Estos resultados son consistentes con el modelo que postula que los residuos D75, H17 y R73 tienen una participación específica en el mecanismo de corte de la toxina Además,
Métodos 2.6.2). En estos ensayos el control positivo consistió en la adición del tampón de
2 implicación dE la toxina Kid En El procEso dE sÍntEsis dE protEÍnas
2.1 Aislamiento de mutantes cromosómicos resistentes a la toxina Kid.
Como consecuencia de su actividad ARNasa, la toxina Kid es capaz de inhibir la síntesis de proteínas en procariotas y eucariotas (de la Cueva-Mendez y col., 2003, Munoz-Gomez y col., 2005). La obtención casual de nuevos mutantes en el factor de terminación RF1, abrió la posibilidad de explorar la participación de este componente de la maquinaria de traducción en la “ruta” de toxicidad de Kid. Los precedentes de esta línea de estudio y los resultados que indican que existe efectivamente una conexión funcional entre las actividades de Kid y RF1, se resumen en esta sección.
Durante la búsqueda de la diana de acción de la toxina Kid, en nuestro laboratorio se intentaron buscar mutantes cromosómicos de E. coli que fueran resistentes a su actividad citotóxica. Para ello, el Dr. Marc Lemonnier utilizó una selección doble de mutantes basado en el trabajo de Bernard y Couturier (Bernard y Couturier, 1992). En dicho trabajo se aislaron mutaciones en el gen gyrA que codifica para la subunidad A de la girasa, que es a su vez la diana bacteriana de la toxina CcdB del sistema toxina-antitoxina ccd del plásmido F.
Para la búsqueda de mutantes cromosómicos resistentes a Kid, se emplearon dos plásmidos, pKK1120 y pAB1120. Estos plásmidos confieren resistencia a tetraciclina y kanamicina, respectivamente. Ambos plásmidos contienen el operón parD (kis-kid) con la mutación kis74 (codón UAG, ámbar) en la antitoxina y el gen kid silvestre (Tabla 3). En ausencia de supresión se sintetiza una antitoxina truncada e inactiva y, por lo tanto, se produce una inhibición de la formación de colonias mediada por Kid. En consecuencia, células que sobreviven a esta inhibición podrían contener, entre otras, mutaciones en posibles dianas cromosómicas de la toxina. En aquel momento no se había determinado que Kid poseía actividad ARNasa, por lo que la posibilidad de aislar mutantes cromosómicos resistentes a Kid no era descartable. En una primera ronda de selección, se trataron las células de E. coli (MC1061) con el mutágeno 2-aminopurina, y se transformaron con el plásmido pKK1120 aislando supervivientes a la acción de la toxina en presencia de tetraciclina, marcador de selección del recombinante. Para aumentar el número de resistentes potenciales a Kid, se llevó a cabo una segunda ronda de selección, al transformar un cultivo de las células supervivientes con el plásmido pAB1120 y seleccionar de nuevo resistentes a la toxina en presencia de kanamicina, marcador de resistencia de dicho plásmido. Para descartar posibles mutaciones que afectaran al gen kid o a sus elementos reguladores presentes en el plásmido, se ensayó la toxicidad de los plásmidos residentes (pKK1120 o pAB1120) extrayendo el ADN plasmídico y retransformando a nuevas células de E. coli silvestres. Los mutantes que exhibieron crecimiento en presencia de un plásmido tóxico fueron caracterizados.
Las mutaciones fueron mapeadas en una región del cromosoma de E. coli situada entre los minutos 22 y 32, usando una colección de diferentes cepas Hfr-Tn10. Para afinar la
Resultados
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localización genética de las mutaciones, las cepas mutantes fueron usadas como receptoras en experimentos de transducción con P1, usando diferentes cepas donantes que llevaban inserciones del transposon Tn10 a intervalos regulares en el cromosoma entre los minutos 22 y 32. Para uno de los mutantes se observó que el fenotipo de resistencia al plásmido pAB1120 se perdía con una alta frecuencia en transductantes resistentes a tetraciclina, obtenidos utilizando un lisado de P1 crecido en células con el transposon Tn10 (Tet) en la posición 26,61 minutos. Para aislar el gen mutante, se generaron fragmentos del cromosoma de la cepa mutante (de aquí en adelante KR19) por digestión con la enzima de restricción Sau3A. Estos fragmentos se clonaron en un plásmido mini-F de de bajo número de copias, pMLM1 (Lemonnier y col., 2000). Se transformaron células de E. coli con esta librería y se volvieron a transformar con el plásmido pAB1120. Los plásmidos mini-F que llevaban fragmentos que conferían resistencia a pAB1120, fueron aislados y sus insertos cromosómicos fueron secuenciados. Tras la secuenciación se comprobó que todos los fragmentos contenían una región cromosómica que incluía el gen
prfA, que codifica el factor de terminación de la traducción RF1. Este gen se localiza en el
cromosoma de E. coli a los 27,2 minutos, lo que es consistente con los resultados del mapeo con las cepas Hfr.
Posteriormente, se procedió a secuenciar la región de prfA de los mutantes aislados y en todos los casos se detectaron mutaciones en el gen prfA. Se eligieron 4 mutantes independientes para continuar su evaluación: KR2, KR4, KR17 y KR19. El análisis de las secuencias reveló que las mutaciones consistieron en transiciones G-C o A-T, esperables por el tratamiento mutagénico con 2-aminopurina (Ronen, 1980). Se encontró que las cepas KR2 y KR19 contenían la misma mutación, prfA301, que producía el cambio del aminoácido glicina a serina en la posición 301 del RF1. La cepa KR4 llevaba la mutación prfA303, en la que el aminoácido arginina en la posición 303 se sustituía por serina. Para finalizar, la cepa KR17 contenía la mutación prfA121, que substituía la glicina en la posición 121 de RF1 por serina. Estos mutantes fueron el punto de partida para los resultados obtenidos durante la realización del trabajo experimental de esta tesis y que se presentan en este capítulo.
2.2 Los mutantes prfA sólo pueden complementar una mutación prfA(ts) si están
sobreexpresados.
Se intentó analizar si los mutantes prfA aislados estaban afectados en su actividad terminadora de la traducción in vivo. Para ello, se llevó a cabo un ensayo de complementación usando un mutante de E. coli termosensible, MRA8 prfA1(ts) (Ryden y Isaksson, 1984, Zhang y col., 1994). Esta cepa, que permite estudiar la complementación de la mutación analizando la recuperación del crecimiento a 42 ºC, fue transformada con los plásmidos derivados de pBAD18, pELI01, pELI02, pELI03 y pELI04, que contenían las diferentes variantes del gen prfA (prfA121, prfA silvestre, prfA301 y prfA303, respectivamente). La expresión de dichos genes se encontraba bajo control del promotor Para, inducible por arabinosa (Guzman y col., 1995).