Como se ha indicado en la Introducción, dentro del género Azoarcus se han identificado dos grupos filogenéticos: (i) microorganismos aislados de suelos o raíces, degradadores aeróbicos de compuestos aromáticos y adaptados a vivir como endófitos de arroz y otras gramíneas; (ii) bacterias de vida libre, aisladas principalmente de suelos contaminados, desnitrificantes y degradadores de compuestos aromáticos en condiciones tanto aeróbicas como anaeróbicas (Reinhold-Hurek y Hurek, 2000; Rabus, 2005; Martín-Moldes et al., 2015; Faoro et al., 2017). Al inicio de esta tesis doctoral no se había descrito ninguna especie del género Azoarcus especializada en la degradación de compuestos aromáticos en anaerobiosis y capaz de vivir en la endosfera de la planta. Sin embargo, se habían descrito cepas del género Azoarcus capaces de vivir como endófitos que habían sido aisladas de suelos libres de raíces (Laguerre et al., 1987; Chen et al., 2013). Por otro lado, en el genoma de Azoarcus sp. CIB se han identificado genes que se han descrito en otros organismos como necesarios para la colonización de la planta, tales como los que codifican los pili tipo IV, el flagelo, varios sistemas de secreción, o los implicados en la fijación de nitrógeno (Hardoim et al., 2015; Martín-Moldes et al., 2016). Por todo ello, se decidió investigar si Azoarcus sp. CIB podría establecerse como endófito de plantas, eligiéndose el arroz como modelo de hospedador para la interacción tal y como se ha venido realizando con otras especies endófitas del género (Reinhold-Hurek y Hurek, 2000; Faoro et al., 2017).
1.1.- Aislamiento de Azoarcus sp. CIB del interior de raíces de arroz
Estudios previos llevados a cabo con endófitos han demostrado que la proteína fluorescente verde (GFP) es un buen marcador para el seguimiento y visualización de la colonización bacteriana de la planta (Egener et al., 1998; Germaine et al., 2004). Por ello, en los estudios de colonización de raíz que a continuación se detallan se utilizó una cepa de Azoarcus sp. CIB portadora del plásmido pSEVA237, el cual expresa constitutivamente el gen que codifica la proteína GFP (Tabla 5).
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En primer lugar, se analizó la capacidad de Azoarcus sp. CIB para vivir como endófito cuantificando la presencia de la cepa CIB en la endosfera de raíces de arroz. Para ello se inocularon, en condiciones gnotobióticas, plántulas de arroz con Azoarcus sp. CIB (pSEVA237) y con dos cepas control: (i) A. communis SWub3 (pSEVA237), microorganismo que ha sido descrito previamente como endófito de arroz (Reinhold-Hurek et al., 1993); y (ii) E. coli CC118 (pSEVA237), una cepa que no ha sido descrita como endófito de arroz. Las raíces fueron procesadas a los 5 días de realizarse la inoculación tal y como se describe en Materiales y Métodos. Mientras que las cepas A. communis y Azoarcus sp. CIB mostraron en torno a 1x105 UFC/g de raíz y 6x104 UFC/g de raíz, respectivamente,
apenas se recuperaron UFC de E. coli en las placas analizadas (Fig. 14). Este resultado sugiere la capacidad de Azoarcus sp. CIB para colonizar internamente la raíz de arroz.
Figura 14. Cuantificación de bacterias endófitas extraídas de raíces de arroz. Se inocularon plántulas de arroz con las cepas A. communis SWub3, Azoarcus sp. CIB y E. coli CC118, todas ellas portadoras del plásmido pSEVA237 que expresa constitutivamente el gen reportero gfp. Las plantas se crecieron a 25 ºC durante 5 días, tras lo cual se contabilizaron las bacterias presentes en el interior de las raíces de arroz (ver sección 6.3 Materiales y Métodos). En el gráfico se muestran los valores de UFC por gramo de raíz (peso fresco) de tres experimentos independientes ± desviación estándar.
1.2.- Visualización in planta de Azoarcus sp. CIB
Para confirmar los resultados presentados en el anterior apartado, se procedió a la observación directa de la bacteria dentro del tejido radicular utilizando técnicas de microscopía.
Resultados
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La primera técnica microscópica empleada para la observación in planta de la cepa CIB fue la microscopía de epifluorescencia. Para ello se utilizaron preparaciones de raíces inoculadas con Azoarcus sp. CIB (pSEVA237), superficialmente desinfectadas y procesadas, a los 5 días (Fig. 15A) y 10 días de la inoculación (Fig. 15B). Las bacterias se localizaron a lo largo de toda la raíz en agrupaciones, observándose principalmente en las zonas próximas al crecimiento de los pelos radiculares (Fig. 15A). Es interesante destacar el cambio morfológico que se observa a lo largo del tiempo. Así, Azoarcus sp. CIB presenta una morfología de tipo bacilar, similar a la del cultivo planctónico, a los 5 días de la inoculación (Fig. 15A y 15B), mientras que trascurridos 10 días se observan células más cortas y redondeadas (Fig. 15C y 15D).
Figura 15. Raíces de arroz inoculadas con Azoarcus sp. CIB (pSEVA237). Imágenes de microscopía de epifluorescencia de raíces inoculadas con la cepa CIB a los 5 días (paneles A y B) y 10 días (paneles C y D) tras la inoculación. En los paneles derechos (B, D) se muestra una ampliación de las imágenes recuadradas en los paneles A y C en las que se puede observar en detalle la morfología de las bacterias.
Las imágenes de microscopía de epifluorescencia no permiten discernir si las células de la cepa CIB se encuentran en los tejidos internos de la raíz o simplemente fuertemente adheridas al rizoplano. Para poder confirmar la presencia de Azoarcus sp. CIB en el interior de la raíz se empleó la técnica de microscopía confocal (Fig.16). Para estos experimentos se tomaron raíces que
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habían sido inoculadas con la cepa Azoarcus sp. CIB (pSEVA237) 7 días antes. Se pudo observar, de nuevo, la distribución predominante de las bacterias en agrupaciones, principalmente en los espacios intercelulares de la exodermis (Fig. 16A). La proyección xyz de las imágenes obtenidas nos muestra que las bacterias se distribuyen de mayor a menor concentración desde el exterior hacia los tejidos más internos de la raíz (Fig. 16B).
Figura 16. Colonización de las raíces de arroz por Azoarcus sp. CIB. Imágenes de microscopía confocal de las raíces de arroz a los 7 días tras la inoculación con Azoarcus sp. CIB (pSEVA237). A) Las bacterias se distribuyen como células independientes o en agrupaciones en los espacios intercelulares de la exodermis radicular. B) Proyección xyz de la distribución de las células bacterianas desde la superficie al interior de la raíz de arroz.
Para confirmar estas observaciones y determinar la localización exacta de Azoarcus sp. CIB en los tejidos internos se realizaron preparaciones de raíces de arroz inoculadas con la cepa CIB en condiciones gnobióticas y recogidas a los 7 días después de la inoculación. Para su visualización mediante microscopía electrónica de transmisión, las muestras fueron fijadas, incluidas en bloques, cortadas y observadas al TEM, tal y como se detalla en el apartado 8.2.1 de Materiales y Métodos. Como paso previo a la observación por TEM, se visualizaron las inclusiones por microscopía óptica, permitiendo confirmar la distribución mayoritaria de las células bacterianas en los espacios intercelulares de la rizodermis y en las primeras capas de la exodermis (Fig.17A), aunque también se identificaron algunas bacterias en capas más profundas de la exodermis, en la zona de contacto con el parénquima (Fig.17B). No se detectaron
Resultados
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bacterias en las muestras que no fueron previamente inoculadas con Azoarcus sp. CIB, lo que confirma que las células observadas corresponden a la cepa CIB.
Figura17. Imágenes de microscopía óptica de secciones transversales de raíces de arroz inoculadas con Azoarcus sp. CIB. Las raíces se procesaron a los 7 días tras la inoculación. A) Colonización de los espacios intercelulares de la rizodermis, así como de la segunda y tercera capa de la exodermis. B) Colonizacón intercelular de capas internas de la exodermis en contacto con el parénquima. Ex, exodermis; R, rizodermis.
Con la finalidad de identificar mediante inmunolocalización las células de la cepa CIB en el interior de los tejidos de la raíz del arroz, las muestras preparadas para TEM se incubaron con anticuerpos anti-NifH, que a su vez se marcaron con un anticuerpo secundario unido a oro coloidal (Fig. 18), de acuerdo al protocolo descrito en la sección 8.2.1 de Materiales y Métodos. NifH es una de las proteínas constituyentes de la nitrogenasa y es previsible que las células de CIB la estén expresando cuando viven como endófito, tal y como ya se ha observado en Azoarcus sp. BH72 (Egener et al., 1999). En las imágenes obtenidas con TEM, las bacterias se inmunolocalizaron en los espacios intercelulares de la la exodermis (Fig. 18 C y D) y en las zonas más internas junto al parénquima (Fig. 18 E y F). Es destacable que la mayor concentración de bacterias se encuentra en las capas más internas de la raíz, esto puede deberse al hecho de que la síntesis de NifH es un proceso dependiente de oxígeno (Dixon, 1998) por lo que las capas internas de la exodermis presentan una mayor expresión del complejo de la nitrogenasa debido a una menor disponibilidad de oxígeno.
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Figura 18. Imágenes de microscopía electrónica de transmisión de raíces de arroz colonizadas por Azoarcus sp. CIB. Las raíces se procesaron a los 7 días tras la inoculación. Para localizar las células se emplearon anticuerpos anti-NifH y el complejo NifH-anticuerpo se detectó mediante anticuerpos secundarios unidos a oro coloidal. A) Colonización superficial y de la rizodermis. C) colonización de los espacios intercelulares de la segunda y tercera capa de la exodermis. E) colonización de las capas más internas de la exodermis, en contacto con el parénquima. Para una observación detallada de las bacterias inmunolocalizadas, en los paneles de la derecha (B, D y F) se presenta una ampliación de la zona recuadrada en su respectivo panel izquierdo. EI, espacio intercelular; Ex, exodermis; P, parénquima; PC, pared celular; R, rizodermis.
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