113MRA8 también fue transformada con el plásmido pBAD18 como control.
2.4 Las mutaciones en prfA reducen la actividad de terminación específica de RF1 en los
codones UAG.
Los resultados anteriores sugirieron que las cepas mutantes prfA, KR4, KR17 y KR19, poseían deficiencias en la actividad de terminación de la traducción en codones de terminación UAG. El grupo del Prof. Richard Buckingham del Instituto Pasteur (IBQF) de París, llevó a cabo, en colaboración, estudios sobre la actividad de terminación de la traducción de los distintos mutantes prfA en codones de terminación UAG, con diferentes secuencias adyacentes a los mismos.
Para evaluar las deficiencias en la terminación de la traducción, se recurrió a un sistema descrito por Curran y Yarus (Curran y Yarus, 1989) que, posteriormente, fue desarrollado por Poole y colaboradores para producir un ensayo preciso de terminación (Poole y col., 1995). Dicho sistema se basa en la competición que existe entre la terminación de la traducción y el cambio del marco de lectura ribosómico consecuencia de la presencia de un sitio de cambio de marco de lectura en el gen prfB de E. coli, que codifica el factor de terminación RF2. En este sitio, existe un codón de terminación UGA dentro del marco de lectura del ARN mensajero. En este caso, es posible que continúe la traducción evitando el codón de terminación, ya que se podría producir un cambio del marco de lectura ribosómico, +1, que es estimulado por la presencia de una secuencia Shine-Dalgarno que precede en 6 nucleótidos al codón de terminación. En el ensayo, se utiliza un plásmido que contiene dicho sistema, en donde la ventana de cambio del marco de lectura está fusionada al final del gen malE (Figura 29A). Cuando se produce la terminación de la traducción se origina una proteína de 43,9 kDa, mientras que el cambio del marco de lectura da lugar a una proteína de 52,0 kDa, al fusionarse con la traducción del gen
lacZ (Figura 29A). Estas proteínas se separan por SDS-PAGE y se detectan por Western blot,
mediante la unión de un anticuerpo anti-MalE y su posterior interacción con la proteína A marcada con 125I. Las proteínas producidas se detectan mediante autorradiografía. El porcentaje
entre el producto resultante de la terminación de la traducción y el producto del cambio del marco de lectura, puede cuantificarse y es una medida de la eficiencia de la terminación en diferentes señales de terminación o en diferentes cepas.
Se comprobó la actividad de las cepas mutantes prfA en los codones de terminación de la traducción UAG en dos contextos: UAGA y UAGU. Ambos contextos son más desfavorables que la señal más común de terminación de la traducción UAG, UAGG. Los ensayos de Western
blot se muestran en la figura 29B, mientras que las constantes relativas entre la terminación y
el cambio de marco de lectura se muestran en la tabla 7. La sobreproducción de las proteínas de fusión en las cepas prfA mutantes dio lugar a una inhibición del crecimiento por razones desconocidas, lo que explicaría la menor cantidad de proteínas de fusión encontrada en dichas cepas; se produjo un efecto inhibitorio mayor con la fusión que contenía la secuencia UAGA. Los valores de eficiencia de terminación encontrados en la cepa silvestre, MC1061, fueron similares a los anteriormente descritos por Poole y colaboradores (Poole y col., 1995), pero
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inferiores a los encontrados por Mora y colaboradores en otras cepas de E. coli K12 (Mora y col., 2007). Hay que tener en cuenta que MC1061 es una cepa dependiente de estreptomicina, crecida en presencia de este antibiótico, lo que podría influenciar los parámetros cinéticos de la traducción y de su terminación. En la tabla 7 (líneas 1-2) se muestra que los valores de terminación de las tres cepas mutantes en las señales UAGA y UAGU, están reducidos un orden de magnitud aproximadamente respecto a la cepa silvestre.
MC1061 KR4
UAGA UAGU UAGA UAGU UAGA UAGU UAGA UAGU KR17 KR19
frameshift terminación
UAGA UAGU UAGA UAGU UAGA UAGU UAGA UAGU
MC1061 KR4 KR17 KR19
A
B
3 6 3 6 3 6 3 6 3 6 3 6 3 6 3 6
C
Producto de terminación 43.9 kDa Proteína de unión a maltosa
malE TAG AT lacZa
Proteína de unión a maltosa Producto frameshift 52 kDa
Figura 29.- Eficiencia y niveles del RF1 en las cepas mutantes en prfA in vivo. La terminación de la traducción se midió por su competición con el cambio de marco de lectura en el sitio presente en el gen prfB de E. coli (Poole y col., 1995). A) Se fusionó al gen malE, presente en un plásmido bajo control del promotor Ptac, una región de 23 nucleótidos del gen prfB alrededor del sitio de cambio del marco de lectura. El cambio del marco de lectura (+1) del ribosoma parado en la señal de terminación que se encuentra en fase, permite que la traducción continúe en una secuencia derivada del gen lacZ. La señal de 4 nucleótidos silvestre TGAC, fue reemplazada por las secuencias TAGA o TAGU. B) La producción de las proteínas de fusión derivadas de MalE fue inducida con IPTG durante 2 horas in vivo en la cepa parental MC1061 y en las mutantes KR4, KR17 y KR19. Las proteínas producto de la terminación o del cambio de lectura presentes en 3 ó 6 µl del extracto celular se separaron en SDS-PAGE y se visualizaron
por Western blot con anticuerpos anti-MalE y proteína A marcada con 125I. C) Se determinaron las
cantidades de RF1 en la cepa silvestre y en las mutantes mediante la cuantificación de los Western blot
Resultados
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Tabla 7.-Eficiencia de terminación en codones UAG y cantidades de RF1 en las cepas prfA mutantes. Los datos se obtuvieron por cuantificación de los Western blot iguales a los mostrados en la figura 20. La eficiencia de terminación en las señales de parada UAGA y UAGU se expresa relativa al cambio de marco de lectura +1 de la ventana de cambio de marco derivada del factor RF2. La cantidad de RF1 en las cepas mutantes fue determinada mediante autorradiografía utilizando anticuerpos anti-RF1 y proteína A radiactiva, y expresada como porcentaje de la obtenida en la cepa silvestre MC1061.
MC1061 KR4 KR17 KR19
Mutación RF1 - R303H G121S G301S
Eficiencia de terminación en UAGA 1,30 0,18 0,15 0,14
Eficiencia de terminación en UAGU 1,42 0,16 0,06 0,12
Cantidad relativa de RF1 100 80 85 85
Existen dos mecanismos que podrían explicar estos resultados. Por una parte, las mutaciones podrían estar afectando a la estabilidad del RF1, lo que daría lugar a una fuerte reducción de la cantidad de RF1 en la célula. Por otra parte, la actividad de la proteína podría estar reducida en comparación al RF1 silvestre. Para resolver esta cuestión, se comparó la cantidad de RF1 presente en las cepas prfA mutantes con la presente en la cepa silvestre mediante ensayos de Western blot, usando anticuerpos anti-RF1.
Los resultados mostraron que la reducción de la cantidad de RF1 en las cepas mutantes fue bastante modesta (15-20 %) (Tabla 6), valor que es insuficiente para explicar el descenso en un orden de magnitud en la eficiencia de terminación en las cepas mutantes; en consecuencia, la mayor parte de este descenso se debería a una reducción de la actividad de estos factores.
El reducido descenso de la cantidad de RF1 encontrado en las cepas mutantes sugiere que dichas cepas no están especialmente afectadas en su estabilidad respecto a la proteína silvestre. Esta conclusión, sin embargo, sería inválida si existiera un mecanismo de autocontrol de los niveles de RF1 en las células, es decir, que una menor actividad del factor de terminación diera lugar a un aumento de la síntesis del RF1. Este tipo de autocontrol existe en el caso del RF2 de
E. coli en alrededor del 70 % de los microorganismos cuyo genoma está secuenciado (Baranov
y col., 2002). Dicho sistema de autocontrol se basa en la competición entre la terminación y el cambio de marco de lectura, que ha sido usado previamente para cuantificar la eficiencia de terminación.
El gen prfA se expresa desde el promotor del gen localizado anteriormente, hemA. Se ha sugerido con anterioridad que E. coli y Samonella sp. podrían poseer un mecanismo de autocontrol para la síntesis de RF1 que sería dependiente de la lectura a través de la señal de terminación débil de 4 nucleótidos UAGC del gen hemA, acoplado a la existencia de un lugar de unión del ribosoma sub-óptimo para la expresión de prfA (Elliott, 1989). La hipótesis sugiere que la síntesis del RF1 dependería en gran medida de los ribosomas que leen a través de la señal de terminación de la traducción del gen hemA, y, por lo tanto, traducen la región
Resultados
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intergénica, finalizando la traducción justo antes del codón de iniciación de prfA. De este modo, el proceso de traducción de RF1 comienza sin disociarse el ribosoma del ARN mensajero.
Para comprobar esta hipótesis, se construyeron fusiones traduccionals con lacZ desde la región promotora de hemA hasta el codón 13 del gen prfA, que eran análogas a las descritas por Dahlgren y Ryden-Aulin (Dahlgren y Ryden-Aulin, 2004). Se estudiaron los efectos en la síntesis de β-galactosidasa de la señal de terminación de hemA en presencia de el factor RF1 silvestre o introduciendo las mutaciones en el RF1. Los resultados mostraron que incluso con las mutaciones de RF1 descritas anteriormente, se sintetiza poca cantidad de RF1 debido a este mecanismo en E. coli (L. Mora, datos no publicados).
De este modo, los niveles de RF1 detectados reflejan fundamentalmente un efecto de las mutaciones aisladas en la actividad de RF1 y no en la estabilidad o regulación de los niveles de esta proteína.
2.5 Las mutaciones en el gen prfA confieren hipersensibilidad a las toxinas Kid y RelE.