Proteómica cuantitativa basada en gel

Los primeros procedimientos desarrollados dentro de la proteómica cuantitativa estaban unidos a la separación del proteoma mediante geles 2-DE [225] y a la determinación de la cantidades proteicas mediante el uso de tintes visibles como la plata o el Coomassie o bien tintes fluorescentes como Sypro Ruby, Lava y Deep Purple.

Con el objetivo de superar algunas de las limitaciones inherentes a la metodología 2-DE (mencionadas en las secciones previas), en 1997, Ünlü y colaboradores [243] combinaron el marcaje fluorescente de las proteínas con la separación mediante geles bidimensionales, dando lugar a una nueva aproximación basada en 2-DE llamada DIGE (del inglés “Differential In Gel Electrophoresis”), consiguiendo disminuir la variabilidad de la técnica, aumentar el poder estadístico y reducir el tiempo experimental.

Características de la electroforesis diferencial (2D-DIGE)

Esta técnica basada en gel se fundamenta en el marcaje directo de las proteínas con reactivos fluorescentes, conocidos como NHS-CyDyes (NHS-Cy2, -Cy3 y -Cy5), previo a la realización del isoelectroenfoque. El protocolo original desarrollado por Ünlü y colaboradores [243] incluída únicamente el marcaje de las proteínas con los reactivos NHS-Cy3 y -Cy5, que son compuestos espectralmente distintos (con máximos de emisión a 590 y 680 nm,

respectivamente), permitiendo la detección de las señales espectrofotométricas emitas por las dos muestras objeto de estudio sin que exista solapamiento entre las mismas. Además, los reactivos Cy3 y Cy5 poseen masas moleculares muy parecidas (582.8 y 580.7 Da, respectivamente) de forma que no afectan significativamente a la separación efectroforética de las muestras marcadas.

La introducción posterior de un tercer reactivo de marcaje, llamado NHS-Cy2TM _[244] permitió el análisis simultáneo de tres muestras sobre un único gel. Aunque las propiedades espectrofotométricas de este tercer reactivo se solapan en cierta medida con Cy3, ya que posee un máximo de emisión a 530 nm, y presenta una masa molecular ligeramente distinta a los reactivos originales (550.6 Da), su inclusión dentro del protocolo de 2D-DIGE aportó numerosas ventajas, principalmente derivadas de la posibilidad de incorporar un estándar interno al análisis.

La utilización de un estándar interno, que normalmente consiste en una mezcla de cantidades idénticas de todas las muestras objeto de estudio, permitió reducir significativamente el número de geles necesarios para la correcta realización de un experimento 2D-DIGE dado, puesto que puede ser añadido en todos los geles al mismo tiempo que los pares de muestras evaluadas y marcadas con Cy3 y Cy5. En consecuencia, no solo mejora la precisión de la cuantificación relativa de los spots de proteínas a lo largo de los geles actuando como un control de carga, sino que facilita la correpondencia de los spots entre los geles, disminuyendo en parte la variación gel-a-gel inherente a un experimento mutiltigel como es el 2D-DIGE [245].

Los tres reactivos NHS-Cy3,- Cy5 y -Cy2 reaccionan con los grupos amina primarios (los grupos α-amino N-terminal y ε-animo de la lisina) de la proteína diana de la muestra a través de una reacción de sustitución nucleofílica [246]. Puesto que se trata de una estrategia basada en geles bidimensionales, es importante resaltar que el marcaje con estos reactivos no altera el punto isoeléctrico de las proteínas porque los NHS-CyDyes tienen una carga positiva que reemplaza a la carga positiva de las lisinas a pH 8.5, que es el pH en el que se produce el marcaje (Figura 13).

Figura 13. Esquema representativo del marcaje de las proteínas con los reactivos NHS-CyDyes.

Una característica importante de este proceso es que normalmente las proteínas son sometidas a marcaje “mínimo”, es decir, que menos del 5% de las especies proteicas y solamente entre el 1-2% de los residuos de lisina serán marcados [247]. Este marcaje mínimo aporta numerosas ventajas ya que consigue una excelente sensibilidad sin que se detecte ningún efecto sobre la solubilidad de las proteínas. Además, proporciona una respuesta lineal de hasta 4 órdenes de magnitud y un límite de detección de un nanogramo de proteína, que convierte a DIGE en una técnica ligeramente más sensible que la tinción con plata o con SyproRuby [246].

Otra ventaja importante del marcaje mínimo es que reduce la probabilidad de interferir con la disgetión tríptica en gel posterior, ya que deja libre muchos residuos de lisina sobre los que todavía puede actuar la tripsina, ni con la identificación de los péptidos por MS. Como efecto negativo, está el hecho de que la masa adicional que supone el NHS-CyDye puede causar que la minoría marcada (ese 5%) migre más lentamente que la mayoría no marcada, conduciendo a una separación electroforética en la segunda dimensión, que va a ser más evidente en el rango de menor masa de los geles [248].

Una vez realizado el marcaje, tal y como refleja la figura 14, cantidades equivalentes de las proteínas diferencialmente marcadas se mezclan y se somenten a la separación por 2-DE. A continuación, empleando un escáner de multilongitud de onda, se realiza el escaneado de la imagen fluorescente para generar las tres imágenes superpuestas correspondientes a cada NHS-CyDyes. Finalmente, el análisis de las imágenes obtenidas así como el análisis estadísco se puede hacer empleando el mismo software informático, como puede ser el DeCyder Differential In-gel Analysis (Amersham Biosciences), un software específicamente diseñado

para el método 2D-DIGE. Tras el análisis, las proteínas de interés se recortarán, se digerirán y se identificarán mediante espectrometría de masas [248].

Figura 14. Esquema representativo de las principales etapas del protocolo experimental 2D-DIGE.