para el establecimiento inicial de la interacción planta-bacteria y para la elección del mejor nicho dentro del hospedador, de modo que bacterias endófitas deficientes en flagelo ven mermada su capacidad colonizadora (Buschart et al., 2012)
Figura 28. Imágenes de microscopía electrónica de transmisión de las cepas Azoarcus sp. CIB y Azoarcus sp. CIBdfliM. Imágenes de TEM, obtenidas mediante tinción con ácido fosfotúngstico para facilitar la visualización del flagelo, de células de Azoarcus sp. CIB (A) y Azoarcus sp. CIBdfliM (B).
Azoarcus sp. CIB posee, al menos, un flagelo polar que se puede observar mediante tinción en microscopía electrónica de transmisión (Fig. 28A). La síntesis y regulación del flagelo está codificada en tres clusters génicos que se localizan en distintas regiones del genoma de la cepa CIB (Tabla 2) (Martín-Moldes et al., 2015). Con el objetivo de demostrar si la funcionalidad del flagelo es determinante para el establecimiento de la cepa CIB dentro de la raíz de arroz, se realizó una
Resultados
125
mutación polar en el cluster fli que contiene los genes responsables del motor del flagelo. Para ello, se realizó una mutación insercional del gen fliM (Fig. 29A) obteniéndose la cepa mutante Azoarcus sp. CIBdfliM (Tabla 4) según el protocolo descrito en el apartado 5 de Materiales y Métodos. Posteriormente, se confirmó mediante RT-PCR la correcta inserción y sus efectos polares en el cluster fli de la cepa Azoarcus sp. CIBdfliM (Fig. 29B).
A pesar de que la mutación del gen fliM no conlleva la pérdida estructural del flagelo polar (Fig. 28B), la realización de ensayos de movilidad de tipo swimming, movimiento bacteriano asociado a flagelos (Kearns, 2010), demostraron que la cepa mutante ve mermada su capacidad de movimiento en torno a un 50% respecto a la cepa parental (Fig. 30A), lo que sugiere una importante pérdida de funcionalidad del flagelo, como cabría esperar al inactivarse el motor flagelar.
Figura 29. Organización génica y expresión del cluster de biosíntesis del motor flagelar en Azoarcus sp. CIB. A) El gen fliM (rojo) codifica una subunidad estructural del motor del flagelo, Los genes se representan a escala. B) Electroforesis en geles de agarosa de los productos de RT- PCR de los genes fliM y fliO obtenidos a partir de RNA extraído de las cepas Azoarcus sp. CIB (wt) y Azoarcus sp. CIB dfliM (dfliM) cultivadas en medio VM hasta una A600 de 0,6. La extracción del
RNA y la técnica de RT-PCR se realizó siguiendo el protocolo detallado en el apartado 3.5 de Materiales y Métodos, utilizando para la amplificación de los fragmentos de los genes fliM y fliO las parejas de oligonucleótidos 5’RTfliM/3’RTfliM y 5’RTfliO/3’RTfliO,respectivamente (Tabla 6).
Una vez caracterizado el fenotipo de la cepa Azoarcus sp. CIBdfliM, se realizó un ensayo de colonización de plántulas de arroz (apartado 6.3 de Materiales y métodos). El resultado obtenido (Fig. 30B), reveló que el número de
126
endófitos tras la inoculación con la cepa mutante fue en torno a un orden de magnitud inferior (3,43 x 103 bacterias) al número de endófitos extraídos tras la
inoculación con la cepa silvestre (4,57 x 104 bacterias). Estos resultados confirman
un papel importante del flagelo en algún estadío de la colonización endofítica del arroz por Azoarcus sp. CIB, y revelan por primera vez que la mera presencia del flagelo no es suficiente, sino que éste debe ser plenamente funcional para facilitar la interacción con la planta.
Figura 30. Fenotipos de movilidad y capacidad de colonización de las cepas Azoarcus sp. CIB y Azoarcus sp. CIBdfliM. A) Movilidad de tipo swimming en placa de agar semisólido (ver sección 6.1.3 de Materiales y métodos) de las cepas Azoarcus sp. CIB (pSEVA237) y Azoarcus sp. CIB dfliM, y cuantificación del diámetro de los halos. B) Cuantificación del número de endófitos extraídos de raíces de arroz tras la inoculación con las cepas Azoarcus sp. CIB (pSEVA237) y Azoarcus sp. CIBdfliM. Las plántulas se crecieron a 25ºC en cámara de cultivo durante 5 días siguiendo el protocolo descrito en el apartado 6.3 de Materiales y Métodos. En el gráfico se muestran los valores de UFC por gramo de raíz (peso fresco) de tres experimentos independientes ± desviación estándar. Los asteriscos muestran la significancia de las diferencias observadas al comparar las cepas y aplicar el método estadístico de análisis de varianza ANOVA y test de Bonferroni P<0,01 (**).