Ensayo de movilidad electroforética (EMSA)

Este es un método rápido, simple y extremadamente sensible para la detección de la unión de proteínas a secuencias específicas de DNA. Permite detectar la afinidad, cantidad y especificidad de la unión entre la proteína y el DNA. La proteína unida a su

Solución de bloqueo

Blocking reagent (Roche) 1 g Tween 20 (Panreac) 100 μl PBS 1× Hasta 100 ml PBS 10× NaCl (Panreac) 80 g KCl (Panreac) 2 g Na2HPO4.7H20 (Panreac) 26,8 g KH2PO4 (Merck) 2,4 g Agua MQ Hasta 1 L Ajustar el pH a 7,4 con HCl Autoclavar Tampón 3 NaCl (Panreac) 11,68 g MgCl2.6 H20 (Merck) 20 g Tris-HCl (Sigma) 1,6 g

Tris base (Sigma) 23,16 g Agua MQ Hasta 2 L Ajustar el pH a 9,5 con NaOH

secuencia de reconocimiento presenta mayor peso molecular que el fragmento de DNA al que no se une la proteína, desplazándose a través de un gel de poliacrilamida más lentamente, el unido, y visualizándose como una banda de retraso con respecto al no unido. Incluye diversas fases; preparación de los fragmentos de DNA marcados, preparación del gel de poliacrilamida (PAGE), preparación de la mezcla de la proteína con el DNA marcado, electroforesis y, finalmente, la transferencia y el revelado.

i) Marcaje de los fragmentos de DNA

Mediante PCR con los oligonucleótidos adecuados (Tabla 7) se procedió a la amplificación de las regiones promotoras (aproximadamente de la posición -200 a la +50 con respecto al inicio de la traducción de los genes a estudiar), utilizando uno de los oligonucleótidos marcados en su extremo 5’ con digoxigenina. El DNA se amplificó por PCR y se clonó en el vector pGEM-T. La presencia del promotor deseado se confirmó mediante la secuenciación del fragmento clonado en el plásmido, utilizando sus oligonucleótidos (Tabla 2), procediéndose posteriormente a su amplificación por PCR con los oligonucleótidos del vector, uno de ellos marcado con digoxigenina en su extremo 5’. En los casos en los que se pretendía estudiar el efecto de la sustitución de nucleótidos en las secuencias reguladoras, se diseñaron oligonucleótidos que incluyeron los nucleótidos deseados.

Tabla 7. Oligonucleótidos utilizados para la clonación de promotores

Oligonucleótido Secuencia Aplicación

AdcR50.2rv 5’- GTTCTACCTTATTTGTTCGTC

Oligonucleótido directo para la clonación del promotor del gen ssuiDRAFT 1240 (adcR) de S.

suis y de su fragmento B1

1240.50 5’- ATCTCGTGCAGGTACTTC

Oligonucleótido reverso para la clonación del promotor del gen ssuiDRAFT 1240 (adcR) de S.

suis y de su fragmento B2

AdcR50.1 5’- TTAACTTGTTAAGTATACCAC

Oligonucleótido reverso para la clonación del fragmento B1 del promotor del gen ssuiDRAFT

1240 (adcR) de S. suis

AdcR50.1rv 5’- TTAAAAGGTTAAGGGGATGC

Oligonucleótido directo para la clonación del fragmento B2 del promotor del gen ssuiDRAFT

1240 (adcR) de S. suis

AdcRBOXmut 5’- TTCTATGTGGTATACCCGACAAG

Oligonucleótido reverso para la clonación del fragmento B1 mutado del promotor del gen

ssuiDRAFT 1240 (adcR) de S. suis

AdcRmutWTa _{5’-TTCTATGTGGTATACTTAACAAGTTAA}

Oligonucleótido directo para la clonación del fragmento B2 del promotor del gen ssuiDRAFT

1240 (adcR) de S. suis

103.50 5’- CGAGCAAGCTGCTAAAAC

Oligonucleótido reverso para la clonación del promotor del gen ssuiDRAFT 0103 de S. suis

174.pr 5’- TTTGGATTGCGATGGCAC

Oligonucleótido directo para la clonación del promotor del gen ssuiDRAFT 0174 de S. suis

174.50 5’- TAAGAAAACCAGCCCAAC

Oligonucleótido reverso para la clonación del promotor del gen ssuiDRAFT 0174 de S. suis 1352.pr _{5’- ACTGACAAACAGACTGGC} Oligonucleótido directo para la clonación del _{promotor del gen ssu1352 de S. suis}

1352.50 5’- TAGCGCTCGATTAACTCC

Oligonucleótido reverso para la clonación del promotor del gen ssu1352 de S. suis

1390.pr 5’- GCGTTTGTCGTGGAATGG

Oligonucleótido directo para la clonación del promotor del gen ssu1390 de S. suis

1390.50 5’- CAAGATAGGATAATGCCT

Oligonucleótido reverso para la clonación del promotor del gen ssu1390 de S. suis

fur.pr 5’- GAACGGTTACTGGCTGAC

Oligonucleótido directo para la clonación del promotor del gen fur de S. suis

fur.50 5’- GATAATGTAGGCAACGAC Oligonucleótido reverso para la clonación del promotor del gen fur de S. suis

173.pr 5’- CATACGGTCCTTGTTCAC

Oligonucleótido directo para la clonación del promotor del gen ssuiDRAFT 0173 de S. suis

173.50 5’- GTCCATCTAGATAGATAG

Oligonucleótido reverso para la clonación del promotor del gen ssuiDRAFT 0173 de S. suis

1637.pr 5’- TCCTCTCTAGGTGTTAGC

Oligonucleótido directo para la clonación del promotor del gen feoA de S. suis

1637.50 5’- TATCATCTTGCGTTAGGC

Oligonucleótido reverso para la clonación del promotor del gen feoA de S. suis

1195.pr 5’- CCAAGTCCTAGACAGTTG

Oligonucleótido directo para la clonación del promotor del gen ssu0309 de S. suis

1195.50 5’- TCATCCCTAAAACAAGGG

Oligonucleótido reverso para la clonación del promotor del gen ssu0309 de S. suis y RT-PCR

1606.pr 5’- AAGTAGCTCACTACTTGC

Oligonucleótido directo para la clonación del promotor del gen ssu1103 de S. suis 1606.50 5’- TAACCAATGCTACAGCAC Oligonucleótido reverso para la clonación del promotor del gen ssu1103 de S. suis

a_{Oligonucleótidos AdcRmut1-AdcRmut14 (no mostrados) derivan del AdcRmutWT pero con el cambio} de nucleótido deseado (ver Figura 29).

ii) Reacción de unión DNA-proteína

Las mezclas de reacción de unión de la proteína o el extracto crudo al fragmento de DNA se realizaron a temperatura ambiente durante 10 min con los tampones utilizados por Bsat y Helmann (1999), con algunas modificaciones.

En el momento de su uso, a 399,5 μl de tampón de unión 5×, se añadieron 100 μl de BSA (10 mg resuspendidos en 1 ml de tampón de unión 5×; Sigma) y 0,5 μl de DTT (0,5 M; Roche). Cuando fue necesario, el tampón de unión 5× se suplementó con EDTA (concentración final 1 mM; Sigma) en presencia o ausencia de Zn2SO4 o Fe2SO4 (Merck

y Panreac, respectivamente; ambos a una concentración final de 1 mM).

iii) Electroforesis (PAGE)

Para los ensayos EMSA, se realizaron electroforesis de una dimension en minigeles no desnaturalizantes de poliacrilamida al 5%. La electroforesis se realizó utilizando el Hoefer MINIVE Complete (Vertical electroforesis system), la fuente de electroforesis

Tampón de unión 5×

Tris-HCl 1,6 g

KCl (Panreac) 1,85 g

Glicerol 25 ml

Agua MQ Hasta 100 ml Ajustar el pH a 7,5 con NaOH

Conservar a 4ºC

Mezcla de la reacción de unión

Tampón de union 5× 4 μl

DNA marcado con DIG (50 ng/ μl) 0,5 μl

DNA inespecífico* 2 μl

Proteína (1 μg/ μl) o extracto crudo 0/10 μl

Agua MQ Hasta 20 μl

G-201 (GAOC); y los vidrios, los espaciadores (de 1,5 × 105 mm) y los peines de Amersham.

La mezcla se añadió hasta cubrir el soporte de vidrio en su totalidad, colocando el peine en su parte superior y dejándolo polimerizar durante 30 min. Se realizó un prerun de 30 min a 90V antes de cargar las muestras. La electroforesis se llevó a cabo con tampón de electroforesis (40 mM Tris-acetato) durante 90 min a 150 V.

iv) Transferencia y revelado

Para poder llevar a cabo la detección de los fragmentos de DNA marcadas con digoxigenina, el gel de electroforesis se transfirió a una membrana de nylon cargada positivamente (Biodyne®B Membrana, 0,45 μm; PALL Gelman). Para ello, tras la electroforesis, se retiró uno de los vidrios del gel de electroforesis poniéndose en contacto el gel con la membrana de nylon. A continuación se colocaron encima 3 filtros 3 MM y el vidrio, con peso encima, durante 30 min. Seguidamente, el DNA se fijó a la membrana mediante el equipo UV Stratalinker 2400 (Stratagene) ya que la radiación ultravioleta consigue que se entrecrucen las moléculas de ácido nucleico con las fibras de nylon de la membrana y de esta forma queden fijadas a la misma. Tras 30 min en agitación lenta con solución de bloqueo, la membrana se sumergió durante 30 min más en 20 ml de la misma solución, a la que se añadieron 4 μl de Antidigoxigenina-AP Fab

Fragment (Roche). Este anticuerpo, conjugado con fosfatasa alcalina, se une

específicamente a la digoxigenina del DNA marcado. Gracias a la fosfatasa alcalina se

PAGE 5%