Niveles de anticuerpos específicos frente al RHDVb

Los resultados medios obtenidos en el ensayo de IHA para cada grupo se representan en la Fig.18. El título basal medio oscila entre 1/16 y 1/32, mientras que el título al final del período experimental sobrepasa 1/64 en los 3 grupos.

El grupo vacunal desarrolló un incremento progresivo en la producción de anticuerpos, alcanzando 1/128 once días tras la vacunación. Este valor se mantuvo estable hasta el final del período experimental. El grupo desafío mostró un incremento de 1/16 a 1/64 durante las 48 horas post-vacunación y disminuyó ligeramente sus niveles a partir de ese momento, hasta el día 7. Tras la infección, los niveles de anticuerpos alcanzaron 1/64 durante las primeras 96 horas y alcanzaron valores cercanos a 1/128 al final del período experimental. El grupo control mantuvo niveles estables de anticuerpos que oscilaban alrededor de 1/32 hasta el día 7 y alcanzó 1/128 durante las primeras 96 horas tras la infección.

137 Figura 18. La gráfica representa el título medio de anticuerpos de los 3 grupos, en Unidades Hemaglutinantes (UH),

durante el período experimental

5. Discusión

En este estudio se llevó a cabo una infección experimental con RHDVb en conejos recién destetados. La infección se demostró in situ, mediante la realización de la necropsia, así como de forma laboratorial, utilizando un método ELISA-DAS. Los animales pertenecientes al grupo vacunal mostraron signos inespecíficos de necropsia, mientras que los animales pertenecientes al grupo desafío mostraron signos sugestivos de infección por el virus. El grupo control, cuyos animales murieron antes del fin del período experimental, mostraron lesiones severas indicativas de infección por el RHDVb, como se esperaba. Estos datos muestran que la infección tuvo lugar de forma efectiva tanto en el grupo desafío como

control. Mientras que en el primer grupo se obtuvieron valores de absorbancia cercanos al

punto de corte, el segundo obtuvo niveles más alejados, probablemente debido a la mayor carga viral existente en los individuos del grupo control. Estos datos se relacionan con los signos clínicos observados en los animales de estos grupos, así como con los hallazgos de necropsia, ambos de carácter severo en el grupo control, probablemente debido a la mayor replicación viral que tuvo lugar, respecto al grupo desafío. Con el objetivo de evaluar la respuesta inmune que se producía de forma temprana en los gazapos, se monitorizaron los

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niveles de IFNγ y el título de anticuerpos, ya que ambos se encuentran implicados en la respuesta temprana a la infección viral y el desarrollo de la enfermedad (Tisoncik, 2012; Tizard, 2009). Todos los animales mostraron títulos basales de anticuerpos entre 1/16-1/32, lo que se explicaría por la presencia de inmunidad maternal residual. Los animales pertenecientes a los grupos vacunal y desafío mostraron un incremento paralelo en el título de anticuerpos hasta el día 7, confirmando las indicaciones del fabricante, que garantiza la inmunidad en 7 días. El título en el grupo vacunal se incrementó durante las siguientes 96 horas, alcanzando niveles que permanecieron estables hasta el final del período experimental. Los animales pertenecientes al grupo desafío incrementaron sus niveles de forma más lenta y alcanzaron los mismos valores 52 horas más tarde. Es probable que la infección de los animales del grupo desafío el día 7 interfiriese con su capacidad para alcanzar los niveles máximos esperados tras la vacunación. A pesar del retraso relativo respecto al grupo vacunal, en ambos casos se alcanzaron títulos de anticuerpos protectores frente al virus. Los animales pertenecientes al grupo control mostraron los títulos basales de anticuerpos más elevados del estudio y permanecieron estables hasta el momento de infección. Durante las 96 horas post- infección, estos animales alcanzaron el mismo título que mostraban los grupos desafío y vacunal. Resulta llamativo que los animales pertenecientes al grupo control no sobrevivieran a la infección a pesar de contar con títulos protectores de anticuerpos específicos. Existen múltiples factores que contribuyen al desarrollo de la respuesta inmune, como la interferencia con anticuerpos maternales, el estrés debido al manejo o la cría, así como factores individuales, entre otros (Tizard, 2009; Gómez-Lucía, 2007; Abrantes, 2012). No obstante, la incapacidad de evitar la enfermedad, en presencia de una respuesta inmune protectora, es un elemento a investigar. Con el objetivo de obtener una imagen más amplia de la respuesta inmune durante el desarrollo de la enfermedad, se monitorizaron los niveles de IFNγ en todos los grupos. Se observó que en los grupos vacunal y desafío, los niveles de IFNγ se incrementaron ligeramente tras la vacunación, como se esperaba debido a la presencia en la misma de antígenos virales. Tras el incremento inicial, el grupo vacunal experimentó un descenso en sus niveles de IFNγ en las siguientes 172 horas, probablemente relacionado con la ausencia de exposición al antígeno. El grupo desafío incrementó la concentración de IFNγ de 1,02 ng/µL el día 7, hasta 2,9 ng/µL durante las siguientes 172 horas. Este incremento se corresponde con la estimulación del sistema inmune frente a un antígeno previamente conocido. El grupo control, cuyos niveles basales de IFNγ oscilaban en torno a 1 ng/µL, incrementó sus niveles de 1,35 ng/µL el día 7 hasta 6,7 ng/µL durante las siguientes 96 horas. Resulta esperable que la exposición natural al virus en animales no vacunados produzca un

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incremento en los niveles de IFNγ que pueda sobrepasar los obtenidos tras la vacunación. No obstante, el incremento de IFNγ en el grupo control fue mucho más rápido y agresivo que en el grupo desafío, lo que podría desencadenar graves consecuencias en los animales.

Las citoquinas, incluyendo el IFNγ, son potentes inmunomoduladores, esenciales para la inmunidad. No obstante, el efecto tóxico que pueden producir cuando se liberan de forma masiva se ha descrito ampliamente (Tizard, 2013; Schroder, 2004) y puede producir daño tisular, fiebre e incluso la muerte. Nuestros resultados sugieren que, a pesar de que los animales pertenecientes al grupo control mostraban signos clínicos indicativos de lesiones severas, el abrupto incremento en los niveles de IFNγ en un período tan corto de tiempo podría haber sido decisivo en el desenlace de la enfermedad. Se ha demostrado que incrementos bruscos de IFNγ son indicativos de mayores tasas de mortalidad en medicina humana y constituyen un signo predictivo de la severidad del proceso (Bozza, 2008; Sun, 2012; Teijaro, 2014; Liu, 2017). Por tanto, se podría inferir que los animales que sufren hipercitoquinemia son más susceptibles de desarrollar un síndrome tóxico que puede aumentar la severidad del proceso subyacente, provocando la muerte en múltiples casos. Esta observación concuerda con nuestros resultados y establece una alternativa al punto de vista tradicional sobre la patogenicidad del RHDV. La mayor parte de los estudios señalan la disfunción hepática como causa principal de muerte durante la enfermedad hemorrágica y, si bien es cierto que durante la enfermedad se puede desarrollar un fallo hepático fulminante (OIE, 2016; Abrantes, 2012), es probable que una respuesta inmune exacerbada frente al virus, en las fases iniciales de la infección, esté implicada en su letalidad, puesto que la liberación masiva de citoquinas puede resultar tan lesiva como la propia replicación viral (Aguas, 2014). A día de hoy se desconoce la causa por la que ciertos animales que muestran signos indicativos de infección, como ocurre en el grupo desafío, sobreviven sin desarrollar la enfermedad, mientras otros mueren en pocas horas mostrando síntomas severos. Asimismo, se desconoce por qué algunos animales parecen ser naturalmente resistentes a la infección. No obstante, las observaciones realizadas en infecciones por RHDV, al que los gazapos son resistentes, muestran resultados interesantes. En estos casos, se podían observar lesiones indicativas de RHDV en el hígado de los gazapos, pero no progresión de la enfermedad, a pesar de las lesiones (Ferreira, 2005). Por otro lado, se determinó la presencia de diferencias hematológicas entre animales jóvenes y adultos durante la infección, señalando que las características de la respuesta inmune están involucradas en el desarrollo de la enfermedad, como parece ocurrir en el RHDVb (Marques, 2010; Marques, 2014). Los resultados de

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nuestro estudio sugieren que la capacidad de los animales para evitar la letalidad del virus no depende exclusivamente de una adecuada producción de anticuerpos específicos, sino de la apropiada modulación de la respuesta inmune. El efecto que producen las citoquinas en el desarrollo de la enfermedad hemorrágica se desconoce casi por completo. La importancia de la susceptibilidad individual, las señales moleculares que desencadenan su liberación o su efecto a nivel global en la patogenicidad de la enfermedad son algunos de los aspectos a investigar en futuros estudios (Tisoncik, 2012; Trzeciak, 2016).

6. Conclusiones

Nuestros hallazgos preliminares señalan la implicación de la producción masiva de citoquinas en el desarrollo de un cuadro letal durante la infección por el RHDVb. Sin embargo, es preciso realizar una investigación complementaria antes de poder confirmar que una tormenta de citoquinas podría ser responsable del shock letal que el RHDVb produce en los animales.

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Capítulo 3. Análisis comparativo de los hallazgos anatomopatológicos