2:1 a 1:2, siendo 10 μM la menor concentración de proteína utilizada en todos los casos. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante un minuto antes de ser sometidas a EM. En estos ensayos se utilizó un fragmento de ADN de 30 pb que contiene un palíndromo perfecto que incluye la región -10 del promotor parD. Dicho ADN se obtuvo por hibridación de los oligonucleótidos DownA y DownB. Se utilizó una relación Kis:Kid:ADN de 5:5:1, siendo la concentración del ADN de 3 µM. Para monitorizar la unión de Kid al ARNI (5´-AdUACA-3´) se utilizó una concentración de ambas moléculas de 15 μM, mientras que para los ensayos de corte de ARN se utilizaron las proteínas a 0,2 μM y el ARNII (5´-UUACU-3´) a 50 μM, o el ARNIII (5´-AUACA-3´) a 50 μM y las proteínas a 20 μM.
Las muestras en solución se ionizaron mediante la técnica de nano-electrospray (Z-spray) como se indica en el siguiente párrafo utilizando capilares de alrededor de 5 μm. Estos capilares se realizaron utilizando el instrumento P-97 puller (Sutter Instrument Co., Novato, CA, USA), a partir de cristal de borosilicato (Kwik-Fil, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA). Seguidamente, cada capilar fue recubierto con una fina capa de oro (~500 Å) utilizando el instrumento Edwards ScanCoat Six Pirani 501 sputter coater (Edwards High Vacuum International,
Crawley, UK).
Los experimentos de espectrometría de masas nativa se realizaron tal y como se describe en (Monti y col., 2007), usando el espectrómetro de masas ESI-TOF, equipado con una fuente de ionización nano-electrospray (Z-spray) (ElectroSpray Ionization orthogonal Time-Of-
Flight) (Micromass LC-T, Waters, Manchester, UK) modificado para operar con altas masas y en
modo positivo (detección de moléculas cargadas positivamente) (van den Heuvel y col., 2006). El electrospray se inició aplicando un voltaje eléctrico de 1000-1300 V y una presión interna, en las primeras fases de vacío, de 7-9 mbar para enfriar los iones y conseguir grandes iones de complejos de proteína intactos. La presión en el cono fue de 30-60 V.
Para monitorizar la rotura del ARNII por las diferentes proteínas Kid se acopló al espectrómetro LC-T una fuente de ionización ESI robotizada basada en un chip (Nanomate, Advion Biosciences). La fuente se programó para aspirar un volumen de 2 μl de muestra y llevar la muestra a una punta conductora que, posteriormente, conduce la muestra al chip ESI. El chip consiste en 10 x 10 inyectores en una superficie de silicio y un canal que se extiende hasta la cara interna del chip. El electro-spray se consiguió aplicando un voltaje de 1800-1900 V y una presión de 0,3 psi a la muestra en la punta conductora, y un voltaje de 30 V en el cono. Las muestras fueron medidas con un tiempo de escaneo de 2 segundos hasta completar un total de 10 minutos por muestra.
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Condiciones de ionización débiles
Condiciones de incremento de presión
A
B
Figura 9.- Esquema de la ionización (A) y análisis y detección de las muestras en la espectrometría de masas ESI-TOF (B).
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2.13 Análisis de los datos de espectrometría de masas.
Los datos de EM obtenidos para la proteína Kid silvestre y para las diferentes proteínas mutantes fueron semi-cuantificados para determinar el porcentaje de unión relativo de dimeros de Kid a una molécula del ARNI (AdUACA). Usando el programa MassLynx 4.0 (Waters) los datos fueron acumulados durante 2 minutos, se promediaron, suavizaron, centraron y se integró el área de los picos para obtener los valores de intensidad de cada especie iónica presente. La intensidad total de la proteína presente en la muestra fue calculada sumando la intensidad de todas las especies iónicas pertenecientes a la envoltura Gaussiana del estado de cargas,tanto de la proteína unida como de la no unida. La cantidad de proteína unida fue calculada sumando la intensidad de todas las especies iónicas distribuidas en la envoltura Gaussiana de cargas. El porcentaje de proteína unida al ARNI se calculó como la relación entre el valor de la intensidad de la proteína unida y la proteína total presente en la muestra. El porcentaje relativo de unión se basó en tres medidas independientes, dándose como valor de error su desviación estándar.
La semi-cuantificación de los productos de ARN (UU y ACU), tras el corte por las proteínas Kid, se realizó en diferentes experimentos. Se acumularon 10 minutos de adquisición de datos en grupos de 30 ó 60 segundos, se promediaron, suavizaron y centraron, utilizándose el programa MassLynx 4.0 (Waters). La intensidad de los iones para cada producto de corte fue calculada sumando la intensidad de todas las especies iónicas pertenecientes a la envoltura del estado de carga Gaussiana de los productos bajo análisis. Este valor se sumó al obtenido para el ARN no procesado, obteniéndose la intensidad de todo el ARN presente en la medida. La cantidad del ARN total y de los productos de corte se basó en tres medidas independientes, calculándose su desviación estándar.
2.14 Análisis estadístico de los datos.
Los datos de unión, obtenidos según el apartado 2.13 de esta sección, de las proteínas Kid silvestre y mutantes al ARNI, se trataron estadísticamente para comprobar si existían diferencias significativas en la unión al ARN sustrato. En primer lugar se utilizó el estadístico de Levene para aceptar la igualdad de varianza de los datos, seguidamente, se aplicó el análisis de la varianza de una vía (ANOVA) y el de Bonferroni para evaluar la significación estadística de los datos a un nivel de significancia del 95 %.
2.15 Ensayos de toxicidad.
Los ensayos de toxicidad se llevaron a cabo evaluando el efecto que produce la expresión de los genes kid, kid mutantes, kis, relE, relB, prfA o la presencia de diferentes tipos de antibióticos, sobre el crecimiento y la viabilidad de las estirpes ensayadas. Para ello, cultivos celulares crecidos durante 14 horas fueron diluidos 1:100 en medio fresco LBT, con el antibiótico específico para cada vector de expresión, permitiendo su crecimiento hasta
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llegar a fase exponencial, A600~0,3-0,4. A continuación, se hicieron diluciones seriadas de los cultivos. Se sembraron 7 µl, tanto de los cultivos sin diluir como de las diluciones seriadas, en placas con los antibióticos e inductores apropiados en cada tipo de ensayo. Las placas fueron incubadas a 30, 37 o 42 ºC, según las estirpes utilizadas, durante 16-20 horas. Este método permite una evaluación semi-cuantitativa de los niveles relativos de toxicidad, derivados del factor de dilución para el cuál se obtiene el mismo número de colonias en dos puntos, además de los efectos observables en el crecimiento de las muestras correspondientes a las distintas diluciones.
2.16 Ensayos de complementación.
Los ensayos de complementación se llevaron a cabo en la cepa MRA8 que contiene una mutación termosensible (prfA1ts) en el gen cromosómico prfA que codifica el factor de terminación de la traducción RF1. Dicha cepa fue transformada con los plásmidos derivados de pBAD18 (pELI01, pELI02, pELI03 y pELI04) que contienen las diferentes variantes del gen
prfA (prfA121, prfAwt, prfA301 y prfA304). Estas estirpes fueron crecidas durante la noche a 30
ºC antes de ser diluidas 1:100 en medio fresco LBT con ampicilina 100 µg/ml, en presencia o ausencia de arabinosa (0,2 % final), inductor de la expresión de las proteínas RF1 silvestre y mutantes. Los cultivos se transfirieron a 42 ºC para expresar el fenotipo mutante del gen
prfA1ts y se siguió su A600 cada 20 minutos durante 160 minutos.
2.17 Dicroísmo Circular (DC).
Los estudios de dicroísmo circular (Schmid, 1997) se realizaron en un espectropolarímetro Jasco-720, tal y como se describió anteriormente (Santos-Sierra y col., 2003). Se utilizaron 200 µl de proteína a una concentración entre 10-15 µM, en 100 mM de tampón K2HPO4/KH2PO4 pH 7,0. Se utilizó una cubeta de cuarzo de 0,1 cm de un paso óptico.
Los espectros de DC fueron adquiridos a 5 ºC a longitudes de onda entre 195 y 260 nm (incrementos de 0,2 nm, velocidad de barrido 20 nm/minuto y una constante de tiempo de 4 segundos). Se promediaron 5 espectros por cada muestra y se restó el espectro del tampón como blanco. Las medidas de elipticidad (en milésimas de grado) se representaron usando el programa SigmaPlot 9.0.
La estabilidad térmica de las proteínas fue evaluada mediante experimentos de desnaturalización térmica (Pace y Scholtz, 1997). Para evitar posibles evaporaciones de la muestra por el proceso de calentamiento, éstas fueron previamente cubiertas con dos gotas de aceite mineral. La temperatura de la célula se incrementó de 5 a 90 ºC a una velocidad de 20 ºC por hora, recogiéndose datos de elipticidad a una longitud de onda de 220 nm, máxima señal para las α-hélices. Se representaron los datos como elipticidad (en milésimas de grado) frente a la temperatura.