Micropropagación de Quercus spp

Los trabajos realizados en micropropagación de roble han utilizado generalmente ápices, segmentos nodales y brotes de origen juvenil debido a la mayor respuesta de este material frente al de origen adulto. También se han desarrollado sistemas de embriogénesis sómatica a partir de tejido embrionario y adulto (Wilhelm, 2000; Toribio y col., 2004; Valladares y col., 2006).

El roble es una especie con baja capacidad de regeneración in vitro ya que su manipulación y establecimiento resulta difícil. Durante el período de establecimiento el cultivo debe estabilizarse, es decir, pasar de tener un crecimiento episódico, impredecible e incluso anormal, típico en los brotes recién aislados, a tener un crecimiento uniforme y predecible (Vieitez y col., 1994). En roble existen problemas de contaminación endógena y de liberación de polifenoles al medio de cultivo, en

respuesta a heridas de excisión o a infecciones y que puede inhibir el crecimiento y causar necrosis (Scalbert y col., 1988; Meier y Reuther, 1994).

El método más utilizado para la micropropagación del roble es el de la proliferación de yemas axilares empleando explantos de origen o carácter juvenil (renuevos basales, brotes epicórmicos) debido a la mejor respuesta de este material frente al adulto, procedente de la copa. En distintas investigaciones se han comparado las tasas de multiplicación y enraizamiento de los cultivos de origen adulto y juvenil, encontrando siempre una menor respuesta en material de origen adulto (San-José y Vieitez, 1985; Juncker y Favre, 1989; Manzanera y Pardos, 1990; Chalupa, 2000). Vieitez y col. (1994) y Sánchez y col. (1996) han conseguido la micropropagación de individuos adultos a partir de brotes epicórmicos obtenidos mediante brotación forzada en segmentos de ramas de la copa.

Otro sistema de micropropagación desarrollado es la embriogénesis somática la cual se ha conseguido a partir de material embrionario (embriones cigóticos maduros e inmaduros), material que contiene células con características embriogénicas y son capaces de recuperar un patrón de desarrollo embriogénico con cierta facilidad (Wilhem, 2000). En material no embrionario se ha obtenido también la inducción de embriogénesis somática. En Quercus ilex se logró embriogénesis a partir de fragmentos de hojas de árboles adultos (Féraud-Keller y Espagnac, 1989; Féraud- Keller y col., 1989). En Quercus rubra como material inicial se utilizaron discos de hojas de plántulas de 6-8 semanas (Rancillac y Klinguer, 1995). En Quercus petraea, Jörgensen (1993) indujo la formación de embriones somáticos en anteras. En Quercus robur, utilizando hojas y entrenudos de plántulas de 3 semanas, la frecuencia de inducción osciló entre 16 % y 4% según el origen del material de partida (Cuenca y col., 1999). En Quercus suber y Quercus robur se obtuvo embriogénesis a partir de hojas recién expandidas provenientes de brotes epicórmicos forzados en ramas de árboles adultos, con frecuencias de inducción comprendidas entre 23% y 8% en Q. suber (Hernandez y col., 2003), mientras que la inducción en Q. robur fue inferior con valores de 0,3 a 4,0% (Toribio y col., 2004), según el genotipo y la fecha de recolección.

5.3 Crioconservación

Los trabajos realizados sobre crioconservación en el género Quercus, se refieren principalmente a la crioconservación de embriones cigóticos (utilizando el eje embrionario) y cultivos embriogénicos.

En Quercus nigra, Q. falcata, Q. rubra, Q. alba, Q. macrocarpa, Q. muhlenbergii, los ejes embrionarios fueron desecados parcialmente en cámara de flujo laminar y crioconservados, sin embargo el porcentaje de supervivencia fue bajo y consistió solamente en desarrollo de callo (Pence, 1990; Pence, 1992). Esta misma tecnología de desecación se aplicó a los ejes embrionarios de Quercus ilex y Quercus suber (González-Benito y col., 2002) los cuales fueron seguidamente tratados con la congelación de dos fases, ensayando dos velocidades distintas de precongelación. En Quercus ilex, con contenidos de humedad de 0,22 g/g (en base a su peso fresco), la supervivencia fue del 15% para la velocidad menor y de 94 % para aquella más rápida, sin embargo en ambos casos el porcentaje de producción de brotes fue similar (12,5% y 15% respectivamente) aunque no se obtuvo la regeneración de planta completa. En el caso de ejes embrionarios de Quercus suber, se observó una baja tasa de supervivencia (sin elongación de brotes) empleando la congelación en dos fases con velocidades medias de congelación, mientras que no hubo supervivencia con tasas más rápidas (González- Benito y col., 2002).

En un protocolo desarrollado por Berjak y col. (2000) para la crioconservación de ejes embrionarios de Quercus robur, se demostró que utilizando la deshidratación con aire comprimido (flash drying) (contenido de humedad 0,21g/g en base a su peso fresco), seguida de la inmersión inmediata en nitrógeno líquido, se obtenían niveles de supervivencia de alrededor de un 40 %, porcentaje que mejoraba (66%) al utilizar los ejes de semillas almacenadas durante diez semanas, aunque el crecimiento consistió en el desarrollo de raíz solamente. Estos autores señalan también que cuando los ejes embrionarios se descongelaron rápidamente en una solución de 1 µM CaCl2 y 1 µM

MgCl2, el 70% de los ejes inicia el desarrollo del brote, aunque no especifican

claramente si obtienen la formación de plantas completas.

Con respecto a la crioconservación de cultivos de embriones somáticos, en Quercus petraea se logró la crioconservación mediante tratamiento de los embriones con una solución crioprotectora, seguido de congelación lenta antes de la inmersión en nitrógeno líquido. Esta metodología, permitió obtener porcentajes de supervivencia de 90% a

100% (Jörgensen, 1990). En la crioconservación de cultivos embriogénicos de Quercus robur, la aplicación del procedimiento de desecación (24% de contenido hídrico) seguida de una inmersión rápida en nitrógeno líquido permitió recuperar la capacidad embriogénica, mejorando considerablemente estos resultados con la aplicación del método de vitrificación y el tratamiento con PVS2 antes de la inmersión en nitrógeno líquido (Martínez y col., 2003). En embriones somáticos de Quercus suber se logró también crioconservación mediante de un protocolo de vitrificación utilizando PVS2, obteniendo porcentajes de recuperación superiores al 60% (Valladares y col., 2004). Al igual que en castaño, no se han encontrado hasta la fecha, referencias bibliográficas sobre la crioconservación de ápices caulinares de roble a pesar del interés que supondría la utilización de este material para la crioconservación de germoplasma propagado vegetativamente.

El castaño (Castanea sativa Mill.), especie nativa de Europa, es de gran importancia económica y ecológica; sin embargo, sus poblaciones han sido devastadas por enfermedades de origen fúngico, como la tinta causada por Phytophtora cambivora y P. cinnamomi y el cáncer producido por Cryphonectria parasitica. Por esta razón se han encaminado los esfuerzos en encontrar individuos que naturalmente sean resistentes a estas enfermedades, o bien en obtener híbridos resistentes con los cruces C. crenata y C. mollisimima, especies de origen asiático ambas resistentes a la tinta y la primera tolerante al cáncer. El roble (Quercus robur) también es una especie de gran importancia en los ecosistemas de bosque tanto de España como del resto de Europa, por su papel ecológico y por su importancia económica en la producción de madera y otros productos.

Dado que ambas especies tienen semillas recalcitrantes, su conservación y su propagación vegetativa es muy problemática, por lo que el mantenimiento de genotipos interesantes o germoplasma élite tendría que hacerse mediante colecciones de campo o a través del cultivo in vitro de algunos clones, lo cual significaría para la primera opción un riesgo de perder las colecciones por plagas, desastres naturales y en la segunda un coste y volumen de trabajo elevado, con las posibilidades de la ocurrencia de variación somaclonal o pérdida por contaminación de los cultivos. Para especies con estas características, recalcitrantes y difíciles para la propagación vegetativa, actualmente uno de los sistemas más seguros para la conservación a largo plazo del germoplasma es el almacenamiento del material vegetal en nitrógeno líquido o crioconservación. Sin embargo, una vez que se decide la creación de un banco de germoplasma mediante crioconservación, surge la necesidad de establecer la conformidad genética de las plantas regeneradas después de haber sido criconservadas.

Por lo anteriormente expuesto se ha determinado el desarrollo de este trabajo a través de la consecución de los siguientes objetivos.

1. Desarrollo de sistemas de conservación a largo plazo de germoplasma de castaño y roble mediante técnicas de biotecnología vegetal, en concreto crioconservación y cultivo in vitro.

2. Crioconservación de ejes embrionarios aislados de semillas de castaño y roble aplicando la metodología basada en desecación parcial del explanto seguido de inmersión rápida de nitrógeno líquido.

3. Crioconservación de material clonal procedente de cultivos multiplicados in vitro de castaño y roble utilizando ápices caulinares de material de origen juvenil y adulto.

4. Aplicación y comparación de la efectividad de las metodologías de vitrificación y encapsulación-desecación, para la crioconservación de ápices caulinares de las dos especies objeto de estudio

5. Evaluación de la estabilidad genética del material regenerado después de la criconservación a través de parámetros morfológicos, fisiológicos y moleculares (RAPD) comparándolo con los cultivos stock.