Evaluación del material crioconservado

Los métodos de crioconservación exponen al material a diferentes estreses físicos, químicos y fisiológicos que pueden desencadenar cambios genéticos y epigenéticos con efectos adversos sobre el genoma del material regenerado después del cultivo in vitro y de la congelación (Harding, 2004).

Una vez regenerados los brotes de castaño después del proceso de crioconservación mediante el protocolo de vitrificación, se establecieron diferentes líneas independientes en cada clon (juvenil y adulto). Cada línea deriva de un brote regenerado a partir de un ápice crioconservado y en cada una de dichas líneas se evaluaron sus características morfológicas y fisiológicas (tasa de multiplicación y enraizamiento), y moleculares, y se compararon con el material no crioconservado.

1.4.1 Multiplicación de los cultivos de brotes crioconservados

Los brotes regenerados a partir del material crioconservado se mantuvieron en medio de recuperación durante 8 semanas, tanto el material de origen juvenil como adulto. Pasado este tiempo se llevaron a medio de proliferación (0,4 µM de BA), con objeto de multiplicar el material mediante el cultivo de brotes axilares. En el caso del clon 12 el material recuperado de crioconservación se multiplicó en un medio de proliferación adicionando 0,4 µM de BA o 0,2 µM de BA.

Evaluación y análisis estadístico

Para la evaluación de los cultivos de brotes axilares, se emplearon 12 brotes de cada línea y se compararon con aquellos obtenidos a partir de los ápices no crioconservados. Las medidas se realizaron durante tres subcultivos sucesivos.

En las evaluaciones se determinó:

• Número de brotes producidos por explanto

• Número de segmentos producidos por explanto utilizados en el siguiente subcultivo (tamaño medio 8mm).

• Longitud del brote más largo

Los datos fueron analizados estadísticamente mediante análisis de varianza ANOVA. Para la comparación de medias se empleo el test de Dunnet o t- student, con un nivel de significación del 95% (p<0,05).

1.4.1.1 Ensayos de enraizamiento de clones crioconservados

Para evaluar la capacidad de enraizamiento en los clones juveniles (818 y 12) se utilizaron brotes de al menos 2 cm, con ápices en crecimiento activo, que se inocularon en un medio de enraizamiento constituido por medio de GD con los macronutrientes reducidos a la tercera parte, adicionado con sacarosa 0,1 M, agar Difco 5,5 g l-1 y ácido indol butírico (AIB) a una concentración de 14,7 µM, dispensado en jarras de 300 ml. Estos cultivos se incubaron durante cinco días en oscuridad a 25ºC, siendo después transferidos a un medio de enraizamiento sin auxina y con una concentración de agar Difco de 7 g l-1; sometidos a condiciones estándar de luz y temperatura hasta su evaluación.

En los clones adultos los brotes de al menos 2 cm de longitud, se trataron en el medio de enraizamiento descrito (GD 1/3 macronutrientes), pero con una concentración de 122,5 µM de AIB, incubando el material durante 24 horas en condiciones estándar. Completado este período se transfirieron a medio de enraizamiento sin auxina y con una concentración de agar Difco de 7 g l-1 (Sánchez y col, 1997). Para cada tratamiento de enraizamiento tanto en los clones juveniles como adultos, se dispusieron los controles utilizando el material stock no crioconservado.

1.4.1.2 Evaluación y análisis estadístico

Para los ensayos se utilizaron 18 brotes (3 jarras con 6 explantos cada uno) por tratamiento. Se evaluó la cinética de enraizamiento, teniendo en cuenta el día en que emergió la primera raíz en cada brote enraizado después de iniciado el experimento de enraizamiento y se calculó el porcentaje acumulativo de brotes enraizados, durante el tiempo que duró el experimento. Dicho porcentaje se calculó utilizando la siguiente ecuación:

Ped = número acumulativo de brotes enraizados por día x 100 número total de brotes

A las cuatro semanas de iniciado el experimento se determinaron los siguientes parámetros:

• Número explantos enraizados por tratamiento expresado como porcentaje • Número de raíces por brote enraizado

Con los datos obtenidos se realizó un análisis de varianza ANOVA I y las medias se compararon con el test de mínima diferencia significativa (DMS) con un nivel de significación del 95% (p<0,05).

Los valores expresados como porcentajes fueron previamente transformados con la función arcosen x1/2, que permitió la normalización de los valores.

1.4.2 Análisis molecular de fidelidad genética

Como consecuencia de los tratamientos utilizados en la crioconservación, los tejidos se exponen a diferentes estreses físicos, químicos y fisiológicos, los cuales pueden ocasionar daños en el genoma del material criconservado y que por el momento no son del todo conocidos. Por tanto las plantas regeneradas mediante cultivo in vitro después de un proceso de crioconservación pueden presentar variación somaclonal (Harding, 2004). Es por ello necesario evaluar la estabilidad genética del material regenerado, y en la presente memoria hemos utilizado maracadores moleculares RAPD (Polimorfismos de ADN amplificados al azar).

El objetivo fue determinar la conformidad genética mediante RAPD de las líneas de brotes de castaño regeneradas a partir de ápices crioconservados con relación a los brotes stock.

1.4.2.1 Material vegetal

En el análisis de la estabilidad genética se utilizaron brotes de los clones juveniles y adultos de castaño (no crioconservados), así como brotes de las líneas derivadas de ápices crioconservados, que se mantienen en proliferación, mediante la multiplicación de brotes axilares en crecimiento activo, en medio de GD adicionado con sacarosa 0,1 M, agar Difco 7 g l-1y BA 0,4 µM.

Al finalizar un período de subcultivo se recolectaron hojas de cada planta en forma individual, pesando 120 mg, tanto de los clones no crioconservados, como de las líneas crioconservadas. Las muestras se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a –70ºC hasta el momento de su utilización.

1.4.2.2 Extracción del ADN

Las hojas se homogenizaron en morteros con nitrógeno líquido y la extracción de ADN se realizó, empleando el kit de extracción de ADN de Quiagen, Dneasy® Plant Mini, siguiendo las instrucciones del fabricante.

La cuantificación del ADN se determinó mediante espectrofotometría realizando dos lecturas a 260 nm y 280 nm. La lectura a 260 nm nos permite calcular la concentración de ADN de la muestra, para ello se debe tener en cuenta que un OD equivale a 50 µg/ de ADN.

1.4.2.3 Diseño experimental

En este análisis se utilizaron tres clones juveniles de castaño 818, 812 y 12; y uno adulto, el clon Pr-5. En el caso del clon 818 se utilizaron dos líneas crioconservadas, y en los clones 12 y 812 se utilizó una sola línea de cada uno de ellos. En el clon adulto Pr-5, se emplearon dos líneas crioconservadas.

Para las reacciones de amplificación se utilizaron 18 muestras distribuidas de la siguiente manera, según el clon:

En el clon 818:

4 muestras de material no crioconservado

7 muestras de una línea regenerada a partir de material crioconservado

7 muestras de una segunda línea regenerada a partir de material criconservado

En el caso de los clones 812 y 12 se realizaron los análisis en forma conjunta en un mismo gel de agarosa disponiéndose las 18 muestras de la siguiente forma:

3 muestras del clon 812 de material no crioconservado

6 muestras de la línea regenerada a partir de material crioconservado del clon 812 3 muestras del clon 12 de material no crioconservado

1.4.2.4 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Para los análisis de estabilidad, se realizaron las reacciones amplificación en un termociclador PE Applied Biosystems, utilizando un volumen de reacción de 25 ul, con 20 ng de ADN y 0,4 U de Biotaq DNA polimerasa (Bioline). Se emplearon 40 cebadores de 10 bases (20 del kits A y 20 de S de Operon Technologies). En la Tabla 2 se describen las concentraciones y volúmenes de los reactivos de la reacción de amplificación.

Tabla 2: Relación de componentes, concentraciones y volúmenes de las reacciones

Componentes Concentración final µl

dH2O 8,2 Tampón 10Xa 1X 2,5 MgCl2 (50 mM) 6 mM 3 BSA b_{(10 mg/ml) 0,4 mM 1} dNTPs 2,5 mM 200 µM 2 Cebador (2 µM) 0,4 µM 5

Taq polimerasa (2U) 0,6U 0,3

a: Tampón 10X: Tris- HCl (67 mM, pH 8,8), (NH4)2 SO4 (16 mM)

b: BSA: seroalbúmina bovina (Sigma Chemical)

El programa de amplificación utilizado con una duración de cuatro horas, se describe en la Tabla 3. Para todos los diseños experimentales se realizaron por lo menos dos repeticiones por primer.

Tabla 3: Programa de amplificación utilizado en la reacción (Sánchez y col., 2003)

1 ciclo 94ºC 1 minuto 94ºC 10 segundos 36ºC 15 segundos 45 ciclos 72ºC 90 segundos 1 ciclo 72ºC 7 minutos

Los productos resultantes de la amplificación se almacenaron a 4ºC hasta su posterior resolución por electroforesis.

1.4.2.5 Electroforesis

Los productos de amplificación se visualizaron en geles de agarosa (Invitrogen) al 1,4% en TBE 0,5X ( 0,05 M Tris-base, 0,045 M ácido bórico, 0,001 M EDTA pH8) y 0,15 µg/ml de bromuro de etidio (BioRad). A cada producto de amplificación se le añadieron 5 µl de tampón de carga (20% Ficoll, 1% SDS, 0,1 M EDTA y 0,25% de azul de bromofenol). Para determinar el tamaño de los productos de amplificación en cada gel se incluyó el marcador de peso molecular 100 pb DNA Leadder (Invitrogen). Los geles se desarrollaron en TBE 0,5X a 150 V durante cuatro horas. Pasado este tiempo se visualizaron en un transiluminador y se fotografiaron con un equipo de imagen digital (Quantity One 1-D Análisis software, BioRad).

1.4.2.6 Análisis de geles

El análisis de las bandas de RAPD se realizó utilizando el programa, Quantity One 1-D Análisis software (BioRad), las bandas se seleccionaron en función de su intensidad como también por su peso molecular. Aquellas que se mantuvieron presentes en las repeticiones realizadas para cada cebador y con la misma intensidad fueron las que se han tenido en cuenta en el análisis, las demás fueron descartadas.