Fomentar la participación e implicación ciudadana

High molecular weight glutenins are important wheat traits for the bakery. For exact and fast identification of analysed genotypes, the breeding praxis requires markers. PCR reaction is suitable and distinct tool for their differentiation. We identified and verified DNA markers for differentiation of 1Dy12.3 subunit from 1Dy10 and 1Dy12 subunits. Existence of this selection marker is one of the main evidences confirming the originality of new 1Dy12.3 subunit in central domain of hexaploid wheat (Triticum aestivum L) cultivar Noe

Key words: DNA, PCR, primer, HMW-glutenin, wheat

Úvod

Základnou oblasťou využitia molekulárnych markerov je identifikácia genotypov rastlín, poznáme už celé spektrum DNA markerov pre konkrétne lokusy genómu rastlín. Genóm rastliny najdokonalejšie popisujeme a poznávame na úrovni sekvencie nukleotidov DNA, prípadne expresie bielkovín kódovaných konkrétnymi génmi. Identifikácie a vzájomné rozlišovanie genotypov rastlín je možné vykonávať vo viacerých kvalitatívnych úrovniach, od základnej úrovne morfologickej variability až po pozorovanie variability na úrovni sekvencie DNA. Vysokomoleklárne glutenínové podjednotky (HMW-GS) sú kódované alelami lokusov Glu-1, lokalizovanými na dlhých ramenách chromozómov 1 homologickej skupiny (Glu-1A, Glu- 1B, Glu-1D). Sekvencie DNA kódujúcich častí jednotlivých HMW-GS majú vyšší stupeň homológie ako nekódujúce sekvencie, najmä N- a C- terminálne časti HMW-GS, ktorých sekvencie sú veľmi konzervatívne (De Bustos et al. 2000), aj preto sa na identifikáciu HMW-GS alel využívajú sekvencie z nekódujúcich oblastí. Charakterizáciou a identifikáciou jednotlivých génov kódujúcich HMW-GS pomocou PCR sa zaoberal aj Ahmad (2000). V tejto práci popisujeme marker, primery, ohraničujúce PCR produkt, ktorým odlišujeme nedávno objavenú podjednotku HMW-GS 1Dy12.3 (NCBI, Genebank, EF472958) pochádzajúcu zo starej francúzskej odrody Noe, od doposiaľ popísaných podjednotiek 1Dy10 a 1Dy12. Presne popisujeme podmienky polymerázovej reťazovej reakcie a taktiež aj optimálne podmienky separácie amplifikovaných fragmentov.

Materiál a metódy

V práci boli použité vybrané genotypy hexaploidnej pšenice letnej formy ozimnej (Triticum aestivum L.) Všetky vzorky genotypov boli získané z kolekcie genetických zdrojov pšenice Génovej banky semenných druhov Slovenskej republiky vo Výskumnom ústave rastlinnej výroby v Piešťanoch.

PCR na odlíšenie Dy-podjednotiek vysokomolekulárnych glutenínov

Na selekciu jednotlivých Dy-podjednotiek HMW-GS na úrovni DNA sme využili produkty polymerázovej reťazovej reakcie. Templátová genomická DNA bola izolovaná z 200 mg rastlinného materiálu pomocou DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Použité boli nasledovné sekvencie primerov: R-5´-GGA CAA GGG CAA CAA GGA TA-3´ a L-5´-ATG GTA TGG GC TGT CGT AGC-3´. Zloženie reakčnej zmesi bolo: 0.5 U Platinum® Taq DNA polymeráza (Invitrogen Corp., Carlsbad, California), 2.5 µl 10x reaction buffer, 2.5 µl 50x10-3 _mol.dm-3 _MgCl

2,10 pmol z každého primeru, 0.125 µl

10x10-3 _mol.dm-3 _{dNTP, 25 ng DNA-templátu,.}

Ako zdroje templátových DNA boli použité nasledovné genotypy: a)podjednotka 1Dy12 – genotyp Chinese Spring, b)podjednotka 1Dy10 – genotyp Marquis, c)podjednotka 1Dy12.3 – genotyp Noe

Cyklus PCR pozostával z 5 minútovej iniciačnej denaturácie pri 94 °C, nasledovalo 30 cyklov s 1 minútovou denauráciou pri 94 °C, 1 minútovým annealingom primerov pri 60°C, 1 minútovej extenznej reakcie pri 72 °C, záverečná syntetická časť cyklu trvala 7 minút pri 72 °C. Produkty PCR boli analyzované pomocou 8 % akryalmidového gélu vyfarbeným pomocou ethidium bromidu.

Výsledky a diskusia

Odlíšenie Dy-podjednotiek HMW glutenínov pri Triticum aestivum L.

Porovnaním sekvencií DNA kódujúcich Dy-podjednotky HMW-GS pri Triticum aestivum L. sme navrhli hraničné úseky DNA, ktoré boli identické pre všetky podjednotky – Dy10, Dy12 a Dy12.3, avšak dĺžka fragmentov medzi týmito hraničnými úsekmi bola pre každú podjednotku rozdielna (Thompson a kol., 1985, X03041; Anderson a kol., 1989, X12929). Obr. 1 Odlíšenie Dy-podjednotiek pri Triticuum aestivum pomocou PCR, elektroforetická separácia fragmentov DNA

Zborník zo 6. vedeckej konferencie, Piešťany : CVRV, 2010

157

Separácia PCR produktov v 8 % akrylamidovom géli vyfarbovanom pomocou roztoku ethídium bromidu. Templátové DNA:

podjednotka 1Dy12 – genotyp Chinese Spring (veľkosť fragmentu 605bp)

podjednotka 1Dy10 – genotyp Marquis (veľkosť fragmentu 599bp)

podjednotka 1Dy12.3 – genotyp Noe (veľkosť fragmentu 605bp)

Po navrhnutí primerov, ktoré boli súčasťou týchto konzervatívnych úsekov, sme pomocou PCR tieto úseky amplifikovali. Predpokladané rozdiely vo veľkostiach fragmentov jednotlivých Dy-podjednotiek sa nám potvrdili, a tak sme získali veľmi praktické a využiteľné markery na genotypizáciu hexaploidnej pšenice a potvrdili sme tým tiež originalitu novej podjednotky 1Dy12.3 z kultivaru Noe.

Konkrétne sme využili fakt, že nová podjednotka má v centrálnej doméne na úrovni DNA deléciu kódujúcu dipeptid, resp. hexapeptid v porovaní s podjednotkami 1Dy12 a 1Dy10. Tým sme dosiahli jednoduchú, jednoznačnú a rýchlu identifikáciu novej podjednotky. Optimalizovali sme detekciu PCR produktov. Malou nevýhodou detekcie však je, že dané rozdiely veľkostí sme nemohli pozorovať pomocou elektroforetickej separácie DNA v prostredí agarózy, dané rozdiely však boli evidentné v 8 % akrylamidovom géli. Vzhľadom k progresu v separačných metodikách DNA, akými sú napríklad analýzy „lab on chip“(Agilent, USA), bude možné využiť tieto markery k presnej a veľmi rýchlej genotypizácii.

Záver

Identifikácia tohto selekčného markeru je jedným z dôkazov potvrdzujúcich originalitu novoobjavenej podjednotky1Dy12.3 hexaploidnej pšenice (T.aestivum L.) pri kultivare Noe. Daná práca poukazuje na dôležitosť štúdia historických materiálov génových bánk, čo je dôležité k spoznaniu diverzity genetických zdrojov a jeho využitia v šľachtiteľskom procese.

Poďakovanie: Táto práca vznikla vďaka podpore v rámci OP Výskum a vývoj pre projekt: Vývoj nových typov rastlín s geneticky upravenými znakmi hospodárskeho významu. ITMS: 26220220027, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.

Literatúra

AHMAD, M.(2000): Molecular marker-assisted selection of HMW glutenin alleles related to wheat bread quality by PCR-generated DNA markers. In: Theoretical and Applied Genetics, vol. 101, N. 5, 2000, pp.892-896.

ANDERSON, O. D. – GREENE, F.C. – YIP, R. E. – HALFORD, N. G. – SHEWRY, P. R. – MALPICA- ROMERO, J.-M.(1989): Nucleotides sequences of the two high-molecular-weight glutenin genes from D-genome of hexaploid wheat, Triticum aestivum L. cv. Cheyenne. In: Nucleic Acid Research, vol. 17, N. 1, 1989, pp. 461-462.

DE BUSTOS, A. – RUBIO, P. – JOUVE, N.(2000): Molecular characterisation of the inactive allele of the gene Glu-A1 and of a set of AS-PCR markers for HMW glutenins of wheat. In: Theoretical and Applied Genetics, vol. 100, N. 5, 2000, pp. 1085-1094.

THOMPSON, R. - FLAVELL, R. B. – TATHAM, A. S. - SHEWRY,P. R. (1992): Analysis of HMW glutenin subunits encoded by chromosome 1A of bread wheat (Triticum aestivum L.) indicates quantitative effects on grain quality. In: Theoretical and Applied Genetics, vol. 83, N. 3, 1992, pp. 373– 378.

Adresa autora:

Mgr. Daniel Mihálik, PhD., Centrum výskumu rastlinnej výroby Piešťany, Bratislavská cesta 122, 921 68 Piešťany, E-mail: [email protected]

Zborník zo 6. vedeckej konferencie, Piešťany : CVRV, 2010

158