Los metales y metaloides constituyen aproximadamente el 75% de los elementos químicos conocidos y están distribuidos de forma ubicua en la biosfera. Algunos metales y metaloides, e.g, Na, K, Mg, Ca, V, Mo, Mg, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn o Se, son esenciales para la vida (Maret, 2016) y la mayor parte de las proteínas dependen de cofactores metálicos para su correcta estructura y/o funcionamiento (Lemire et al., 2013; Chandrangsu et al., 2017). Por otro lado, los metales y metaloides son imprescindibles en numerosos procesos industriales y, por consiguiente, en nuestra vida diaria (Gadd, 2010). Como consecuencia de la actividad antropogénica industrial los metales se han redistribuido en el ambiente, acumulándose en un gran número de hábitats terrestres y acuáticos, y pudiendo producir efectos adversos sobre la biota y la salud humana (Tchounwou et al., 2012). Atendiendo a su elevada concentración en algunos ambientes, 13 metales y metaloides han sido clasificados como contaminantes prioritarios: Ag, As, Be, Cd, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb, Sb, Se, Tl, Zn (Sparks, 2007). A pesar de su toxicidad, muchas bacterias han desarrollado una gran variedad de mecanismos de resistencia, lo que les permite proliferar en lugares contaminados con metales y metaloides (Gadd, 2010).
Los mecanismos de resistencia bacteriana a metales y metaloides se basan principalmente en dos estrategias: (i) cambios en la especiación del metal, promoviendo su movilización o inmovilización, lo que incluye transformaciones rédox, la producción de péptidos y proteínas que unen metales (metalotioneinas) y la precipitación por unión a materia orgánica e inorgánica (Gadd, 2010); y (ii) expulsión del metal al exterior celular utilizando bombas de extrusión (Nies, 2003).
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Uno de los mecanismos de movilización de metales más estudiado es la resistencia a mercurio mediada por los genes mer que codifican las enzimas responsables de la reducción de Hg2+ a Hg0 volátil (Barkay et al., 2003). La
proteína MerA cataliza la reducción de Hg2+ a Hg0. Otros componentes del operón
mer son el regulador transcripcional MerR, una proteína periplásmica de unión a Hg2+ (MerP) y la proteína de membrana (MerT) que une Hg2+ en el periplasma y lo
transporta al citoplasma para su reducción. Tras la reducción del ion Hg2+, el Hg0
volátil difunde a través de la pared celular al exterior. La movilización de metales mediante volatilización también se ha estudiado, por ejemplo, en otros metales como el Cd o el Pb, o en metaloides como el As, el Se o el Te, que pueden ser metilados, siendo estas formas metiladas muy volátiles. No obstante, estos sistemas de resistencia pueden suponer un riesgo para la salud debido a que algunas formas metálicas metiladas son altamente tóxicas (Pongratz y Heumann, 1999; Ranjard et al., 2002; Yang y Rosen, 2016).
Entre los mecanismos de inmovilización de metales ampliamente estudiados se incluye la enzima Cu-oxidasa periplásmica, CueO, que oxida Cu1+
a Cu2+. En este caso la oxidación del Cu1+ es un proceso de detoxificación, ya que
se produce una variante de cobre que es menos tóxico y con menor capacidad de entrada en el citoplasma (Bondarczuk y Piotrowska-Seget, 2013). Otros mecanismos de resistencia que incluyen cambios redox y/o inmovilización son la reducción extracelular de Cr6+ a Cr3+, que impide su entrada en la célula (Ramírez-
Díaz et al., 2008); la quelación de iones metálicos mediante la producción de sideróforos, e.g., la pioverdina producida por P. aeruginosa es capaz de quelar, además de hierro, Ag+, Al3+,Cd2+, Co2+, Cr2+, Cu2+, Eu3+, Ga3+, Hg2+, Mn2+, Ni2+,
Pb2+, Sn2+, Tb3+, Tl+ y Zn2+ (Schalk et al., 2011), o la adsorción a los
exopolisacáridos bacterianos, e.g., los exopolisacáridos de cianobacterias como Anabaena spiroides que son utilizados para la biosorción de Mn2+ o Pb2+ (Gupta
y Diwan, 2017).
La expulsión o extrusión al medio representa el principal mecanismo de resistencia general a metales pesados en bacterias. Este mecanismo está basado en la presencia en las membranas bacterianas de una batería de transportadores dependientes de energía, de forma que los iones metálicos que entran al
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citoplasma o periplasma son bombeados de nuevo hacia el exterior (Nies, 2003). Se han documentado cuatro tipos de bombas de extrusión de metales (Fig. 7): (i) las ATPasas de tipo P; (ii) los transportadores de tipo CBA; (iii) los transportadores CHR y (iv) los transportadores de tipo CDF (Nies, 2003).
Figura 7. Principales familias de transportadores implicados en la resistencia a metales pesados en bacterias Gram-negativas. Los transportadores ATPasa de tipo P acoplan el bombeo de los sustratos desde el citoplasma al periplasma a la hidrólisis de ATP. Los transportadores CBA abarcan toda la envuelta celular de bacterias Gram-negativas y expulsan los metales tanto del periplasma como del citoplasma utilizando la energía del gradiente quimiosmótico. Los transportadores CHR exportan cromato del citoplasma al periplasma utilizando la energía proporcionada por la fuerza protón-motriz. Los transportadores CDF utilizan la fuerza protón-motriz para expulsar iones metálicos desde el citoplasma al periplasma.
Las ATPasas de tipo P constituyen una superfamilia de transportadores que movilizan cationes inorgánicos, principalmente H+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cu+, Cu2+,
Ag+, Zn2+, Cd2+, Co2+ o Pb2+, a través de las membranas celulares desde el
citoplasma hacia el periplasma mediante la energía obtenida de la hidrólisis de ATP (Nies, 2003). El subgrupo de las ATPasas de tipo P1B tiene especial
importancia en la resistencia bacteriana a metales, al transportar específicamente cationes de Cu+, Cu2+, Ag+, Zn2+, Cd2+, Co2+ y Pb2+ (Argüello, 2003). Estas
ATPasas se encuentran intercaladas en la membrana citoplásmica y presentan tres dominios conservados: (i) el dominio transmembrana que suele presentar entre 6-8 hélices transmembrana que se encargan del transporte del sustrato; (ii) el dominio de unión a ATP, encargado de generar la energía necesaria para el transporte mediante la hidrólisis del ATP y (iii) el dominio activador encargado de la defosforilación (Smith et al., 2014).
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Los transportadores de tipo CBA pertenecen a la familia de transportadores RND (Resistance-Nodulation-cell Division) y están formados, principalmente, por un complejo proteico de tres componentes (Saier et al., 1994; Tseng et al., 1999): (i) la propia proteína de tipo RND localizada en la membrana interna; (ii) una proteína periplásmica MFP (Membrane Fusion Protein) (Andersen et al., 2001); (iii) una proteína OMF (Outer Membrana Factor) que forma el canal transmembrana para el transporte del catión (Johnson y Church, 1999). En conjunto forman un complejo de extrusión capaz de exportar directamente al exterior celular iones metálicos desde el citoplasma y/o el periplasma (Nies, 2003). Este sistema de extrusión también es utilizado por las bacterias para expulsar los iones metálicos presentes en el periplasma como consecuencia de la acción de otros sistemas de extrusión tales como los trasportadores ATPasa de tipo P, los CHR o los CBF. Los sistemas de transporte CBA mejor caracterizados son: (i) el complejo CzcCBA de la β-proteobacteria Cupriavidus metallidurans CH34 relacionado con la resistencia a Cd2+, Zn2+, Ni2+ y Co2+ que permite la extrusión de
estas formas iónicas al exterior celular mediada por la energía procedente de la fuerza protón-motriz (Nies, 1995, 2003); y (ii) el complejo CusCFBA de Escherichia coli relacionado con la resistencia a Cu+ y Ag+ que, además de las
proteínas estructurales de la bomba de extrusión CBA, contiene una proteína accesoria, denominada CusF, localizada en el periplasma y que se une al metal (Delmar et al., 2015).
Los transportadores CHR pertenecen a una superfamilia de transportadores de cromo presentes en los tres dominios de la vida (Díaz-Pérez et al., 2007). En bacterias, el gen chrA codifica una proteína transmembrana que permite la exportación de cromato del citoplasma al periplasma utilizando la fuerza protón-motriz (Jiménez-Mejía et al., 2006; Viti et al., 2014).
Por último, los transportadores CDF (Cation Diffusion Facilitator) están principalmente asociados a la homeostasis celular ya que pueden actuar tanto para exportar como para importar metales. En bacterias se ha documentado su implicación en el transporte de un amplio rango de metales, incluyendo Fe2+, Co2+,
Ni2+, Zn2+ o Cd2+ (Nies, 2003) empleando la fuerza protón-motriz para el transporte
Introducción
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Debido a que en esta Tesis Doctoral se va a tratar principalmente la resistencia bacteriana a selenio, teluro y arsénico, en los siguientes apartados se detallarán los mecanismos de resistencia conocidos a estos metaloides.