José Ramón de Lorza González
5. Impacto en la protección de datos de carácter personal
Jiří SOCHOR
1– Ondřej ZÍTKA
2– Dušan PAVLÍK
3– Martin VALLA
3– Boris Krška
4– Aleš HORNA
5– Ivo PROVAZNÍK
3– René KIZEK
2*
Investigation of natural compounds is at the present time still more and more focused on their effect on human health. In this study, we are aimed at possibility of formulation of biological activity of promising cultivars of apricot (Prunus armeniaca L.) cultivated at experimental workplace department of Fruit growing of Mendel University in Lednice with a view to resistance against plum pox potyvirus (PPV). In addition, the best nutrition aspects (content of total polyphenols, level of antioxidant capacity) are searched. Proven biological effect of molecules with searched characteristics can regulate plat breeding as well as cultivation. This task was focused on monitoring the content of phenol compounds by using multiinstrumental approach. Apricot fruits were gathered at the beginning of their maturity, homogenized and extracted to methanol for phenolic compound determination. Antioxidant capacity was determined by photometric methods, specifically TEAC, FRAP and DPPH• test. Obtained experimental data were mathematically evaluated. Key words: apricot, resistant genotypes, phenol compounds, antioxidant capacity, TEAC, FRAP, DPPH•
Úvod
V ovoci se vyskytuje mnoho strukturně různorodých fenolických sloučenin s antioxidačními účinky1,7.
Soudobě roste o studium těchto přírodních látek zájem, jelikož jejich příjem v potravě je asociován s některými nemocemi člověka (nádorová onemocnění či kardiovaskulární choroby)9,15. V řadě
experimentálních studií byly potvrzeny antimutagenní, antikancerogenní a protizánětlivé účinky těchto sloučenin12Mnohé epidemiologické studie naznačují, že pravidelná konzumace ovoce a zeleniny může
snižovat riziko vzniku některých neurodegenerativních onemocnění8. Na celkovém příjmu polyfenolických
sloučenin se asi ze dvou třetin podílí flavonoidy a z jedné třetiny fenolické kyseliny, ostatní polyfenoly tvoří jen nepatrný podíl2. Většina těchto fenolických látek obsažených v ovoci vykazuje antioxidační aktivitu4,8.
Antioxidanty jsou žádoucí součástí lidské stravy a mnohé z těchto bioaktivních látek, včetně flavonoidů a fenylkarboxylových kyselin byly identifikovány v ovocných druzích čeledi Rosaceae 6. Bylo prokázáno, že
antioxidační aktivita kolísá v závislosti na typu fenolických sloučenin přítomných v ovoci, a že některé typy fenolických sloučenin vykazují vyšší antioxidační aktivitu než ostatní6,8. Předpokládá se, že na protektivním
účinku se podílí schopnost rostlinných polyfenolických sloučenin zhášet reaktivní kyslíkové radikály, jež jsou schopny generovat vysoce reaktivní hydroxylové radikály3. Vzhledem k chemické různorodosti
antioxidačních látek přítomných v ovoci není dosud obsah jednotlivých látek nikde k dispozici. Kromě toho úroveň jednotlivých antioxidantů v jednotlivých druzích nemusí nutně vyjadřovat celkový antioxidační potenciál9. Stanovení celkové antioxidační kapacity je jednou z možností pro vyjádření biologické a nutriční
hodnoty ovoce5.
Nutriční kvalitu ovoce pravděpodobně významným způsobem ovlivňují biotické i abiotické faktory. Virus šarky švestky patří mezi 5 nejškodlivějších rostlinných virů peckovin13. Ekonomická škodlivost viru
spočívá ve snižování tržní hodnoty produkce, choroba značně snižuje výnosy i životnost meruněk. Virus šarky švestky je možno v rostlinách jednotlivých druhů peckovin eliminovat klasickou in vivo termoterapií, termoterapií nebo chemoterapií in vitro kultur11. Dosud bylo publikováno jen několik původních sdělení
zabývajících se ozdravováním peckovin od viru šarky švestky, přičemž publikované postupy jsou rozdílné, nejednoznačné a zpravidla nereprodukovatelné10,11. Je proto žádoucí nalézt možnosti dosažení relativní
rezistence vytrvalostními pokusy na odolnost vůči tomuto viru. V tomto ohledu se snažíme o fenotypový výběr nových kultivarů s rezistencí proti šarce švestek v kombinaci s ohledem na jejich nutriční aspekty. Fenolické hodnocení může být využito v rámci relace s odolností vůči rostlinným patogenům, jako nový způsob pro výběr vhodných pěstitelsky zajímavých rezistentních odrůd meruněk.
Materiál a metody
K experimentu bylo využito dvacet genotypů meruněk (Prunus armeniaca L.) jejichž výběr souvisel s jejich rezistencí k virové šarce švestek. Rostliny byly pěstovány v katastru obce Lednice, klimatické oblasti T4. Plody byly sklizeny při konzumní zralosti v průběhu července a první poloviny srpna roku 2009, a zamraženy na -80 °C. Z jednotlivých plodů byly odebrány reprezentativní vzorky o navážce 10 g, převedeny do třecích misek, zamraženy dusíkem a při teplotě 4oC, homogenizovány s 10 ml 99 % metanolu.
Homogenizované vzorky byly kvantitativně převedeny do zkumavek a za stejných laboratorních podmínek byly ponechány 30 minut na třepačce. Následovala sonifikace a centrifugace (Eppendorf 5804R, Germany) po dobu 30 minut při 16 400 ot. / min-1. Supernatanty byly filtrovány přes teflonové membránové disky
(0,45 µm), (Metachem, Torrance, CA, USA). 500 µl z každého filtrátu bylo odpipetováno a doplněno 500 µl methanolu.
Zborník zo 6. vedeckej konferencie, Piešťany : CVRV, 2010
171
Stanovení antioxidační aktivity metodou FRAP: Pracovní roztok FRAP byl připraven smícháním 10 objemových dílů acetátového pufru (300 mM, pH 3,6) s 1 dílem roztoku TPTZ (10 mM 2,4,6- tripyridyl-S- triazin rozpuštěného ve 40 mM HCl) a s 1 dílem roztoku FeCl3 (20 mM). Absorbance byla měřena při vlnové
délce λ=593 nm.
Stanovení antioxidační aktivity ABTS testem: 54,9 mg ABTS• bylo rozpuštěno ve 20 ml fosfátového pufru
(pH 7,0; 5 mM) a aktivováno na kationt radikálu ABTS+ přidáním 1 g MnO2 za občasného míchání a doby
aktivace 30 min. Následně byl roztok naředěn fosfátovým pufrem na absorbanci (t0) 0,500 ± 0,01.
Absorbance roztoku byla měřena při vlnové délce λ=734 nm.
Stanovení antioxidační aktivity DPPH testem: Pro měření byla použita metodika Parejo a kol17. Byl
připraven metanolický roztok DPPH• o absorbanci (t
0) 0,200±0,01. Absorbance byla měřena při vlnové délce
λ=515 nm.
Spektrofotometrické stanovení antioxidační aktivity: Ve 2 ml roztoku příslušného radikálu v kyvetě (10 mm) byla u všech metod změřena absorbance na automatickém VIS spektrofotometru (BS 200, Mindray, China) v čase t0. Reagencie a vzorky byly uloženy v chlazeném karuselu při teplotě 4 °C a automaticky
pipetovány do plastikových kyvet (Mindray, China), následně byly homogenizovány s reálnými vzorky (5 μl). Změna absorbance byla snímána po dobu 21 minut v intervalu 16 sekund od smíchání činidel při výše uvedených vlnových délkách a optické dráze 5 mm, inkubace probíhala při 37 °C.
Stanovení celkových polyfenolů Folinovým-Ciocalteauovým činidlem: Vzorek (0,5 ml) byl pipetován do kyvety a naředěn 1,5 ml ACS vody. Následně bylo přidáno 0,05 ml Folinova-Ciocalteauova činidla (Sigma Aldrich, CZ). Po 30 minutách při teplotě 22 °C byla změřena absorbance na dvoupaprskovém spektrofotometru SPEKOL 2000 při vlnové délce λ=640 nm a λ=670 nm proti slepému pokusu (kyselina galová). Výsledky byly vyjádřeny jako ekvivalent kyseliny galové v mg · 100g−1.
Matematická a statistická analýza experimentálních dat byla provedena v programovém balíku MATLAB®, Verze 7.9.0.529 (R2009b).
Výsledky a diskusia
Protože je v dnešní době obsahu polyfenolů v potravinách věnována stále větší pozornost, je žádoucí zkoumat složky potravy také z tohoto hlediska. 3,8. V naší studii byl obsah fenolických sloučenin zjišťován
pomocí Folin-Ciocalteuovy metody, která je založena na oxidačně-redukční reakci, při níž se v alkalickém prostředí oxidují fenolové sloučeniny a současně se redukuje fosfowolframový-fosfomolibdenový komplex za vzniku modrého zbarvení. Vzorky byly měřeny spektrofotometricky. Stanovené hodnoty fenolických látek, které se pohybovaly od 40 do 150 mg · 100g-1 ekvivalentu kyseliny galové, poskytují informaci o
kvantitativním obsahu v jednotlivých vzorcích. Nejvyšších hodnot dosáhly hybridy LE-2527 (149 mg · 100g- 1) a LE-9299 (138 mg· 100g-1), nízké hodnoty byly zaznamenány u hybridů LE-985 (40 mg · 100g-1) a LE-
994 (43 mg · 100g-1). Většina fenolických látek obsažených v ovoci vykazuje antioxidační aktivitu5,16. Ta je
definována jako schopnost sloučeniny (směsi látek) inhibovat oxidační degradaci různých sloučenin- především volných radikálů a poskytuje informaci o délce trvání antioxidačního účinku4,16. V současné době
je používáno asi 20 metod ke stanovení antioxidační aktivity.
Vzhledem ke složení komplexu antioxidantů v daném biologickém materiálu bylo nutné vybrat soubor vhodných metod. Značná část autorů stanoví antioxidační aktivitu pouze jednou metodou. Vzhledem k zajištění objektivnosti získaných výsledků a také ve snaze o komparaci jednotlivých technik jsme aplikovali tři metody současně. Metodu využívající schopnosti antioxidantů zhášet syntetické radikály DPPH, metodu FRAP u které působením antioxidantů dochází k redukci železitého komplexu na železnatý, a metodu TEAC, založenou na hodnocení látkového množství Troloxu odpovídající aktivitě vzorku. Relativní antioxidační aktivita byla vyjádřena procentem poklesu absorbance a následně přepočítána na ekvivalentní obsah Troloxu. Stanovení každého vzorku bylo provedeno třikrát, s průměrnou relativní chybou stanovení 1,23 %. U každé metody byla sestrojena kalibrační křivka závislosti absorbance (úbytku/nárůstku) na koncentraci Troloxu.
Je známo, že látky bez elektrochemické aktivity nevykazují ani antioxidační aktivitu, naopak u látek s nízkými půlvlnovými oxidačními potenciály je antioxidační aktivita pravděpodobná11. Bylo prokázáno, že
antioxidační aktivita kolísá v závislosti na typu fenolických sloučenin přítomných v ovoci, a že některé typy fenolických sloučenin vykazují vyšší antioxidační aktivitu než ostatní5,16.
Zborník zo 6. vedeckej konferencie, Piešťany : CVRV, 2010
172
Obr. 1: Změna absorbance u spektrofotometrické analýzy antioxidační kapacity třemi různými metodami u hybridů s nejnižšími (LE-994, LE-985) a nejvyššími (LE-2527, LE-9299) hodnotami antioxidační aktivity.
DPPH• test je založen na schopnosti stabilního volného radikálu 1,1-difenyl-2 pikrylhydrazylu reagovat s
donory vodíku. DPPH• vykazuje silnou absorpci v UV-VIS spektru, při reakci s donory H je selektivnější než
ABTS•+. Při tomto testu se po redukci antioxidantem (AH) nebo radikálem (R•) roztok odbarví:
DPPH• + AH → DPPH-H + A•, DPPH• + R• → DPPH-R18. Antioxidační aktivita, měřena u studovaných
hybridů meruněk tímto testem, se po přepočtení na obsah Troloxu pohybovala v rozmezí od 0,11 do 1,64 mmol · l-1.
Metoda TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) je jednou z nejčastěji používaných metod k určení množství radikálů, které mohou být zneškodněny nějakým antioxidantem, tj. celkové antioxidační kapacity16. Je založena na neutralizaci radikálkationtu vzniklého jedno elektronovou oxidací syntetického
chromoforu ABTS• (2,2‘-azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonátu) na radikál ABTS – e- _ ABTS•+.
Sleduje se fotometricky na základě změny absorpčního spektra. Pro čisté látky je TEAC definována jako mikromolární koncentrace ekvivalentu Troloxu (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karboxylová kyselina) vykazující stejnou antioxidační aktivitu jako testovaná látka (při koncentraci 1 mmol·1-1)19,20. Námi
zkoumané genotypy meruněk vykazovaly asi čtyřikráte nižší hodnoty (0,05 – 0,45 mmol·1-1 ekvivalentu
Troloxu), než výše popsaný DPPH• test. Tato skutečnost byla pravděpodobně způsobena vychytáváním jiných volných radikálů než u DPPH• testu. Podstatný je však fakt, že mezi metodou TEAC a DPPH testem byla vysoká pozitivní korelace r = 0,964.
Hodnoty antioxidační aktivity, jež byly zjišťovány metodou FRAP − (Ferric reducing antioxidant power)3, se pohybovaly v rozmezí hodnot 0,16 – 1,3 mmol · 1-1 ekvivalentu Troloxu. Metoda je založena na
redukci železitých komplexů, např. TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazinu) s hexakyanoželezitanem draselným K3[Fe(CN)6] nebo chloridem železitým FeCl3, které jsou téměř bezbarvé (popř. slabě nahnědlé) a po redukci
se tvoří modře zbarvený železnatý komplex8. Metoda má své limity spočívající v tom, že měření probíhá při
nefyziologicky nízké hodnotě pH (3,6), nejsou zachyceny s komplexem pomalu reagující polyfenolické látky a thioly. Metoda FRAP tak odráží pouze schopnost látek redukovat iont Fe3+ a s celkovou antioxidační
aktivitou vzorku nemusí pozitivně korelovat3,8 Tento fakt potvrdil naše měření, kdy korelace ostatních metod
s metodou FRAP byly sice pozitivní, ale nízké (r = 0,378 u DPPH testu a r = 0,439 s metodou TEAC).
Záver
Byla stanovena antioxidační aktivita studovaných vzorků a to třemi různými metodami. Nejvyšší hodnoty inhibice volného radikálu byly nalezeny u hybridů LE-2527 a LE-9299, nejnižší u hybridů LE-985 a LE-994. Mezi metodou TEAC a DPPH• testem byla u všech studovaných meruněk nalezena velmi blízká korelace r = 0,964. U kultivarů byly zjištěny výrazné rozdíly (40 – 150 mg · 100mg-1) v obsahu celkových polyfenolů.
Rozdíly při srovnávání však odpovídaly hodnotám antioxidační kapacity/aktivity. Výsledky budou využity při hodnocení možných aspektů odolnosti vůči viru šarky švestky (PPV).
Zborník zo 6. vedeckej konferencie, Piešťany : CVRV, 2010
173
Poděkování: Tato práce vznikla za podpory grantu NAZV 91A032, GAČR 102/08/1546, projektu NAZV QG 60123 a Ministerstva zemědělství na podporu genových zdrojů. V rámci projektu: „Národní program konzervace a využití genových zdrojů rostlin a agro-biodiverzity“.
Literatura
ADAM, V., MIKELOVÁ, R., HUBÁLEK, J., HANUŠTIAK, P., BEKLOVÁ, M., HODEK, P., HORNA, A., TRNKOVÁ, L., STIBOROVÁ, M., ZEMAN, L., KIZEK, R. 2007. Utilizing of Square Wave Voltammetry to Detect Flavonoids in the Presence of Human Urine. Sensors; 7(10):2402-2418.
BEKLOVÁ, M., ZÍTKA, O., GAZDÍK, Z., ADAM, V., HODEK, P., STIBOROVÁ, M., HORNA, A., KIZEK, R. 2008. Electroanalytical techniques for determination of flavonoids. Toxicology Letters. 2008. sv. 180, č. 1, s. 230. ISSN 0378-4274.
PEDERSEN, C., B., J., KYLE, A., JENKINSON, MCE., GARDNER, P., T., MCPHAIL, D., B., DUTHIE G., G. 2000. Effects of blueberry and cranberry juice consumption on the plasma antioxidant capacity of healthy female volunteers, Eur. J. Clin. Nutr. 54 (2000) 405–408
GAZDÍK, Z., KRŠKA, B., ADAM, V., ŠALOUN, J., ŘEZNÍČEK, V., HORNA, A., KIZEK, R. 2008. Electrochemical determination of antioxidant potential of less common fruit species. Sensors. 2008. sv. 8, č. 11, s. 7564-7570. ISSN 1424-8220.
GAZDÍK, Z., ŘEZNÍČEK, V., ADAM, V., ZÍTKA, O., KRŠKA, B., MATUSKOVIC, J., PLŠEK, J., ŠALOUN, J., HORNA, A., KIZEK, R. 2008. Utilizing of liquid chromatography with electrochemical detection for determination of antioxidants in less common. Molecules. 2008. sv. 13, č. 11, s. 2823-2836. ISSN 1420-3049.
GILLMAN, M., W., CUPPLES L., A., GAGNON, D., POSNER, B., M., ELLISON, R., C., CASTELLI, W., P., WOLF, P., A. 1995. Protective Effect of Fruits and Vegetables on Development of Stroke in Men. JAMA 1995, 273, 1113 GUYOT, S., MARNET, N., LARABA, D., SANONER, P., DRILLEAU, J. 1998. Reversed-phase HPLC following
thiolysis for quantitative estimation and characterization of the four main classes of phenolic compounds in different tissue zones of a French cider apple variety (Malus domestica var. Kermerrien), Journal of Agricultural and Food
Chemistry 46 (1998), pp. 1698–1705.
OU, B., HUANG, D., HAMPSCH-WOODILL, M., FLANAGAN, J., A., DEEMER, E., K. 2002. Analysis of antioxidant activities of common vegetables employing oxygen radical absorbance capacity (ORAC) and ferric reducing antioxidant power (FRAP) assays: a comparative study, J. Agric. Food Chem. 2002,50, 3122
HOWELL, W., E., EASTWELL, K., C., LI, T., S., C. 2001: Heat treatment, chemo-therapy and hydroponic culture for obtaining virus-free trees of sweet cherry. Acta Horticulturae 550: 455 -457.
JANEČKOVÁ, M., 1993: Elimination of virus complex (PPV, PNRSV, PDV) from plum varieties using combination of in vivo and in vitro cultures. Vědecké ovocnářské práce 13: 51 -64 (in Czech).
JIROVSKÝ, D., 2007. Vysokoúčinné separační techniky v analýze fyziologicky významných látek, Habilitační práce, PFUP, Katedra analytické chemie, Olomouc 2007, 14
KNAPP, E., HAUZER, V., WEISS, H., DACAMARA, MACHADO, A., WEISS, B., WANG, Q., KATINGER, H., LAIMER, DACAMARA, MACHADO, M. 1995: New aspects of virus elimination in fruit trees. Acta Horticulturae 386: 409 - 418.
LA, VECCHIA, C., ALTIERI, A., TAVANI, A. 2001. Vegetables, fruit, antioxidants and cancer: a review of Italian studies, European journal of nutrition 2001, 40, 261
LONG H, ZHU Y, COURY L A, DUDA C T, KISSINGER C B, KISSINGER P T, LC/GC, Europe 2001, 14, 323 RECORD IR, DREOSTI IE & MCINERNEY JK (2001): Changes in plasma antioxidant status following consumption of
diets high or low in fruit and vegetables or following dietary supplementation with an antioxidant mixture. Br. J.
Nutr. 85, 459–464
RICE-EVANS, C., A., MILLER, N., J., PAGANGA, G. 1996. Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radic. Biol. Med. 20:933–956; 1996.
PAREJO, I., CODINA, C., PETRAKIS, C., KEFALAS, P. 2000. Evaluation of scavenging activity assessed by Co(II)/EDTA-induced luminol chemiluminescence and DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) free radical assay. J
Pharmacol Toxicol Meth. 2000;44:507-512.
MOLYNEUX, P., 2004. The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant aktivity, Songkl. J. Sci. Technol 2004, 26, 211
PAULOVA, H., BOCHORAKOVA, H., TABORSKA, E., 2004. Metody stanovení antioxidační aktivity přírodních látek in vitro, Chemické listy 2004,98, 174
KOLEVA, I., I., NIEDERLANDER, H., A., G., VAN BEEK, T., A. 2000. An on-line HPLC method for detection of radical scavenging compounds in complex mixtures, Anal. Chem. 72 (2000), pp. 2323–2328
Plná jména autorů s adresami pracovišť:
Sochor Jiří1, Zítka Ondřej2, Pavlík Dušan3, Valla Martin3, Krška Boris 4, Horna Aleš5, Provazník Ivo3, Kizek René2*
1Ústav šlechtění a množení zahradnických rostlin, ZF, Mendelu, 2Ústav chemie a biochemie, AF, Mendelu, 3Ústav biomedicínského
inženýrství, Fakulta elektrotechniky a komunikačních technologií, VUT v Brně, 4Ústav ovocnictví, ZF, Mendelu, 5Univerzita Tomáše
Bati ve Zlíně Kontaktná adresa:
prof. Dr. Ing. Boris Krška, Ústav ovocnictví, Zahradnická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Valtická 337, 691 44 Lednice, +420 519 367 241, krska@ zf.mendelu.cz
Zborník zo 6. vedeckej konferencie, Piešťany : CVRV, 2010
174