Crioconservación de ejes embrionarios de castaño

1.2.1 Material vegetal y condiciones de cultivo

Los ejes embrionarios de castaño utilizados en los ensayos de crioconservación, fueron obtenidos de semillas recolectadas a principios de octubre de árboles de Castanea sativa Mill. Las semillas se trataron con un fungicida, Fernide, a una concentración de 5g l-1 durante media hora, después de lo cual se secaron superficialmente sobre un papel filtro a temperatura ambiente y se almacenaron en bolsas de papel a 4ºC.

En el caso de los embriones cigóticos el medio de cultivo utilizado en los ensayos fue el MS (Murashige y Skoog, 1962), a la mitad de concentración de los nitratos (Tabla 1) adicionando 2,2 µM de benzilaminopurina (BA) (Sigma Chemical Co. B-9395), 3% de sacarosa, 1 ml l-1 de PPM (Plant Preservative Mixture) y 6 g l-1 de Vitroagar (Hispanlab,

S.A.). El pH de los medios se ajustó en un valor comprendido entre 5,6 y 5,7 con NaOH 1 N y HCl 1 N antes del proceso de esterilización en autoclave a una presión de 1 atmósfera (121°C) durante 20 minutos. Seguidamente se dispensó en tubos de pirex de 20 x 150 mm, con 16,5 ml de medio por tubo de cultivo, cerrados con Kap-upts (Bellco®).

Tabla 1: composición del medio de cultivo de GD (Gresshoff y Doy,1972) y de Murashige y Skoog (1962). Composición GD MS (½ nitratos) Macronutrientes mg l-1 _{mg l}-1 NH4NO3 1000,00 825,0 KNO3 -- 950,00 CaCl22H2O 150,00 440,00 MgSO4 7H2O 250,00 370,00 KH2PO4 -- 170,00 (NH4)2 SO4 200,00 -- NaH2PO4 H2O 90,00 -- Na2HPO4 30,00 -- KCl 300,00 -- Micronutrientes mg l -1 mg l-1 MnSO4 H2O 10,00 16,90 KI 0,75 0,83 H3BO3 3,00 6,20 ZnSO4 7H2O 3,00 8,60 Na2 MoO4 2H2O 0,25 0,25 CuSO4 5H2O 0,25 0,025 CoCl2 6H2O 0,25 0,025 Hierro mg l -1 _{mg l} -1 Na2EDTA 37,30 37,30 FeSO4 7H2O 27,80 27,80

Vitaminas y compuestos orgánicos mg l –1 mg l-1

M-Inositol 10,00 -- Acido nicotínico 0,10 0,50 Piridoxina HCl 0,10 0,50 Tiamina HCl 1,00 0,10 Glicina 0,40 --

Una vez que los explantos fueron inoculados o transferidos a los diferentes medios de cultivo se mantuvieron bajo unas determinadas condiciones de luz y temperatura en cámaras de crecimiento climatizadas. Se utilizó una cámara de oscuridad continua con

una temperatura constante de 25°C, y otra con luz fotoperíodica durante 16 horas suministrada por tubos fluorescentes de luz blanca (Mazdafluor 7D TF 36w/ LJ) con una densidad de flujo radiante de 50- 60 µmol m-2 s -1. La temperatura fue de 25°C durante la fase de luz y de 20°C durante la de oscuridad (condiciones estándar).

1.2.1.1 Esterilización de las semillas

Se procedió a la esterilización superficial de las semillas en condiciones asépticas en la cabina de flujo laminar, utilizando un vaso de precipitados estéril de 1 l de capacidad, donde se aplicó sucesivamente un baño de etanol al 70% durante dos minutos e inmersión en una solución de hipoclorito sódico al 5% con unas gotas de tween 80 durante 30 minutos. Seguidamente se realizaron cuatro lavados con agua milliQ estéril, dejándose las semillas en el mismo vaso con el agua del último lavado durante el tiempo que duró el aislamiento de los ejes embrionarios.

1.2.2 Crioconservación mediante la técnica de desecación

Este procedimiento es uno de los más simples a la hora de preacondicionar el material que va a ser almacenado en nitrógeno líquido, y ha sido aplicado en el caso de embriones cigóticos y ejes embrionarios de varias especies (Engelmann, 1997). El proceso tiene como fin la disminución parcial del contenido de agua. Para lograr esto en el caso de castaño, se aislaron los ejes embrionarios separándolos de los cotiledones con la ayuda de un escalpelo, disponiéndose en placas de Petri abiertas expuestas al flujo laminar durante distintos períodos de tiempo. Se ensayaron siete tratamientos de desecación (0, 1, 2, 3, 4, 5, y 7 horas), empleándose 30 ejes embrionarios por tratamiento. Finalizados los distintos períodos de desecación se introdujeron 5 ejes embrionarios por cada criovial, introduciéndose rápidamente en nitrógeno líquido durante 24 horas. Para cada periodo de desecación, se dispuso de otros 30 ejes que se transfirieron a medio de proliferación como tratamiento control.

Además se determinó el porcentaje de humedad de los ejes después de cada tratamiento de desecación; de esta forma, se evaluó el peso fresco de un total de 10 ejes embrionarios con tres repeticiones, después de cada tratamiento. Seguidamente los ejes fueron desecados totalmente en estufa a 85ºC durante 24 horas para determinar su peso seco. El contenido de humedad de cada período de desecación se calculó y expresó

como el porcentaje de agua en base el peso fresco (% contenido hídrico = peso fresco- peso seco/ peso fresco).

1.2.3 Descongelación, recuperación y cultivo del material crioconservado

Después de 24 horas en nitrógeno líquido, el material se descongeló sumergiendo los crioviales en un baño a 40ºC durante 2 minutos y seguidamente los ejes embrionarios fueron cultivados en placas de Petri conteniendo medio de recuperación según 1.2.1 pero con una concentración de agar de 5g l-1. Transcurridas 24 horas, los ejes embrionarios fueron transferidos a los tubos con medio de cultivo fresco con la concentración de agar incrementada de 6 g l-1. Las dos primeras semanas después de la descongelación, los ejes embrionarios se mantuvieron en oscuridad a 25°C, para después transferirse a condiciones estándar de la cámara de crecimiento, hasta completar 8 semanas para su evaluación. Así mismo se diseñaron tratamientos controles con los mismos períodos de desecación pero sin nitrógeno líquido.

1.2.4 Evaluación de datos y análisis estadístico

La evaluación del ensayo se llevó a cabo a las ocho semanas tomando en cuenta los siguientes parámetros:

• Supervivencia, que comprende el porcentaje de ejes embrionarios que presentaron algún tipo de crecimiento, incluyendo el desarrollo normal de planta, ejes que sólo desarrollaron raíz y explantes que formaron callo.

• Porcentaje de regeneración de plantas, definido como el número total de plantas que se desarrollaron directamente a partir de los ejes embrionarios con respecto al número total de ejes utilizados y expresado como porcentaje.

• Se evaluó también la longitud promedio de la raíz y longitud promedio de brote. Los resultados de los experimentos realizados en la crioconservación de los ejes embrionarios de castaño se analizaron con el test de independencia (chi- cuadrado; p<0,05) para las diferencias significativas.