la mayor inhibición del crecimiento observada. Por otra parte, la proteína doble mutante KidA55G/T69G muestra un menor efecto, en comparación con los mutantes sencillos, tanto en la inhibición de la síntesis de proteínas como en la del crecimiento.
La mutación KidT46G origina unos efectos en la unión al ARN similares a los de las proteínas KidA55G y KidT69G, aunque, a diferencia de ellas, muestra un efecto drástico en la eficiencia de corte del ARN. Los resultados de rotura con sustratos más largos (CopT) muestran una actividad ARNasa residual en la que se mantiene la especificidad de corte (Resultados
Figura 20). Una posible hipótesis que explicaría dichos resultados sería que esta mutación
causara la extensión del lazo S3-S4, formado por la región comprendida entre los residuos S47 y F57, que conforma una región dinámica de la proteína (M. Kamphuis, datos no publicados). La extensión del lazo podría permitir que residuos adyacentes al mismo interfieran con residuos del centro catalítico, impidiendo su correcto funcionamiento. Otra hipótesis posible sería que la mutación T46G pudiese interferir en la unión correcta del sustrato, impidiendo así un corte eficiente. El residuo T46 está altamente conservado en el alineamiento de secuencias de proteínas homólogas, lo cual sugiere una posible implicación en el reconocimiento específico del sustrato (Hargreaves y col., 2002b). El doble mutante KidT46G/T69G posee el mismo fenotipo que el mutante KidT46G, lo que indica que la mutación T46G es dominante frente a la mutación T69G.
El mutante KidR85W afecta de un modo más drástico en la unión al ARN con respecto el resto de mutantes. El residuo R85 establece un puente salino con el residuo E18, estabilizando la superficie de unión de Kid al ARN. La mutación R85W impide la formación de dicho puente salino, permitiendo una distorsión local en la estructura del dímero. Además, el mutante carece de la carga positiva del residuo R85, por lo que se expondrá así a la carga negativa del residuo E18, pudiendo afectar a la interacción con el ARN (Santos-Sierra y col., 2003). Estos cambios explicarían la actividad ARNasa residual de esta proteína, pues su centro catalítico no se vería muy afectado. Además de estos efectos, se podría distorsionar el lazo S1-S2, formado por la región que comprende los residuos del L11 al G21 (M. Kamphuis, datos no publicados) y que incluye el residuo H17 que forma parte del centro catalítico de la proteína. La especificidad de corte de este mutante resulta ser igual a la de la proteína silvestre, tal y como se demuestra en los ensayos de actividad ARNasa residual en sustratos de ARN largos. Dicha actividad residual y específica, indica que la mutación no impide totalmente la actividad ARNasa de la proteína. Además, esta mutación no produce efectos sobre el crecimiento celular, lo que concuerda con su incapacidad para inhibir la síntesis de proteínas (Resultados Figura 25 y
26). Así mismo, la actividad ARNasa residual que se encuentra en la solución no se detecta en
extractos celulares (Munoz-Gomez y col., 2005), lo que explicaría la ausencia de toxicidad in
vivo. Esta diferencia sugiere la posible modulación de la actividad de la proteína in vivo por
Discusión
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Análisis de las mutaciones en residuos del sitio catalítico
Las mutaciones R73H, D75N, D75E y H17P afectan claramente a la eficiencia de corte del ARN, pero no a la eficiencia de unión al sustrato. Las posiciones y funciones de los residuos R73, D75 y H17 son equivalentes a los residuos del sitio activo de ARNsas A y T1 (Kamphuis y col., 2006). Las mutaciones introducidas en estos residuos deben impedir el efecto de dichos residuos en la rotura del ARN, pero no en la unión al sustrato. Se han obtenido los siguientes resultados para cada una de las mutaciones introducidas:
i) Mutación R73H: los aminoácidos arginina e histidina son ácidos monocarboxílicos con bases aminas, donde el tamaño y forma de sus respectivas cadenas laterales son diferentes. Estas diferencias impiden que la histidina sea capaz de sustituir a la arginina como ácido catalítico. R73, además de actuar como ácido catalítico puede reducir el pKa del grupo 2´-OH de la base del ARN al donar un hidrógeno cargado al 2´-O. Dicha acción puede ser realizada por una arginina pero no por una histidina. Otra función asignada a este residuo es la de participar en la especificidad de unión a la secuencia consenso, mediante contactos hidrofóbicos y puentes de hidrógeno con las bases del ARN. Sin embargo, los ensayos de unión proteína-ARN no detectaron efectos en la unión al ARN lo cual sugiere que R73 puede no estar participando en la especificidad de unión tal y como el modelo proponía, o que la histidina puede llegar a suplir esa acción.
ii) Mutación D75N: el aspártico y la asparragina son el ácido dicarboxílico y su correspondiente amida. La estereoquímica de ambos residuos es similar pero la asparragina no posee el carácter ácido necesario para que actúe como base catalítica. En consecuencia, esta mutación impide que se lleve a cabo correctamente la reacción de corte.
iii) Mutación D75E: el aspártico y el glutámico son ácidos dicarboxílicos; la diferencia entre estos dos aminoácidos estriba en que el glutámico posee un carbono adicional en la cadena lateral. El efecto tan claro obtenido en la actividad ARNasa de este mutante, indica que además del carácter ácido, la longitud de la cadena lateral es imprescindible para una catálisis eficiente. La actividad ARNasa residual de este mutante en sustratos de ARN más largos, prueba que el residuo acídico puede desempeñar su papel como base catalítica en el centro activo de la proteína, pero que lo hace de un modo menos eficiente en comparación con el residuo D75. Ambas sustituciones apoyan el papel propuesto de D75 como catalizador básico.
iv) Mutación H17P: en esta mutación el anillo pirrólico de la histidina es sustituido por el anillo heterocíclico de la prolina, anillo que carece de residuos cargados. Por lo tanto, se elimina la amina responsable de establecer el puente de hidrógeno con el oxígeno del fosfato de la ribosa del ARN que se requiere, según propone el modelo, para estabilizar el intermediario de la reacción de corte (Kamphuis y col., 2006). El hecho