Representación de los genes estudiados

Fact

or de expr

esi

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n

Por otra parte y en relación a determinadas proteínas ribosomales, se ha propuesto que su expresión podría estar regulada por el zinc (Panina et al., 2003). Esta hipótesis se basa en que las copias originales de estas proteínas contienen motivos de unión al zinc (C-X2-C-Xn-C-X2-C), mientras que estos motivos no se encuentran en sus parálogas

(copias de los genes originales que surgieron durante la evolución a partir de duplicaciones). Se piensa que el motivo de unión al zinc juega un importante papel en la estabilidad de los ribosomas sometidos a altas temperaturas en las bacterias termofílicas y en las Archaea, mientras que es prescindible bajo condiciones normales (Makarova et

al., 2001). Por todo lo anterior, se ha sugerido que en condiciones de carencia de zinc, la

inducción de los genes ribosomales parálogos permitiría la incorporación de sus productos en los ribosomas en lugar de las proteínas originales. Así, éstas últimas serían degradadas con la consiguiente liberación de zinc al citoplasma. El metal liberado durante este proceso sería utilizado por las enzimas esenciales que lo necesitan, como por ejemplo las DNA polimerasas (Panina et al., 2003). Por el contrario, en un ambiente rico en zinc, los genes parálogos estarían reprimidos por sus respectivos reguladores, mientras que los productos de los genes originales se expresarían formando parte de los ribosomas utilizando todo el zinc disponible para impedir su acumulación, ya que como se ha visto anteriormente, un exceso de este metal resulta tóxico para la célula. Esta hipótesis cobra mayor fuerza en vista de los resultados obtenidos en el mutante UA5000 (AdcR-) ya que el gen ssu1352, que codifica la proteína ribosomal S14, presenta una caja AdcR funcional en su promotor (Fig. 30). Además, este gen se expresa más de 80 veces en la cepa cuyo gen adcR se encuentra delecionado que en la cepa salvaje (Fig. 36), por lo que en la cepa salvaje se encuentra reprimido por el regulador AdcR. En concordancia con la hipótesis expuesta anteriormente, al analizar la secuencia aminoacídica de esta proteína se observó que no contiene ningún motivo de unión al zinc (C-X2-C-Xn-C-X2-C). La búsqueda de otros genes que codifican proteínas

ribosomales S14 en el genoma de la cepa P1/7 de S. suis, mostró que el gen ssu1352 podría ser un gen parálogo, copia del gen original (ssu0083), que sí que conserva el dominio de unión al zinc (Fig. 37).

Fig. 37. Secuencias aminoacídicas de las dos proteínas ribosomales S14 Ssu0083 y

Ssu1352 de la cepa P1/7 de S. suis. El motivo de unión al zinc se encuentra subrayado en la primera de ellas (C-X2-C-Xn-C-X2-C), mientras que la segunda carece de él.

Como se comentó en la introducción de este trabajo, el zinc es un importante componente de muchas proteínas, incluyendo DNA polimerasas, proteasas y proteínas ribosomales y, los estreptococos, como el resto de bacterias, requieren mecanismos efectivos para la adquisición de zinc. En B. subtilis el transportador de zinc ZosA se encuentra regulado por la proteína PerR (Gaballa y Helmann, 2002). En E. coli y en B.

subtilis, la transcripción de algunos transportadores de zinc se encuentra regulada por

Zur (Patzer y Hantke, 2000). Sin embargo, el grupo de los estreptococos no presenta el regulador Zur, en su lugar se ha propuesto a la proteína AdcR, un represor de la familia MarR (Loo et al., 2003). Así, en este grupo de microorganismos, la proteína AdcR actuaría de forma similar a la proteína Zur, actuando como un regulador global de la respuesta de zinc. Los datos obtenidos en este trabajo confirman esta hipótesis y también dan validez a los estudios realizados mediante métodos bioinformáticos, que predecían que la proteína AdcR controla la expresión de sistemas implicados en el transporte de zinc, de proteínas relacionadas con los procesos invasivos y de proteínas ribosomales parálogas (Panina et al., 2003).

MAKKSMIAKNKRPAKFSTQAYTRCEKCGRPHSVYRKFKLCRVCFRDLAYLGQIPGVTKASW Ssu0083

4.3. El regulador Fur en S. suis

4.3.1. Determinación de genes regulados por la proteína Fur

La proteína Fur de E. coli es relativamente pequeña (17 kDa) con 148 aminoácidos y es la responsable de llevar a cabo la regulación de los sistemas implicados en la captación de hierro, así como de un diverso número de mecanismos celulares (Hantke, 1981; Hantke, 1982; Touati, 1988; Stojiljkovic et al., 1994; Escolar et al., 1999). Con el objetivo de estudiar el gen fur de S. suis se realizó la búsqueda de dicho gen en la base de datos del genoma de este patógeno observándose que su producto presenta características similares a la proteína Fur de E. coli (17 kDa y 151 aminoácidos), aunque la identidad entre ambas proteínas es sólo de un 31%.

Los sitios a los que se une el complejo Fur-Fe2+, denominados cajas Fur, se encuentran presentes en los promotores de los genes regulados por esta proteína y, aunque son similares en muchas especies bacterianas, pueden presentar una cierta variabilidad (Fuangthong y Helmann, 2003). Las cajas Fur se hallan normalmente entre las posiciones -35 y -10 presentando unas 20 pb, más o menos conservadas, que constituyen un palíndrome degenerado rico en A-T. Por estas razones, y al contrario de lo que ocurre con la proteína AdcR, es muy difícil identificar cajas Fur en S. suis mediante análisis bioinformáticos.

Como se comentó anteriormente, los genes fur, feoA y feoB, todos ellos relacionados con el transporte de hierro, se inducen en presencia de DPD (Fig. 24), por lo que deben estar regulados por cationes divalentes. Así, el propio gen fur junto con el operón

feoAB, implicado en la captación de hierro, son susceptibles de encontrarse bajo el

control de la proteína Fur. Además, la región promotora de sus genes, si bien no posee ninguna caja definida como en el caso del gen adcR, presentan regiones ricas en A-T (Fig. 38) como ocurre con los promotores de los genes regulados por esta proteína.

Fig. 38. Regiones promotoras del gen fur (Pfur) y del operón feoAB (PfeoAB). Se

indican las posiciones de los nucleótidos con respecto al inicio de la traducción (+1).

Para comprobar la implicación de la proteína Fur en la regulación de genes relacionados con el transporte de hierro en S. suis, se procedió a la sobreexpresión de la proteína Fur de S. suis en la cepa de E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL llevándose a cabo ensayos EMSA con el extracto crudo de la cepa de E. coli que sobreexpresaba la proteína Fur de

S. suis, usando las regiones promotoras de los genes fur y ssuiDRAFT 1637 (feoA) de S. suis 89/1591 (Fig. 39). Los EMSAs realizados se llevaron a cabo con extracto crudo de

la cepa que sobreexpresaba la proteína Fur y no con la proteína purificada debido a que ésta, una vez purificada, no se encontraba en su forma activa debido, probablemente, a la interacción con la resina utilizada para su purificación.

Pfur