validación dEl modElo dE unión y cortE dEl arn por la toxina Kid

Kid es una ARNasa ciclante que corta ARN preferente en cadena sencilla entre U y A en secuencias que contienen el triplete 5´-UA(C/A)-3´ (Munoz-Gomez y col., 2005). El corte ocurre por un mecanismo similar al de las ARNasas A y T1 (Kamphuis y col., 2006). Basándose en el modelo de interacción de Kid con el ARN sustrato 5´-AdUACA-3´ descrito por Kamphuis y colaboradores (Kamphuis y col., 2006), se ha caracterizado el papel de determinados residuos propuestos en el modelo que, o bien forman parte del centro catalítico de la proteína, o bien pueden estar implicados en la unión general de ésta a su ARN sustrato o en la unión más específica a las bases de la secuencia de corte. Dicho modelo propone que el centro activo de la proteína está formado por los residuos D75, R73 y H17, que actuarían como base y ácido catalítico y residuo estabilizador, respectivamente. El modelo también postula que los residuos T46, S47, A55, F57, T69, V71 y R73 podrían interaccionar con las bases del ARN estableciendo puentes de hidrógeno o contactos hidrofóbicos que contribuirían a la especificidad de unión al ARN. En la elaboración de este modelo se emplearon sustratos de ARN de pequeño tamaño que permiten por una parte un modelado eficiente de la interacción ARN-proteína, y por otra parte la utilización de la técnica de espectrometría de masas. Dicha elección se basó en la capacidad de esta técnica para identificar complejos proteína-ácidos nucleicos, y para monitorizar reacciones de corte de ácidos nucleicos (van den Heuvel y col., 2005). Para la evaluación de la unión al ARN, se empleó un sustrato mimético no escindible por la proteína, 5´-AdUACA-3´, mientras que para la evaluación de la rotura del ARN se usó el sustrato 5´-AUACA-3´. Los estudios llevados a cabo con este último sustrato, confirmaron que el fosfato objeto de corte es el que establece el enlace fosfodiéster entre las bases U y A.

Para la evaluación del modelo de actividad ARNasa de la proteína Kid, se analizaron los efectos de mutaciones sencillas y dobles en algunos de los residuos que, según el modelo, estaban implicados en la unión al ARN (T46, A55, T69 y R85). Asimismo, en los mismos ensayos se analizó el efecto de mutaciones en todos los residuos que forman parte del centro activo propuesto (H17, R73 y D75). Algunos de estos cambios fueron obtenidos por mutaciones espontáneas, pero debido a que no se lograron mutaciones en todos los residuos objetos de estudio, se obtuvieron dichas mutaciones mediante mutagénesis dirigida. Las proteínas mutantes elegidas para su caracterización fueron KidT46G, KidA55G, KidT69G, KidT46G/ T69G, KidA55G/T69G, KidD75E, KidD75N, KidR73H, KidH17P y KidE5G (Introducción

Figura 4). Puesto que la proteína KidE5G no resultó ser estable in vivo, se descartó su estudio

en la presente investigación. Cabe destacar que la mayoría de las mutaciones espontáneas halladas, tanto cambios puntuales como inserciones y deleciones, se localizaron en una región adyacente al residuo E5, en lo que podría denominarse un punto caliente, hotspot, para acumular mutaciones que inactivan o inestabilizan a la proteína (Resultados Tabla 5 y Figura

Discusión

138

Tras evaluar la estabilidad, la estructura secundaria y la capacidad de las proteínas Kid mutantes para interaccionar con la antitoxina formando complejos T-A capaces de mantener su función reguladora, se pudo concluir que las mutaciones seleccionadas no afectaban de forma global a otras actividades de la proteína y que, por lo tanto, eran apropiadas para evaluar su efecto específico sobre la unión o rotura del ARN.

En el análisis de los efectos de las mutaciones en la en la unión y catálisis del ARN mediante espectrometría de masas, se han utilizado tres sustratos de pequeño tamaño. Para analizar la progresión de las reacciones de corte se utilizaron los sustratos 5´-AUACA-3´, usado previamente para determinar la actividad ARNasa de Kid, y el sustrato 5´-UUACA-3´, por el que Kid muestra mayor preferencia tanto in vivo como in vitro (Pimentel y col., 2005, Kamphuis y col., 2006). Por último, para comparar la unión las proteínas analizadas al ARN, se empleó el sustrato no procesable 5-AdUACA-3, utilizado previamente en el modelado del complejo de unión de Kid al ARN (Kamphuis y col., 2006)

Análisis de mutaciones en residuos implicados específicamente en unión al sustrato

Entre los residuos analizados implicados en la especificidad de unión (ver introducción), se seleccionaron los residuos A55 y T69 debido a que establecen puentes de hidrógeno con las bases que forman el núcleo de la secuencia de ARN procesada por Kid (Figura 4, líneas

punteadas). Ambos residuos están localizados en una región flexible de la toxina (Figura 4). Se llevó a cabo la sustitución de ambos residuos por glicina con el fin de interferir en la

formación de los puentes de hidrógeno con las bases de la secuencia consenso del ARN, sin modificar sustancialmente la región flexible en la que se localizan. Los resultados indican que las mutaciones de dichos residuos inducen efectos claros en la unión de las proteínas al ARN, sin que se inactive su capacidad de corte ni su especificidad. Por lo tanto, estos datos parecen indicar la participación de estos residuos en la unión al ARN. Sin embargo, mutaciones sencillas o dobles en los residuos estudiados no parecen ser suficientes para afectar en la especificidad del corte, lo que sugiere la participación de múltiples residuos en dicha especificidad. En este caso, la especificidad de corte debe de estar determinada por las interacciones globales de varios residuos, a través de contactos hidrofóbicos o de puentes de hidrógeno establecidos con las bases del ARN. La disminución de la eficiencia de corte observada en las proteínas mutantes, probablemente debe ser consecuencia indirecta de la menor unión al sustrato. Además, estas proteínas mutantes conservan la capacidad de inhibir síntesis de proteínas y, por lo tanto, afectan a la viabilidad y al crecimiento celular. La menor inhibición del proceso de síntesis de proteína hallada en KidA55G con respecto a KidT69G, no se ve reflejada en los ensayos de toxicidad. Es más, se observa una inhibición del crecimiento celular más acusada que la observada en presencia de la proteína silvestre. Este último hecho puede deberse a que en el ensayo empleado en la evaluación de toxicidad, la antitoxina generada a 42 ºC está truncada en su extremo C-terminal. Por lo tanto, pueden existir complejidades desconocidas

Discusión

139