Mecanismos de exportación de zinc y su regulación

Los microorganismos han desarrollado también mecanismos de expulsión de zinc hacia el exterior celular con la finalidad de evitar el acúmulo de altas concentraciones de este metal en el citoplasma, previniendo así sus posibles efectos tóxicos. La bacteria gramnegativa Ralstonia metallidurans, anteriormente conocida como Alcaligenes

eutrophus y actualmente renombrada Wautersia metallidurans (Vaneechoutte et al.,

2004), es un microorganismo aislado de los tanques de decantación de una industria dedicada al zinc, cuya CMI (Concentración Mínima Inhibitoria) para el Zn2+ es de 12 mM (Hantke, 2001), mucho mayor que la concentración de zinc necesaria para inhibir completamente el crecimiento de E. coli: 0,35 mM (Lee et al., 2005). W. metallidurans puede ser considerada como el paradigma de la regulación de la homeostasis de los metales en las bacterias ya que, como se verá a continuación, presenta mecanismos de

resistencia a metales pertenecientes a las tres familias más importantes de transportadores implicados en la exportación de metales.

i) Transportadores RND implicados en la exportación de zinc

W. metallidurans presenta el cluster de genes czcNICBADRS, localizado en el plásmido

pMOL30 de 238 kb (Dressler et al., 1991; Mergeay et al., 1985). Este cluster de genes se transcribe formando cinco unidades transcripcionales (czcN, czcI, czcCBA, czcDRS y

czcE), que codifican dos sistemas para la exportación de Zn2+, Co2+ y Cd2+ (CzcCB2A,

un sistema de transporte de tipo RND; y CzcD, un transportador CDF), además de las proteínas reguladoras de este sistema (Anton et al., 1999; Grosse et al., 1999; Grosse et

al., 2004).

Los productos de los genes czcA, czcB y czcC forman el complejo CzcCB2A, un

transportador RND, siendo CzcA el antipuerto catión-protón localizado en la membrana citoplasmática (permite la salida de un catión a la vez que penetra un protón); CzcB, la proteína periplásmica conectora; y CzcC, la proteína situada en la membrana externa (Nies, 1995; Rensing et al., 1997b).

La regulación de la resistencia a estos metales en W. metallidurans es un proceso

complejo (Fig. 12). Tanto la concentración citoplasmática como la periplásmica de estos cationes sirven como señales para la regulación del operón czc. Czc es el sistema más importante de defensa de W. metallidurans contra los metales pesados (Legatzki et al., 2003a) y su control requiere la regulación por parte de las proteínas que se codifican junto a los transportadores. Dos posibles reguladores del sistema czc (CzcN y CzcI), están codificados en la región upstream de czcCBA, mientras que tres de ellos se encuentran en la región downstream de este operón (CzcR, CzcS y el CzcE). CzcN y CzcI podrían regular la actividad de un hipotético factor sigma (un iniciador de la transcripción), mientras que los dos reguladores CzcR (regulador de la respuesta) y CzcS (sensor histidina quinasa), regulan la expresión de CzcN (Grosse et al., 1999). Así, CzcR, que se une al promotor czcN, pero no a ningún otro promotor czc, se activa por la fosforilación llevada a cabo por la histidina quinasa de membrana CzcS, cuya autofosforilación ya ha sido demostrada (Nies y Brown, 1998; Grosse et al., 2004). La proteína CzcE, anteriormente denominada ORF131 (van der Lelie et al., 1997), ha sido

identificada como una proteína periplásmica de unión a metales. Su función es reprimir indirectamente el promotor czcN (pczcN) mediante la inhibición de la fosforilación de CzcS cuando la concentración de cationes en el periplasma es baja. Este hecho indica que la concentración periplásmica de metales pesados está relacionada con el control del promotor de czcN.

El efecto de CzcE en el mencionado promotor podría llevarse a cabo vía CzcS y CzcR. Así, la regulación de la homeostasis de metales mediante este sistema vendría determinada por la cadena de transducción CzcEÆCzcSÆCzcRÆpczcN, que podría

detectar la concentración de cationes periplásmicos para una óptima expresión del complejo CzcCB2A (Grosse et al., 2004), por lo que a bajas concentraciones de metales

el sistema estaría reprimido por la acción de CzcE. En cambio, a altas concentraciones, CzcR activaría la transcripción de los genes czcNI y éstos a su vez la de los que codifican los transportadores implicados en la exportación de cationes divalentes.

Fig. 12. Representación esquemática del operón czc de W. metallidurans y su sistema

de regulación. Véase la explicación en el texto. Los símbolos representan posibles terminadores transcripcionales.

ii) Transportadores CDF implicados en la exportación de zinc

La proteína CzcD, también presente en W. metallidurans, está codificada por uno de los genes del cluster czcNICBARDS (czcD), es miembro de la familia CDF y es uno de los sistemas de este microorganismo que se encarga del transporte de Zn2+, Co2+ y Cd2+ a través de la membrana citoplasmática (Anton et al., 1999). Estudios recientes han puesto de manifiesto que el regulador Zur es capaz de actuar como un activador positivo de la transcripción del gen homólogo czcD de Xanthomonas campestris mediante el reconocimiento de una secuencia de más de 50 nucleótidos rica en G-C (Huang et al., 2008).

El análisis del genoma completamente secuenciado de W. metallidurans revela la presencia de dos genes que codifican CDFs. En contraste con el transportador CzcD, estos dos genes no están localizados en un plásmido, sino en el cromosoma. El primero de ellos dmeF (divalent efflux metal) participa principalmente en la detoxificación de Fe2+ aunque también interviene en la resistencia contra Zn2+, Co2+, Cd2+ y Ni2+; y el segundo, llamado fieF (ferrous iron efflux), muestra el mismo rango de sustratos, aunque con diferentes preferencias (Munkelt et al., 2004).

Otro miembro de la familia de transportadores CDF es la proteína ZntA, identificada en la bacteria grampositiva S. aureus (no confundir con la ATPasa de tipo P de mismo nombre de E. coli). La proteína ZntA de S. aureus presenta un 38% de identidad con la proteína CzcD de Wautersia eutropha (Xiong y Jayaswal, 1998). Un mutante zntA es sensible a una concentración de zinc de sólo 0,5 mM, siendo la cepa salvaje resistente a una concentración de zinc 10 veces superior (Hantke, 2001).

Otra proteína de esta familia es ZitB de E. coli, anteriormente conocida como YbgR, la cual pertenece a la familia de los facilitadores de la difusión de cationes que transporta Zn2+ hacia el exterior citoplasmático y cuya expresión está específicamente inducida por este catión (Grass et al., 2001).

iii) ATPasas de tipo P implicadas en la exportación de zinc

La ATPasa de tipo P responsable del transporte de Zn2+ y de Cd2+ en E. coli se conoce como ZntA (Zinc tolerance) (Beard et al., 1997; Rensing et al., 1997a). La identificación de este transportador se llevó a cabo gracias al estudio realizado con mutantes espontáneos que presentaban mayor sensibilidad a diferentes metales que la cepa salvaje. Así, la cepa portadora de una mutación en el gen zntA mostraba una clara sensibilidad a la presencia de Zn2+ en el medio, que se suprimía cuando la mutación se complementaba en trans (Beard et al., 1997). También se observó una mayor sensibilidad de este mutante a otros cationes divalentes (Cd2+, Co2+, Pb2+ y Ni2+), aunque en menor grado que la observada para el zinc (Beard et al., 1997). La regulación del gen zntA la realiza la proteína ZntR, que permite su transcripción cuando la concentración de Zn2+ _{o de Cd}2+ _{llega a 100 µM y a 19 µM, respectivamente (Noll y}

Lutsenko, 2000). En presencia de estos metales, la proteína ZntR se convierte en un regulador transcripcional que cambia la conformación de la región promotora del gen

zntA, convirtiéndolo en un mejor sustrato para la RNA polimerasa (Outten et al., 1999).

ZntR es un regulador similar a MerR, que interviene en el sistema de detoxificación de Hg2+ (Brocklehurst et al., 1999).

Los genes cadA y cadC determinan la resistencia al Cd2+ y al Zn2+ en S. aureus y se encuentran en el operón cadCA del plásmido pI258 (Nucifora et al., 1989). CadA es una ATPasa de tipo P (Tsai et al., 1992), mientras que CadC es importante para la resistencia de S. aureus a los mencionados metales. En realidad CadC es una proteína represora dimérica, miembro de la familia de proteínas metaloreguladoras ArsR/SmtB (Busenlehner et al., 2003; Xu y Rosen, 1999). La desrepresión implica la disociación de CadC del promotor cad, después de un cambio de conformación de la proteína provocado por la unión de Cd2+ o Zn2+ en cada uno de sus monómeros (Endo y Silver, 1995; Sun et al., 2001). Este sistema de transporte (CadA/C), también ha sido encontrado en la bacteria gramnegativa Stenotrophomonas maltophila, presentando un 96% de identidad con respecto a la secuencia del sistema homólogo de S. aureus. Este alto grado de identidad entre las secuencias de estas proteínas, indica una reciente transferencia horizontal entre una bacteria grampositiva y una gramnegativa (Alonso et

Ambas ATPasas de tipo P (ZntA y CadA), también se hallan presentes en W.

metallidurans (Legatzki et al., 2003b).