María Carolina Renaud Romero
PALABRAS CLAVE:
5. Gobierno Abierto
Miroslava LATEČKOVÁ – Jana MORAVČÍKOVÁ – Gabriela LIBIAKOVÁ – Mária
Gabriela OSTROLUCKÁ – Alena GAJDOŠOVÁ
For successful genetic transformation and regeneration of transgenic plants the efficient regeneration in vitro is a basic assumption. From this reason, our experiments were focused on optimization of adventitious regeneration in Rubus fruticosus L. cv. `Čačanska bestrna`, Vaccinium corymbosum L. cv. `Berkeley` and Vaccinium vitis-idaea L. cvs. `Ida` and `Linnea` by evaluation of influence of different growth regulators and their concentrations on induction of adventitious organogenesis. The next step was the testing of influence of the antibiotics which are commonly used in genetic transformation, on regeneration ability of the mentioned cultivars. The best adventitious regeneration in cv. `Čačanska bestrna` was achieved on MS medium with 1 mg.l-1 TDZ and 0.05 mg.l-1 IBA
. The higher regeneration was
from petioles in comparison with leaves. In cv. `Ida` the regeneration of shoots was observed on medium with 4.4 a 5.5 mg.l-1 TDZ, while in cv. `Linnea` the best shoot regeneration was on medium with 2.2 mg.l-1 TDZ. In cv. `Berkeley` the
highest regeneration was achieved on medium supplemented with 5.5 mg.l-1 TDZ. It was found that the tested selection
antibiotics kanamycin, hygromycin and geneticin are toxic for tested cultivars in the higher concentrations and they inhibit shoot regeneration. Therefore, the lower concentrations (5 mg.l-1and less) of these antibiotics are needed.
Cefotaxime did not influence negatively the regeneration ability of the cultivars in the tested concentrations.
Key words: Rubus fruticosus L., Vaccinium corymbosum L., Vaccinium vitis-idaea L., adventívna organogenéza, antibiotiká, genetické transformácie
Úvod
Vzrastajúci dopyt po drobnom ovocí vyžaduje efektívnu produkciu kvalitného sadbového materiálu s vylepšenými agronomickými vlastnosťami. Genetické transformácie otvorili možnosti pre prenos génov kódujúcich užitočné vlastnosti a pre urýchlenie šľachtiteľského procesu pri mnohých druhoch. Transformácie sú vhodné najmä pre ovocné dreviny pre ich dlhý reprodukčný cyklus a veľmi často polyploidný genom. Avšak základnou podmienkou úspešnej genetickej transformácie a regenerácie transgénnych rastlín je účinná regenerácia in vitro. Z tohto dôvodu sme sa v pokusoch zamerali na optimalizáciu adventívnej regenerácie pri Rubus fruticosus L. odrode `Čačanska bestrna`, Vaccinium corymbosum L. odrode `Berkeley` a Vaccinium vitis-idaea L. odrodách `Ida` a `Linnea` hodnotením vplyvu rozličných typov a koncentrácií rastových regulátorov na indukciu adventívnej organogenézy. Ďalším krokom bolo testovanie vplyvu antibiotík bežne používaných pre genetickú transformáciu na regeneračnú schopnosť spomínaných odrôd.
Materiál a metódy
In vitro kultúra odrody `Čačanska bestrna` bola založená z jedno-nodálnych segmentov s dormantným púčikom na MS médiu (Murashige a Skoog, 1962) doplnenom rastovými látkami 1 mg.l-1 BAP; 0,1 mg.l-1
IBA a 0,1 mg.l-1 GA
3. Kultúry odrôd `Berkeley`, `Ida` a `Linnea` boli taktiež odvodené z jedno-nodálnych
segmentov s dormantným púčikom a kultivované na WPM (Lloyd a McCown, 1980) médiu s rastovými látkami 0,5 mg.l-1 zeatínu pri V. corymbosum a 1,5 mg.l-1 zeatínu pri V.vitis-idaea s doplnením 0,2 mg.l-1
IAA pri oboch druhoch. Kultúry boli kultivované pri 25 °C, 16/8 h fotoperióde a intenzite svetla 50 μmol.m- 2.s-1. Tieto kultúry boli zdrojom primárnych explantátov pre samotné testovanie adventívnej organogenézy
a vplyvu antibiotík na regeneračnú schopnosť.
Pre adventívnu organogenézu R. fruticosus bolo testovaných a hodnotených 19 typov regeneračného média s rozličnými typmi a koncentráciami cytokinínov a auxínov: BAP, TDZ a zeatín v koncentráciách 1, 2 a 5 mg.l-1 v kombinácii s auxínom IBA v koncentrácii 0,05; 0,02 a 0,01 mg.l-1 s pridaním alebo bez pridania
0,1 mg.l-1 GA
3. Adventívna organogenéza pri druhoch V. corymbosum a V. vitis-idaea bola testovaná na
WPM médiu so zeatínom (2,2 a 4,4 mg.l-1) a TDZ (1,1 - 5,5 mg.l-1)doplnenom auxínom IAA v koncentrácii
0,2 mg.l-1. Vplyv vybraných antibiotík na regeneračnú schopnosť druhov R. fruticosus, V. corymbosum a V.
vitis-idaea bol testovaný na médiách s rôznymi koncentráciami kanamycínu (0,5,10,15,20,25,50,75,100,150), hygromycínu (0,5,10,15,20), geneticínu (0,5,10,15,20) a cefotaxímu (0,100,200,400), ktoré sa používajú na selekciu transformovaných buniek, resp. na elimináciu Agrobacterium sp. z kultúry po transformácii.
Výsledky a diskusia
Výsledky testovania vplyvu rastových látok na adventívnu regeneráciu ukázali, že najlepšia regenerácia adventívnych výhonkov pri odrode `Čačanska bestrna` bola dosiahnutá na MS médiu s 1 mg.l-1 TDZ a 0,05
mg.l-1 IBA bez pridania GA
3. Podobné výsledky získala aj Vujovič et al. (2010). Vyššie percento regenerácie
bolo dosiahnuté pri použití listových stopiek v porovnaní s listovými diskami. Pri odrode `Ida` bola regenerácia výhonkov dosiahnutá na médiu s 4,4 a 5,5 mg.l-1 TDZ. Pri odrode `Linnea` bola regenerácia
Zborník zo 6. vedeckej konferencie, Piešťany : CVRV, 201
148
odrodách na médiu so zeatínom nekrotizovali. Pri odrode `Berkeley` bola najvyššia regenerácia dosiahnutá na médiu doplnenom s 5,5 mg.l-1 TDZ, zatiaľ čo na médiu so zeatínom bola pozorovaná len tvorba kalusu.
Pozitívny vplyv zeatínu na indukciu adventívnyh výhonkov pri Vaccinium spp. pozoroval aj Debnath (2005). Regenerácia výhonkov na médiách s kanamycínom bola dosiahnutá len pri použití nízkych koncentrácií antibiotika (5 mg.l-1 kanamycínu). Pri vyšších koncentráciách kanamycínu nebola pozorovaná žiadna
regenerácia, čo svedčí o citlivosti pletív testovaných druhov k danému antibiotiku.
Na médiu doplnenom hygromycínom v koncentrácii 1 mg.l-1 bola pozorovaná regenerácia výhonkov pri
odrode `Čačanska bestrna`. Pri odrode `Berkeley` bola pozorovaná vyššia tolerancia k uvednému antibiotiku. Najvyššia regenerácia sa vyskytla pri koncentrácii 2,5 mg.l-1 hygromycínu, avšak nízka regenerácia bola
pozorovaná aj pri koncentráciách 5 -10 mg.l-1 hygromycínu. Pri vyšších koncentráciách explantáty
nekrotizovali.
Na médiu s geneticínom v koncentrácii 2 mg.l-1 bola pozorovaná regenerácia výhonkov pri odrode
`Čačanska bestrna`. Ostatné odrody s týmto antibiotikom neboli zatiaľ testované.
Cefotaxím bol testovaný v koncentráciách 0, 100, 200 a 400 mg.l-1. Regenerácia výhonkov bola
dosiahnutá na všetkých testovaných koncentráciách a pri všetkých testovaných odrodách. Testované koncentrácie cefotaxímu neovplyvňovali negatívne regeneračnú schopnosť pletív, a preto môžu byť použité na elimináciu Agrobacterium sp. z kultúry po transformácii.
Poďakovanie: Práca bola riešená v rámci grantovej výskumnej úlohy VEGA č. 2/0004/08 a MVTS- COST 863.
Literatúra
DEBNATH, S. C. 2005. A two-step procedure for adventitious shoot regeneration from in-vitro-derived lingonberry leaves: shoot induction with TDZ and shoot elongation using zeatin. In: Hort. Science, 40, p. 189 – 192.
LLOYD, G.B. – MCCOWN, B.H. (1980): Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture. In: Proc Int Plant Prop. Soc., 30, p. 421–437.
MURASHIGE, T. – SKOOG, F. (1962): A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco cultures. Physiologia Plantarum, 15, p. 473–497.
VUJOVIĆ, T. – RUŽIĆ, D. – CEROVIĆ, R. – ŠURLAN MOMIROVIĆ G. 2010. Adventitious regeneration in blackberry (Rubus fruticosus L.) and assessment of genetic stability in regenerants. In: Plant Growth Regulation, ISSN1573-5087 (Online)
Adresa autorov:
Miroslava LATEČKOVÁ, Jana MORAVČÍKOVÁ, Gabriela LIBIAKOVÁ, Mária Gabriela OSTROLUCKÁ, Alena GAJDOŠOVÁ Ústav genetiky a biotechnológií rastlín SAV, Akademická 2, P.O. Box 39A, 950 07 Nitra 1 [email protected]
Zborník zo 6. vedeckej konferencie, Piešťany : CVRV, 201