VIII DISCUSIÓN
1. Evaluación de una nueva vacuna frente al RHDVb en gazapos
El RHDVb es un agente patógeno que afecta a conejos menores de 2 meses con elevadas tasas de mortalidad y morbilidad (OIE, 2016). La importancia del virus radica en su afinidad por los animales jóvenes, que son el reemplazo poblacional esencial en el medio ambiente, así como la reposición en las explotaciones cunícolas. Además de afectar a los gazapos, este nuevo virus es capaz de infectar a conejos adultos vacunados frente a la variante clásica de la enfermedad, debido a la ausencia de protección cruzada entre ambos virus. Este fenómeno no es extraño, sino que resultaba predecible. Los estudios de protección cruzada entre calicivirus han sido un elemento constante en la investigación desde hace décadas. Tradicionalmente, los estudios se han centrado en tratar de demostrar de forma reiterada la existencia de inmunidad cruzada entre el RHDV y el EBHSV, tanto a través de ensayos vacunales en conejos y liebres, como mediante infecciones experimentales en ambas especies (Laurent, 1997). No obstante, la existencia de protección cruzada entre ambos virus no se ha demostrado (Chasey, 1992; Lavazza, 2015) y hoy en día se consideran agentes etiológicos independientes. Los calicivirus no patógenos del conejo, sin embargo, han demostrado su eficacia en la protección frente al RHDV (Capucci, 1998). Sin embargo, el título de anticuerpos existente no siempre es protector frente al virus (Marchandeau, 2005, lo que ha conducido a la elaboración de diferentes hipótesis. La distancia filogenética entre ambos virus (Le Gall-Reculé, 2003) y las diferencias genéticas entre ellos (Strive, 2009), son características que afectan directamente a la inmunidad y que se postulan como clave en la ausencia de protección cruzada. Otros aspectos, como la incapacidad del RCV para evitar la infección por el RHDV (Strive, 2010) o la declinación de anticuerpos dependiente del tiempo post-exposición (Henning, 2005b) también han sido estudiados como posibles causas de la ausencia de protección en estos casos. La aparición del RCV-A1 en Australia constituye un paso más en la comprensión de la inmunidad cruzada entre calicivirus. En este caso, se ha observado que la circulación del virus no patógeno está relacionada con una menor incidencia de RHDV, debido a la producción de una respuesta inmune eficaz que persiste hasta 8 semanas post-exposición (Liu, 2014).
Las diferencias entre aislados virales, en cuanto a producción de inmunidad, se han observado tanto entre calicivirus no patógenos, como patógenos. Existen estudios que demuestran la menor eficacia de las vacunas frente al RHDV cuando se aplican en infecciones con RHDVa (Capucci, 1998; Schirrmeier, 1999; Matiz, 2006;), al igual que la ausencia de
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protección cruzada entre RHDV y RHDVb (Abrantes, 2013; Le Gall-Reculé, 2013; Peacock, 2017). Estas observaciones sugieren que las diferencias de tipo genético y antigénico entre las diferentes variantes del virus, son el elemento determinante en el desarrollo de una inmunidad efectiva, sin poder descartarse por ello la interferencia de otros factores. Por estos motivos, resulta interesante la evaluación de la inmunidad producida frente a diferentes aislados virales que, a pesar de inducir cuadros clínicos de curso similar, pueden ser portadores de diferencias antigénicas.
En este estudio, se evaluó la respuesta inmune elaborada en animales vacunados y no vacunados, enfrentados experimentalmente a 4 aislados del RHDVb obtenidos a partir de diferentes brotes ocurridos en España en 2014. Debido a la especial afinidad que presenta este virus hacia los animales jóvenes, los animales seleccionados para este estudio fueron gazapos, especialmente susceptibles a la infección. La vacunación en gazapos muestra una serie de inconvenientes relacionados con su desarrollo inmunológico, fundamentalmente la presencia de inmunidad maternal hasta la edad de 25-28 días y la inmadurez de su sistema inmunitario, que se encuentra en fase de desarrollo durante los primeros meses de vida (Cooke, 2000). En segundo lugar, es necesario tener en cuenta que cualquier procedimiento que implique manejo de animales que se encuentran en el nido, puede causar estrés tanto a las crías como a la madre, por lo que la manipulación debe realizarse de forma calmada y durante el menor tiempo posible. En el caso de gazapos ya destetados, el estrés derivado del manejo también existe, de modo que las actuaciones clínicas deben llevarse a cabo con cautela para evitar las posibles consecuencias derivadas de una situación de estrés sostenido. Los animales incluídos en este estudio, tenían 28 días de edad, por lo que las posibilidades de producirse un bloqueo inmunológico derivado de la presencia de anticuerpos maternales (Tizard, 2009) era mínimo.
La vacuna testada durante este estudio es una vacuna monovalente frente al RHDVb, de primera generación, es decir elaborada a partir de tejido hepático procedente de animales experimentalmente infectados. En esta vacuna el virus se halla inactivado, por lo que las posibilidades de reversión a un estado virulento deberían ser nulas, si el procedimiento se ha llevado a cabo de forma correcta. El adyuvante que incorpora es AlOH, un compuesto de uso común en la elaboración de vacunas. Este producto, no obstante, es responsable de la aparición de reacciones adversas de tipo local como las que se observaron durante el estudio, es decir, la aparición en el punto de inoculación de un nódulo subcutáneo. Este nódulo apareció en todos los animales, a pesar de la correcta aplicación de la vacuna, que se inyectó tras haberla atemperado y homogeneizado, y utilizando en todo caso material estéril. Este
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efecto adverso, no obstante, se considera de poca relevancia clínica debido a sus características. Se trata de un nódulo subcutáneo, no encapsulado, de aspecto caseoso y friable, cuyo estudio microscópico no revela la presencia de células y cuyo cultivo es estéril. Se ha determinado que este tipo de formaciones asociadas a la vacunación se eliminan de los tejidos en el plazo aproximado de un mes, por lo que su presencia una vez que los animales llegan a matadero sería residual. En este caso, a pesar de que la duración del estudio no permitió observar la desaparición total del nódulo, se pudo apreciar una disminución de su tamaño y del eritema cutáneo asociado, en la mayor parte de los animales. La infección tuvo lugar el día 7 post-vacunación, ya que las indicaciones del fabricante garantizan la producción de una respuesta inmune eficaz en 7 días.
Puesto que el período experimental tuvo lugar en instalaciones NCB349, la aparición de enfermedad a partir de este momento estaría presumiblemente relacionada con la acción del virus. La realización del estudio en condiciones de bioseguridad 3 presenta múltiples ventajas. En primer lugar, se reducen al máximo las posibilidades de contaminación, garantizando la fiabilidad de los resultados al evitar la interacción de agentes externos sobre los animales. Asimismo, se minimiza el riesgo de diseminación del virus al medio ambiente, lo que resulta especialmente importante en estudios como éste, en los que un agente de gran virulencia está implicado.
Además de realizar el estudio con la bioseguridad necesaria, se controló el adecuado estado de los animales en su entorno. El mantenimiento de unas condiciones ambientales apropiadas para los animales, expuestos a rangos de humedad y temperatura estables y a un número de horas de luz constante, son aspectos que mejoran el bienestar de los animales. Desde este punto de vista, se elaboraron protocolos para el mantenimiento de los animales en las condiciones más apropiadas a su edad y tamaño. Se alojaron en grupos de 4 a 6 animales, en jaulas adaptadas a la legislación vigente, y habilitadas de manera que todos tuvieran acceso permanente a un lugar de refugio, agua, heno y pienso. El manejo se llevó a cabo por profesionales especializados y en todo momento se evitaron las situaciones que pudieran generar estrés (ruido, manejo excesivo, movimiento de las jaulas, cambios de personal). Los animales estaban monitorizados por cámaras de forma permanente, y el personal accedía a las instalaciones dos veces al día para comprobar su estado general, el estado higiénico de las jaulas, comederos y bebederos, y para realizar los ajustes pertinentes. Los procedimientos
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clínicos se llevaron a cabo por personal veterinario, manteniendo las pautas de mínimo manejo y reducción de estrés. La monitorización de los animales durante los 7 días post- infección, se realizó a días alternos con el objetivo de disminuir en lo posible el manejo de los animales. Durante esta etapa, se prestó especial atención a la aparición de signos inespecíficos de enfermedad, tales como fiebre, apatía o diarrea, además de comprobar el estado de salud general y tomar medidas de peso de los animales. La evaluación del punto de inyección vacunal se realizó de forma consistente. En el período post-infección, los animales se monitorizaron a diario, a pesar de suponer un mayor manejo, debido a la rapidez con que cursa la enfermedad. Durante esta etapa, además de los signos inespecíficos, se observaron otros comportamientos en los animales que sugerían un estado sanitario alterado, tales como anorexia, erizamiento del pelo, temblores, apatía y ataxia. La observación de temperaturas superiores a 40ºC fue un hallazgo común durante este período. La presencia de signos sugestivos de la enfermedad (postración, fiebre, erizamiento) o la aparición de signos neurológicos (ataxia, vocalizaciones) o que disminuyeran la calidad de vida de los animales, se consideraron motivo de eutanasia humanitaria. No obstante, la presentación más frecuente de la enfermedad produjo como desenlace la muerte súbita de los animales, indicando la elevada virulencia que presentaban los aislados. Los hallazgos de necropsia que se consideraron de especial relevancia clínica, fueron la presencia de hepatomegalia, patrón lobulillar marcado y esplenomegalia (Dalton, 2012; Duarte, 2015), puesto que son signos específicos de infección por el virus. Otros signos como ascitis, edema pulmonar o congestión vascular generalizada, también se tuvieron en cuenta y se observaron en numerosas ocasiones en los animales afectados.
La eficacia vacunal se dedujo de forma presuntiva, mediante las tasas de supervivencia de los animales al desafío, y se determinó mediante el cálculo de la Fracción Prevenible (Tizard, 2009), cuyos resultados ofrecen datos sobre la efectividad de la vacuna. Se considera que resultados iguales o superiores a 0,8 muestran la eficacia de la vacuna frente al patógeno en estudio, y garantizan la idoneidad de la misma para su uso generalizado. En este estudio, la vacunación frente a 2 aislados virales de RHDVb obtuvo valores de FP de 0,86 mientras que frente a los 2 aislados restantes obtuvo FP=1. Las diferencias obtenidas en los valores de FP pueden deberse a varios factores. En primer lugar, es importante considerar la posible influencia de los factores individuales, como el estado inmunitario de los animales o su tamaño, entre otros. En este caso, las observaciones clínicas no mostraron alteraciones en el estado sanitario de los animales durante el estudio. En cuanto al peso de los animales, que se
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midió durante todo el período experimental a días alternos, no se observaron diferencias en el peso en el momento de la vacunación ni en la GMD50 de los distintos grupos, que se puedan relacionar con los diferentes resultados obtenidos para los aislados 1-4 y 2-3. Por otro lado, además de considerar la influencia de los factores individuales sobre la respuesta vacunal, es necesario tener en cuenta las posibles diferencias entre los aislados. Desde este punto de vista, el menor valor de FP obtenido para los aislados 1-4 podría indicar, bien que la vacuna no presenta características antigénicas idóneas frente a dichos aislados, o bien que la patogenicidad de los mismos es superior a la que presentan los aislados 2-3, observación que justificaría la mayor profusión de signos clínicos observada en los aislados 1-4. Tanto la presencia de diferencias antigénicas entre cepas como las diferencias en la patogenicidad de los aislados han sido descritas en los calicivirus y, en concreto, en el RHDVb se han detectado incrementos en la virulencia desde el momento de su descripción (Capucci, 2017). El estudio genético de estos aislados podría determinar si presentan diferencias que puedan justificar los diferentes resultados obtenidos.
La evaluación global de la vacuna muestra varias características que la hacen adecuada para su uso clínico. En primer lugar, es importante destacar la eficacia vacunal, que se ha demostrado mediante este ensayo clínico, y que es el objetivo fundamental de esta investigación. A pesar de las posibles diferencias existentes entre los 4 aislados virales incluídos, la vacuna confiere niveles de protección adecuados frente a todos ellos. En todos los casos, los valores de FP son superiores al mínimo establecido para la utilización de la vacuna en animales, por lo que se puede afirmar que resulta eficaz frente al virus. En segundo lugar, es necesario destacar la ausencia de efectos adversos relevantes tras la aplicación de esta vacuna en gazapos. El incremento de temperatura post-vacunal fue, en todos los casos, inferior a 1ºC y se estabilizó antes de 48 horas. Este incremento de temperatura no presenta relevancia clínica y no interfiere de ninguna manera la actividad normal de los animales, por lo que se puede considerar un efecto adverso poco relevante. En cuanto al efecto directo derivado del adyuvante vacunal, ampliamente descrito en la literatura (Munks, 2010), no provoca daños en el animal y se elimina antes de la llegada de la canal al consumidor, por lo que tampoco se considera un efecto adverso relevante.
En conclusión, la evaluación de esta vacuna frente al RHDVb ha demostrado que resulta eficaz tanto desde el punto de vista inmunológico, como de su bioseguridad. No
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obstante, es recomendable la realización de estudios complementarios sobre la respuesta inmune que produce, la posibilidad de transmisión vertical, así como la duración de la inmunidad y el efecto de la revacunación, con el objetivo de establecer un calendario vacunal adaptado al producto. Este estudio garantiza la posibilidad de inmunizar animales recién destetados y carentes de inmunidad maternal, en la etapa vital en que muestran mayor susceptibilidad al RHDVb. La vacunación a edades tan tempranas como los 25-28 días, permite reducir la ventana de desprotección existente entre el declive de los anticuerpos maternales y la primovacunación, incrementando las posibilidades de éxito en la lucha contra el RHDVb.