Ensayo de protección con DNasaI (footprinting)

Esta técnica permite detectar la región del DNA a la que se une una determinada proteína, basándose en la protección que esta interacción confiere al fragmento de DNA. De esta manera se impide la acción de la DNasaI, enzima que corta inespecíficamente el DNA, en la región del DNA a la que se une la proteína (Galas et al., 1978).

El fragmento de DNA que se estudia se marca por uno de sus extremos con un fluorocromo (Cy5), de manera que la digestión con la DNasaI resulta en diferentes cortes a lo largo de todo el fragmento. Asimismo, si hay una región protegida, no habrá fragmentos de un tamaño determinado, correspondiente a la zona protegida. En un gel vertical, este hecho se visualiza como una región sin bandas. Los ensayos de protección ante la acción de la DNasaI se llevaron a cabo utilizando el ALFexpressTM _DNA

Sequencer (Amersham Pharmacia Biotech).

Mediante PCR se amplificó el fragmento de 100 a 400 pb y se clonó en el vector pGEM-T. La presencia de la secuencia deseada se confirmó mediante secuenciación. Posteriormente se procedió a su amplificación por PCR con los oligonucleótidos del vector (Tabla 2), uno de ellos marcado con Cy5 en su extremo 5’. El estudio se llevó a cabo sobre las dos cadenas del DNA, la codificante y la no codificante, por tanto, se amplificaron dos fragmentos, cada uno de ellos con un extremo marcado con el fluorocromo Cy5. La reacción de unión se realizó en un volumen final de 20 μl con 100 ng de DNA marcado con Cy5.

Tampón de unión 5× para footprinting

Tris 1 M 250 μl MgCl2 0,5 M 500 μl Cacl2 0,1 M 250 μl Glicerol 1,25 ml KCl 2,5 M 1 ml Agua MQ Hasta 5 ml

En el momento de su uso, al tampón de unión 5× para footprinting se le añadió BSA y DTT a concentraciones finales de 0,4 mg/ml y 2 mM, respectivamente. La mezcla se incubó durante 10 min a temperatura ambiente, posteriormente se añadieron 2 μl de una dilución 1/1.000 de DNAsaI (10.000 unidades/ μl; Roche) que se incubó a 30ºC durante 3 min. A continuación, se añadieron 380 μl de agua MQ e inmediatamente se trató con 450 μl de una solución de fenol-cloroformo-isoamílico, se centrifugó durante 3 min y al sobrenadante se le añadió 450 μl de cloroformo isoamílico. Después de centrifugar 3 min, al sobrenadante se le añadió 1 ml de etanol absoluto y 40 μl de acetato sódico 3 M a pH 8 para precipitar el DNA durante toda la noche a -20ºC. Finalmente el DNA se resuspendió en 2 μl de agua MQ y se le añadió 4 μl de solución STOP (que evita la formación de estructuras secundarias entre los fragmentos de DNA), cargándose todo en el gel de poliacrilamida.

Las reacciones de footprinting, con y sin proteína, y las 4 reacciones para la secuenciación del fragmento de DNA de estudio, clonado en el vector pGEM-T, se cargaron en un gel de poliacrilamida vertical en el secuenciador ALFexpressTM _DNA

Sequencer siguiendo las instrucciones del fabricante. La lectura de los fragmentos de

diferente tamaño de DNA se realizó gracias al láser del secuenciador que excita las bandas fluorescentes, y las señales son recogidas mediante los fotodetectores, digitalizadas y procesadas por el programa ALFwin proporcionado por el fabricante. Comparando los fluorogramas obtenidos de las muestras con proteína y sin proteína, se puede detectar la ausencia de fragmentos de restricción en la región del DNA protegida por la unión proteica. Para conocer la secuencia protegida es necesario identificarla mediante la secuenciación del fragmento clonado en el pGEM-T (Fig. 21).

Solución STOP

Azul dextrano 2000 (Pharmacia Biotech) 50 mg Formamida (Roche) Hasta 10 ml Conservar a -20ºC

Fig. 21. Gel de poliacrilamida vertical para la secuenciación/footprinting. Los cuatro

primeros carriles representan la secuencia del fragmento. El carril (-) presenta el fragmento digerido con DNasaI sin proteína. El carril (+) presenta el fragmento digerido con DNasaI, obsérvese la zona (delimitada por dos líneas paralelas) en la que no hay fragmentos de DNA debido a la protección conferida por la proteína. Para establecer la secuencia de unión de la proteína es necesario recurrir a los cuatro primeros carriles.

El método de secuenciación empleado en este trabajo ha sido el método didesoxi o de Sanger utilizando un oligonucleótido marcado con el fluorocromo Cy5 y con secuencia complementaria al vector empleado para clonar los insertos de DNA (pGEM-T; Tabla 2). Se emplearon los desoxinucleósidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) y los didesoxinucleósidos trifosfato (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP). Para la secuenciación de cada una de las muestras, se realizaron cuatro reacciones que incluyeron los cuatro dNTPs y un ddNTPS diferente en cada una de las 4 reacciones. Los didesoxinucleótidos están modificados ya que se elimina el grupo hidroxilo en la posición 3’ de la desoxiribosa. Estos nucleótidos pueden incorporarse a la cadena de DNA naciente, pero no es posible que se una a ellos ningún otro nucleótido por el extremo 3’. Por tanto, una vez incorporado un didesoxinucleótido se termina la síntesis de la cadena de DNA. De esta manera se consiguen moléculas de DNA de distinto tamaño para cada reacción, obteniendo así una representación de todos los nucleótidos de la secuencia. Cargando

las reacciones en un gel de poliacrilamida se detectan los fragmentos marcados con Cy5 mediante láser, obteniéndose así la secuencia completa.

Los vectores con el fragmento de DNA se secuenciaron usando el fmol DNA cycle

sequencing system kit (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. En primer

lugar, se añadieron 2 μl de d/ddNTPs en el tubo correspondiente para cada nucleótido. Se realizó la mezcla con 5 μl de tampón, 1,5 μl de oligonucleótido marcado con Cy5, de 500 ng a 1 μg de DNA plasmídico con el inserto a secuenciar, 1 μl de Taq y hasta 16 μl de agua MQ. A continuación se repartieron 4 μl de la mezcla en cada tubo con los d/ddNTPs y se colocaron en el termociclador. Las reacciones de amplificación se realizaron en las siguientes condiciones: 95ºC, 30 segundos; 42ºC, 30 segundos y 72ºC, 1 minuto. Este ciclo se repitió 30 veces y posteriormente se procedió a la detención de las reacciones añadiendo 3 μl de solución de STOP. Las muestras se procesaron en el equipo ALFexpressTM _{DNA Sequencer.}