Cuantificación del daño de adn por el test del cometa en linfocitos humanos expuestos al extracto etanólico de leucaena trichodes

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS. Y. CO. M UN IC AC IÓ. N. ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS. ÁT IC. A. “CUANTIFICACIÓN DEL DAÑO DE ADN POR EL TEST DEL COMETA. RM. EN LINFOCITOS HUMANOS EXPUESTOS AL EXTRACTO. DE. IN. FO. ETANÓLICO DE Leucaena trichodes”. BIÓLOGO. Autora: Br. Ruth Elizabeth Castillo Díaz. Asesora: Dra. Zulita Adriana Prieto Lara. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST E. M. AS. TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO DE. TRUJILLO-PERÚ 2012. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. RECTOR Dr. Orlando Velásquez Benites. CO. VICERECTORA ACADEMICA. M UN IC AC IÓ. N. QUE OTORGAN EL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. ÁT IC. A. Y. Dr. Vilma Julia Mendez Gil. RM. VICERECTORA ADMINISTRATIVA. FO. Dr. Flor Marlene Luna Victoria Mori. DE. IN. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAD BIOLÓGICAS. AS. Dr. Dr. Hermes Escalante Añorga. Dr. Cesar Augusto Jara Campos. DE. SI. ST E. M. SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. BIOLÓGICAS Dr. Segundo Eloy López Medina. DI. RE. CC. IO. N. DIRECTOR DE LA ESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIAS. ii2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Dra. Zulita Adriana Prieto Lara. RM. ÁT IC. A. Y. CO. PRESIDENTE. M UN IC AC IÓ. N. MIEMBROS DEL JURADO. FO. Dr. José Antonio Saldaña Jiménez. ST E. M. AS. DE. IN. SECRETARIO. VOCAL. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. Blgo. Danilo Gastañadui Rosas. 3 iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N. ASESOR. M UN IC AC IÓ. El que suscribe, profesor asesor de la presente tesis, declara que ésta ha sido ejecutada de conformidad con su correspondiente proyecto y con las debidas. orientaciones brindada al tesista. En cuanto al informe, este ha sido revisado y. Dra. Zulita Adriana Prieto Lara Asesor. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST E. M. AS. DE. IN. FO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. acoge las observaciones y sugerencias correspondientes.. 4. iv. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N. APROBACIÓN. M UN IC AC IÓ. Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran que la. presente tesis ha cumplido los requisitos formales y fundamentales siendo. ÁT IC. A. Y. CO. aprobada por unanimidad.. RM. Dra. Zulita Adriana Prieto Lara. M. AS. DE. IN. FO. PRESIDENTE. SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST E. Dr. José Antonio Saldaña Jiménez. Blgo. Danilo Gastañadui Rosas VOCAL. 5. v. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. M UN IC AC IÓ. N. DEDICATORIA. A Dios, por haberme permitido llegar hasta este punto y haberme dado salud para lograr mis objetivos, además de su infinita bondad y. A mis padres Miguel y Alejandrina, por su incondicional y abnegado amor, por sus consejos, sus valores, por su motivación. constante. que. me. ha. permitido ser una persona de bien.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST E. M. AS. DE. IN. FO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. amor.. 6. vi. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. A mis hermanos con amor, por su inmenso cariño, muestras de afecto y. N. darme ánimos para alcanzar esta meta. FO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. M UN IC AC IÓ. tan importante en mi carrera profesional.. amistad sincera, por su apoyo en momentos. difíciles,. porque. cada. palabra y consejo ejercieron una influencia positiva en mí; y a todos que de alguna forma colaboraron en la realización de este proyecto.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST E. M. AS. DE. IN. A mis amigos, por brindarme su. 7. vii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTO A Dios por darme las fuerzas necesarias así como también la sabiduría y. M UN IC AC IÓ. N. entendimiento para así poder desenvolverme a lo largo de mi vida. A las profesoras Dra. Zulita Prieto Lara y Dra. Fátima Zavala De La Cruz por su apoyo desinteresado, por tenerme la paciencia necesaria, sus consejos e inapreciables aportes para cumplir con los objetivos programados en el presente. Y. CO. trabajo de tesis.. ÁT IC. A. A mis padres y hermanos, que siempre me han dado su apoyo incondicional y a quienes debo este triunfo profesional, por todo su trabajo y dedicación para. FO. RM. darme una formación académica y sobre todo humanista y espiritual.. IN. En general quisiera agradecer a todas y cada una de las personas que me. DE. brindaron su apoyo y colaboraron en la realización de esta tesis y que no necesito. AS. nombrar porque tanto ellas como yo sabemos que desde lo más profundo de mi. ST E. M. corazón les agradezco su apoyo y aliento en esos momentos difíciles de trabajo,. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. gracias por su amistad y cariño.. viii 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N. PRESENTACIÓN. M UN IC AC IÓ. Señores Miembros del Jurado:. Cumpliendo con el reglamento interno de la Facultad de Ciencias Biológicas de la. CO. Universidad Nacional de Trujillo; para la obtención de grados y títulos, someto a. A. Y. vuestra consideración y elevado criterio la tesis titulada: “CUANTIFICACIÓN. ÁT IC. DEL DAÑO DE ADN POR EL TEST DEL COMETA EN LINFOCITOS. RM. HUMANOS EXPUESTOS AL EXTRACTO ETANÓLICO DE Leucaena. IN. FO. trichodes”, con la que pretendo optar el Título de Biólogo.. DE. Esperando que vuestro criterio sea de comprensión por errores u omisiones. ST E. M. AS. cometidos en la elaboración del presente trabajo, me someto a vuestro dictamen.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. Trujillo, 24 de Setiembre de 2012.. Br. Ruth Elizabeth Castillo Díaz. ix 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ÍNDICE. M UN IC AC IÓ. N. AUTORIDADES UNIVERSITARIAS…………………………………..………ii. MIEMBROS DEL JURADO………………………………………….…………iii DEL ASESOR……………………………………………………………………iv. CO. APROBACIÓN………………………………………………………………......v. Y. DEDICATORIA……………………………………………………………….....vi. ÁT IC. A. AGRADECIMIENTO………………………………………………….……….viii. RM. PRESENTACIÓN………………………………………………………….……..ix. FO. ÍNDICE………………………………………………………………...………….x. DE. IN. RESUMEN……………………………………………………………..…………xi. AS. ABSTRAT…………………………………………………………………….…xii. ST E. M. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………….....13 MATERIAL Y MÉTODOS……………………………………………………...18. DE. SI. RESULTADOS………………………………………………………………..…23. IO. N. DISCUSIÓN……………………………………………………………….…….25. CC. CONCLUSIÓN…………………………………………………………………..28. DI. RE. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS………………………………………..….29 ANEXOS…………………………………………………………………………47. 10. x. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN En el presente trabajo, se analizó el daño del ADN mediante el test del. N. cometa en linfocitos humanos expuestos al extracto etanólico de hojas de. M UN IC AC IÓ. Leucaena trichodes “chapra”. Se obtuvieron linfocitos de 5 donadores masculinos, sanos, no fumadores con un parámetro de edad entre 20 y 30 años y se cultivaron en medio RPMI incubándose a 37ºC por 24 horas. Los linfocitos se. CO. expusieron a soluciones de extracto etanólico de L. trichodes “chapra” a. Y. concentraciones de 0; 0,4%; 1,6% y 3,2% durante 30 minutos, se consideró como. ÁT IC. A. control positivo a Peróxido de Hidrógeno 100uM y control negativo Buffer. RM. Fosfato (PBS). Las muestras fueron embebidas en gel de Agarosa de Bajo Punto. FO. de Fusión y se colocaron en láminas portaobjetos previamente preparadas con una. IN. primera capa de agarosa Normal 1%, las láminas fueron expuestas en un buffer de. DE. lisis toda la noche y finalmente fueron sometidas a una electroforesis alcalina. Las. AS. células fueron coloreadas con Naranja de Acridina y se observaron en un. ST E. M. microscopio de fluorescencia con el objetivo 10X y el filtro 1. Los valores. SI. promedios del “%DNA in Tail” y “Tail Moment”, mostraron un incremento en. DE. función del aumento de la concentración del extracto etanólico de L. trichodes.. N. Valores que indican roturas en el DNA de linfocitos humanos por efecto del. CC. IO. extracto etanólico de L. trichodes.. DI. RE. PALABRAS CLAVES: Leucaena trichodes, Linfocitos humanos, Extracto etanólico, Test del Cometa, Daño del DNA.. 11 xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ABSTRAT In this study, we quantified DNA damage by the comet test in human. N. lymphocytes exposed to ethanol extract of leaves of Leucaena trichodes "Chapra".. M UN IC AC IÓ. Lymphocytes was extracted five male donors, healthy, non-smoking rooms with a. parameter of age between 20 and 30 years and grown in RPMI incubated for 24 hours, after which time the cells were separated from the medium and exposed to. CO. ethanol extract solutions Leucaena trichodes "Chapra" at concentrations of 0,. Y. 0.4%, 1.6% and 3.2% for 30 minutes, and was considered as positive control. ÁT IC. A. 100uM Hydrogen Peroxide. The samples were embedded in agarose gel and Low. RM. Melt Point slides were placed in pre-prepared with a first layer of 1% agarose. FO. Normal, the sheets were exposed in a lysis buffer overnight and subjected to. IN. electrophoresis by alkaline 30 minutes. The cells were stained with acridine. DE. orange and observing took fluorescence microscope with 10x objective and the. AS. filter 1. Parameters were analyzed in %DNA Tail Moment and Tail Moment,. ST E. M. showing that DNA damage increased with the increased concentration relative to. SI. the PBS negative control. The average values of "% DNA in Tail" and "Tail. DE. Moment" showed an increase due to the increase of the concentration of the. N. ethanolic extract of L. Trichodes. Values indicate breaks in the DNA of human. DI. RE. CC. IO. lymphocytes by effect of the ethanol extract of L. Trichodes. KEYWORDS: Leucaena trichodes, human lymphocytes, ethanol extract,. Test of Comet, DNA damage.. 12. xii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCION Las plantas medicinales constituyen una fuente de medicamento vegetal o. N. materia prima para la industria farmacéutica 1. Siendo particularmente importante. M UN IC AC IÓ. el hallazgo de nuevas moléculas biológicamente activas para bloquear la. reproducción de las células neoplásicas2 en el tratamiento del cáncer. Entre los primeros agentes anticancerígenos de uso clínico fueron los alcaloides vinblastina. CO. y vincristina aislados de Catharantus roseus, que fueron usadas por varias. Y. culturas para el tratamiento de la diabetes 3, alcaloides aislados de Podofillum. ÁT IC. A. peltatum, los taxanos aislados de Taxus brevifolia entre otros4.. RM. En los últimos años se ha generado una intensa búsqueda de nuevos. FO. agentes antitumorales provenientes de vegetales. Entre las familias de plantas. IN. utilizadas para la elaboración de remedios caseros se encuentran: Asteraceae,. DE. Lamiaceae, Solanaceae, Fabaceae, Onagraceae y Apiaceae5. En la familia. M. AS. Fabaceae, se distingue al género Leucaena que comprende árboles que fijan el. ST E. nitrógeno, nativas de las Américas y se distribuye desde el sur de Texas hasta el. alimentación. DE. madera,. SI. Perú. Entre los múltiples usos que se le dan a estos árboles, está la producción de humana,. forraje. para. ganado. vacuno,. sistemas. Dentro del género Leucaena se encuentra a la especie Leucaena. RE. CC. IO. N. agroforestales, artesanía y cercos vivos6.. DI. leucocephala, una leguminosa originaria de México, que se encuentra en los trópicos7. Esta planta tiene un potencial de uso múltiple, ampliamente utilizado como una fuente de proteína para la alimentación animal, reforestación de áreas degradadas, la mejora de las propiedades físico-químicas y biológicas del suelo,. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. estudios señalan que la cobertura del suelo con Leucaena tiene propiedades para controlar las malas hierbas y que este efecto es debido a la presencia de. N. aleloquímicos en los brotes de la planta 8.. M UN IC AC IÓ. La especie L. trichodes, conocido como “chapra”, crece de manera silvestre en las zonas tropicales entre los 390 y 750 msnm, como los valles de. Piura en el Perú9,10. Es un árbol de 3-10 m de alto, 10 a 15 (-30) cm de diámetro. CO. del tronco, con ramificaciones en posición vertical angular, lenticelas alineados. Y. horizontalmente en la madera más joven, y poco profundas de color naranja-. ÁT IC. A. marrón en troncos viejos, de raíz profunda, con hojas bipinnadas, folíolos. RM. lanceolados y flores de color blanco amarillento en capítulos de tallo largo 11. En. FO. dichas zonas, se observa alopecia en los mamíferos que consumen principalmente. IN. las semillas de L. trichodes, información de los pobladores de la zona. La alopecia. DE. generada en los mamíferos que lo consumen podría deberse a la mimosina. M. AS. existente en la especie L. trichodes12.. ST E. Estudios donde se ha empleado el extracto acuoso de hojas de Leucaena. SI. han demostrado que éste, ejerce efecto alelopático sobre diversas plantas como la. DE. lechuga, el arroz y malezas como Desmodium adscendens, Sida rhombifolia y. IO. N. Vernonia polyanthes, dicho extracto inhibe la germinación y afecta el crecimiento. CC. radicular de las plantas13,14, la fitotoxicidad del extracto de la Leucaena en. DI. RE. diversas plantas ha sido atribuida a la diversidad de aleloquímicos presentes en su composición15. El potencial alelopático de Leucaena se atribuye principalmente a la mimosina, aminoácido raro conocido como L- Mimosina, (β-(3-hydroxy-4pyridon-1-yl)-L-alanina) debido a la presencia de un radical hidroxilo en la posición tres y un anillo de oxígeno en la posición cuatro de la piridina 16. 14. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La Mimosina es un aminoácido no proteico que se produce en las hojas y las semillas de Leucaena y otras especies como Mimosa pudica15,17, es un aminoácido no proteico que tiene importantes efectos farmacológicos, como. M UN IC AC IÓ. N. antimitótico, antimicrobiano, antifibrótico en los fibroblastos cardiacos e inhibidor. de muerte neuronal18. Como un metabolito secundario típico en la regulación del metabolismo puede ser modulada por variaciones ambientales y compuestos tales. CO. como fitohormonas. Además, su biosíntesis representa un punto entre el metabolismo primario (para la biosíntesis de cisteína metabolismo de las proteínas. ÁT IC. A. Y. de ensamblaje) y secundaria (acumulación de mimosina) 18.. RM. Este aminoácido, tiene actividad inhibitoria del ciclo celular en la fase S,. FO. bloquea de forma reversible la progresión del ciclo celular, por efectos de la. IN. quelación del hierro estudiada en líneas celulares humanas de cáncer de mama. DE. (MDA-MB-453)12. Siendo la mimosina un bloqueador a nivel de la fase S,. AS. proporciona un material promisorio para la investigación sobre los procesos. ST E. M. implicados en la iniciación de la síntesis de ADN. Entre las técnicas moleculares se requieren los ensayos de genotoxicidad que permitan evaluar la magnitud de. DE. SI. daño del ADN19.. IO. N. Para detectar los daños a nivel del ADN, se utilizan los ensayos de. CC. micronúcleos que permiten evaluar la inestabilidad genética como un indicador. DI. RE. indirecto de rotura cromosómica, validada a nivel mundial y considerado como un biomarcador efectivo de daño en el ADN 20. Otra de las pruebas de genotoxicidad. lo constituye el Test del cometa que por su objetividad y resultados en corto tiempo, se viene incorporando como biomarcador de daño del ADN en extractos vegetales propuestos como candidatos de contener compuestos antineoplásicos21. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En 1988, Singh y colaboradores desarrollaron la variante alcalina de la electroforesis de células individuales (ensayo cometa), para evaluar roturas del ADN por agentes físicos o químicos22. Este ensayo consiste en embeber las. M UN IC AC IÓ. N. células en agarosa de bajo punto de fusión para formar un microgel, someterlas a. lisis para eliminar todas las proteínas celulares y permitir el posterior desenrollamiento23 por la interrupción de los enlaces por puentes de hidrógeno. CO. entre las dobles cadenas del ADN bajo condiciones alcalina/neutras 24,25,26.. Y. Al someter al ADN desenrollado a una electroforesis en tampón alcalino,. ÁT IC. A. los fragmentos de ADN cargados negativamente o cromatina relajada migran fuera del núcleo en dirección al ánodo27 para formar un halo23, apreciándose una. FO. RM. estructura parecida a la de un cometa 28 al teñir el ADN después de la. IN. electroforesis. Las células con un aumento de su ADN dañado muestran un. DE. incremento de la migración microsomal del ADN siendo las rupturas de doble. AS. cadena las causantes de mayor frecuencia de migración del material genético 29.. ST E. M. Por otra parte las células controles tienen un bajo número de rupturas, estas exhiben cometas de nivel 0 de acuerdo con la clasificación del grado de daño al. DE. SI. ADN, pero existiendo siempre cierta migración 30, encontrándose un 10% de este. N. en la cola. Para detectar y cuantificar el daño al ADN este puede ser teñido con. CC. IO. diferentes agentes como el nitrato de plata siendo más frecuentemente usados los. DI. RE. agentes fluorescentes. La evaluación del daño del ADN puede realizarse en sistemas biológicos. in vivo o in vitro31. In vivo, Oreochromis niloticus32,33, Mus domesticus, Drosophila melanogaster, estos sistemas son particularmente importantes por la fase metabólica que tienen los principios activos antes de ingresar a la célula. In 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. vitro, por el test del cometa en linfocitos, permite exponer el principio activo directamente a las células para conocer sus efectos de daño del ADN en un tiempo. N. relativamente más corto que en un sistema in vivo34.. M UN IC AC IÓ. La presente investigación tuvo por objetivo cuantificar el daño del ADN mediante el test del cometa en linfocitos humanos expuestos al extracto etanólico. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST E. M. AS. DE. IN. FO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. de hojas de Leucaena trichodes “chapra”.. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MATERIAL Y METODOS 1. Material Biológico:. N. Las hojas de Leucaena trichodes “chapra” se colectaron del Valle de. M UN IC AC IÓ. Cascajal, Piura.. La obtención de linfocitos se realizó a partir de muestras de sangre. CO. periférica humana.. Y. 2. Métodos y Técnicas:. ÁT IC. A. 2.1.- Recolección de hojas de Leucaena trichodes “chapra”. RM. Se realizó con un muestreo al azar y representativo de colección de. FO. hojas de todas las partes (inferior, media y superior) del árbol de Leucaena. IN. trichodes “chapra”, descartándose las hojas que por acción mecánica hayan. DE. sido arrancados o que presenten daños por animales o deterioro por el agua. M. AS. o viento (ANEXO 1).. SI. ST E. 2.2.- Secado y triturado de hojas de Leucaena trichodes “chapra”. DE. Las hojas se lavaron con agua de caño y se secaron en estufa a 37ºC. DI. RE. CC. IO. N. por 72 horas, posteriormente se procedió a su trituración manual. 2.3.- Obtención del extracto etanólico de hojas de Leucaena trichodes. “chapra” Se colocaron 380gr. de hojas secas trituradas en frascos de vidrio de boca ancha que contenían 6 litros de etanol al 96%, y se dejó macerar durante 7 días, en un ambiente oscuro. Se procedió a realizar la filtración a. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. temperatura ambiente usando un equipo de filtración al vacío35. Posteriormente se procedió a la evaporación del solvente presente en el. N. filtrado usando un ventilador de aire caliente (ANEXO 1).. M UN IC AC IÓ. El extracto crudo, producto de la evaporación del solvente, fue pesado en una balanza analítica y diluido con agua destilada a temperatura ambiente a un volumen equivalente al peso del extracto crudo (gr/mL) con la. CO. finalidad de obtener una solución madre (ANEXO 1) a partir de la cual se. Y. prepararon las solucionesnes a las concentraciones indicadas en el diseño. ÁT IC. A. experimental.. RM. 2.4.- Obtención de Linfocitos:. FO. Se extrajo con jeringa hipodérmica conteniendo 0.1ml de heparina. DE. IN. sódica, 3ml de sangre periférica de 5 donadores masculinos, sanos, no. AS. fumadores y en un rango de edad de 20 a 30 años. Se procedió a centrifugar. M. la muestra de sangre total a 1000rpm durante 10 minutos, luego de la. ST E. formación de tres capas, se extrajo 5 gotas de la capa intermedia, y fueron. SI. colocadas en 3ml de medio de cultivo RPMI, seguidamente, se incubó a. DI. RE. CC. IO. N. DE. 37ºC durante 24 horas (ANEXO 2). Transcurrido este tiempo, se colocó el medio en dos tubos de. microcentrífuga de 1.5ml y se centrifugó a 1000rpm durante 3 minutos, se eliminó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en 400ul de buffer fosfato, este paso se repitió dos veces con la finalidad de lavar el pellet.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.5.- Exposición de los linfocitos a las diferentes concentraciones del extracto etanólico de hojas de Leucaena trichodes “chapra”. N. Los linfocitos obtenidos en el paso anterior, fueron agrupados de. M UN IC AC IÓ. acuerdo a los diferentes tratamientos según concentraciones del extracto etanólico. Al grupo control negativo se colocó en PBS, al grupo control positivo se colocó 70ul de Peróxido de Hidrógeno 100uM36,37,38 y los otros. CO. grupos fueron expuestos a las concentraciones del extracto etanólico en. Y. concentraciones de 0,4; 1,6 y 3,2% por 30 minutos realizándose tres. ÁT IC. A. repeticiones por tratamiento, como lo indica el siguiente diseño. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST E. M. AS. DE. IN. FO. RM. experimental:. Donde: T1: Control positivo: Peróxido de Hidrógeno 100uM T2: Control negativo: PBS T3: Extracto etanólico de L. trichodes 0,4% T4: Extracto etanólico de L. trichodes 1,6% T5: Extracto etanólico de L. trichodes 3,2% R: Repetición. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.6.- Electroforesis Alcalina en gel de células (SCGE) o ensayo cometa: La electroforesis alcalina en gel de células (SCGE), ensayo cometa se. M UN IC AC IÓ. N. llevó a cabo como un procedimiento de dos capas22,34 (ANEXO 2). 2.6.1.- Primera capa de Agarosa: En láminas portaobjetos limpias y libres de grasa, se colocó 140ul de agarosa normal al 1,5% y se llevó a refrigerar, hasta que la capa de agarosa solidifique (5 minutos. Y. CO. aproximadamente).. ÁT IC. A. 2.6.2.- Segunda capa de Agarosa: Se tomó 70ul de linfocitos de cada tratamiento y se mezcló cada uno, suavemente con 140ul de agarosa de. RM. bajo punto de fusión al 1%, se colocó sobre la primera capa de agarosa. FO. y se recubrió con una laminilla helada. Se llevó a refrigerar durante 5. DE. IN. minutos. Se retiró la laminilla y las láminas se colocaron en un vaso. AS. couplin conteniendo un buffer de lisis (NaCl 2,5M, EDTA 0,1M, Tris. ST E. M. HCL 10mM, Tritón X-100) durante toda la noche.. SI. 2.6.3.- Electroforesis: Los preparados se colocaron durante 20 minutos. DE. en el buffer de electroforesis (EDTA 1mM, NaOH 300mM) a 4ºC,. DI. RE. CC. IO. N. transcurrido este tiempo se realizó el corrido de electroforesis con las siguientes características: 15V, 300mA durante 40 minutos. 2.6.4.- Neutralización: Después de la electroforesis, las muestras fueron colocadas en PBS 1X por 3 minutos y fijadas en alcohol de 96ºC durante 3 minutos.. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.6.5.- Coloración y Observación de los linfocitos: La coloración se realizó con 75ul de naranja de acridina 39 por cada lámina y se llevó a observar al microscopio de fluorescencia con el objetivo 10X y el filtro. M UN IC AC IÓ. N. 1. 2.6.- Toma de datos:. Se realizó la captura de imágenes, en cantidad de 100 células por. (software libre). Los parámetros utilizados para. Y. TM. A. software Comet Score. CO. lámina40 de cada uno de los tratamientos, las cuales se analizaron con el. ÁT IC. cuantificar el daño al ADN fueron: %DNA in Tail, y Tail Moment.. RM. El parámetro %DNA in Tail se calcula como la proporción entre la. FO. intensidad total de la cola y la intensidad total del cometa (cabeza y cola. DE. IN. juntas); el parámetro Tail Moment se calcula como el producto de dos. AS. factores: el % deDNA en la cola y la distancia entre el centro de masa de la. ST E. M. cabeza y de la cola.. SI. 2.8.- Análisis estadístico:. DE. Los datos obtenidos a partir del análisis con el software Comet. DI. RE. CC. IO. N. ScoreTM, fueron organizados en tablas procediéndose luego a la estimación del análisis de varianza y su posterior comparación mediante contraste múltiple de promedios, mediante la prueba de Tukey (p < 0.05) utilizando el programa estadístico Statgraphic versión de prueba.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS El daño del ADN se visualizó a través de una migración aumentada desde el núcleo hacia el ánodo dando la apariencia de la cola de un cometa que se. M UN IC AC IÓ. N. manifiesta después de la electroforesis alcalina; en el control positivo con. Peróxido de Hidrógeno 100uM se observó una típica apariencia del daño, las células expuestas al Buffer Fosfato (PBS) no presentaron ninguna migración,. CO. mantuvieron su forma esférica, mientras que las células expuestas a diferentes. ÁT IC. A. que se traduce como daño al ADN (Figuras 1,2,3).. Y. concentraciones de extracto etanólico de L. trichodes manifestaron una expansión. Al cuantificar el daño del ADN por el Test del Cometa en linfocitos. RM. humanos expuestos diferentes concentraciones del extracto etanólico de L.. IN. FO. trichodes “chapra”, se registraron diferencias significativas entre los tratamientos. DE. respecto a los valores promedios de los parámetros %DNA in Tail y Tail Moment.. AS. En la medida que las concentraciones del extracto etanólico de L. trichodes. ST E. M. aumenta los valores promedios tanto del %DNA in Tail como del parámetro Tail Moment. Los promedios del control positivo (Peróxido de Hidrógeno 100uM). DE. SI. difieren considerablemente a los promedios producidos por el extracto etanólico. N. de Leucaena trichodes “chapra” en concentraciones de 0,4%, 1,6% y 3,2%.. DI. RE. CC. IO. (Tablas 1, 2). En la tabla 3, se reporta los promedios y desviación estándar de las. mediciones del %DNA in Tail y Tail Moment del total de donantes, agrupación realizada, debido a la inexistencia de diferencias significativas de los valores entre los donantes.. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En las figuras 4, 5 y 6, se evidencia que el daño ocasionado por Peróxido de Hidrógeno 100µM es altamente significativo en relación al ocasionado por la exposición a diferentes concentraciones de extracto etanólico de L. trichodes. M UN IC AC IÓ. N. “chapra”.. En las figuras 7, 8 y 9, se muestra que no hay diferencias significativas entre donantes en la medición de los parámetros %DNA in Tail y Tail Moment, en. CO. linfocitos humanos expuestos a extracto etanólico de Leucaena trichodes “chapra”. Y. en concentraciones de 0,4%, 1,6% y 3,2% evaluados por el Test del Cometa,. ÁT IC. A. teniendo como control positivo a Peróxido de Hidrógeno 100µM y como control. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST E. M. AS. DE. IN. FO. RM. negativo a PBS.. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST E. M. AS. DE. IN. FO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. M UN IC AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..



(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 1: Promedios y Desviación Estándar de la medición del %DNA in Tail, en linfocitos humanos expuestos a diferentes tratamientos que corresponden a tres repeticiones por donante, evaluadas con el Software Comet Score™.. N. %DNA in Tail. T1 T2 T3 T4 T5. ±SD 0,370921077 0,695352055 0,974925206 0,583061088 0,42298978. 50,41009015 2,756674996 9,061746129 12,11777788 15,60826577. CO. Donante 1 (d1). M UN IC AC IÓ. Tratamientos. T1 T2 T3 T4 T5. ÁT IC. A. 51,18388445 2,685684259 7,600797715 10,95049441 14,54197964. IN. T1 T2 T3 T4 T5. AS. DE. Donante 3 (d3). ±SD 0,739479442 0,481082275 0,775025785 0,42378441 0,235924846. 52,29174369 2,609620588 8,027622477 10,49283276 15,68814607. ±SD 1,016350161 0,134731709 0,862664109 0,458624438 0,797933743. 50,31947328 2,347294032 9,077079785 11,99747328 13,92534008. ±SD 1,134112257 0,678065647 0,187459248 0,187459248 0,550842569. M. Tratamientos. DE. SI. ST E. Donante 4 (d4). Tratamientos. N IO CC RE DI. T1 T2 T3 T4 T5. Donante 5 (d5). T1 T2 T3 T4 T5. ±SD 0,985551621 0,36774902 0,758163315 0,107777279 0,48874555. 51,44490699 2,132139008 8,443605525 11,37608952 14,85405428. FO. Tratamientos. RM. Donante 2 (d2). Y. Tratamientos. Donde: T1: Control positivo: Peróxido de Hidrógeno 100uM T2: Control negativo: PBS T3: Extracto etanólico de L. trichodes 0,4% T4: Extracto etanólico de L. trichodes 1,6% T5: Extracto etanólico de L. trichodes 3,2%. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 2: Promedios y Desviación Estándar de la medición del parámetro Tail Moment en linfocitos humanos expuestos a diferentes tratamientos que corresponden a tres repeticiones por donante, evaluadas por el Test del Cometa, analizadas con el Software Comet Score™.. N. Tail Moment. T1 T2 T3 T4 T5. ±SD 0,091142954 0,019464114 0,022288521 0,068443569 0,268879259. 15,92899721 0,043923982 0,267928539 0,30582059 1,226361099. CO. Donante 1 (d1). M UN IC AC IÓ. Tratamientos. T1 T2 T3 T4 T5. ÁT IC. A. 16,12304913 0,030172091 0,242199745 0,277650506 0,995664923. IN. T1 T2 T3 T4 T5. AS. DE. Donante 3 (d3). ±SD 0,239119476 0,036947936 0,06792356 0,012580132 0,130389076. 16,87621641 0,046450103 0,326987012 0,286028074 0,961365997. ±SD 0,419504107 0,003521743 0,061277506 0,027986496 0,136791557. 15,65516894 0,021300991 0,249787969 0,320343886 1,616489942. ±SD 0,43400962 0,013884571 0,020946368 0,04290452 0,480740147. M. Tratamientos. DE. SI. ST E. Donante 4 (d4). Tratamientos. N IO CC RE DI. T1 T2 T3 T4 T5. Donante 5 (d5). T1 T2 T3 T4 T5. ±SD 0,420818267 0,010450472 0,033528972 0,027174362 0,34206063. 16,22317626 0,035060594 0,316056371 0,248194638 1,18828516. FO. Tratamientos. RM. Donante 2 (d2). Y. Tratamientos. Donde: T1: Control positivo: Peróxido de Hidrógeno 100uM T2: Control negativo: PBS T3: Extracto etanólico de L. trichodes 0,4% T4: Extracto etanólico de L. trichodes 1,6% T5: Extracto etanólico de L. trichodes 3,2%. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. M UN IC AC IÓ. N. Tabla 3: Promedios y desviación estándar de la medición de los parámetros %DNA in Tail y Tail Moment de cinco donantes, en linfocitos humanos expuestos a diferentes tratamientos que corresponden a tres repeticiones por donante, evaluadas por el Test del Cometa, analizadas con el Software Comet Score™.. %DNA in Tail Tratamientos. Tail Moment. ±SD. 51,13001971. 0,810392202. 16,16132159. 0,01025902. T2. 2,088568814. 0,26020225. 0,035381552. 0,03870864. T3. 8,442170326. 0,645512209. 0,280591927. 0,02765139. T4. 11,38693357. 0,68864090. 0,28760754. 0,26123123. T5. 14,92355717. 0,741668975. 1,19763342. 0,45456862. ÁT IC. A. CO. T1. Y. ±SD. FO. RM. Fc = 0.79 P<0.001 ** diferencias altamente significativas. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST E. M. AS. DE. IN. Donde: T1: Control positivo: Peróxido de Hidrógeno 100uM T2: Control negativo: PBS T3: Extracto etanólico de L. trichodes 0,4% T4: Extracto etanólico de L. trichodes 1,6% T5: Extracto etanólico de L. trichodes 3,2%. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..



(33) RM. ÁT IC. A. Y. CO. M UN IC AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST E. M. AS. DE. IN. FO. FIGURA 6: Valores promedios del % de DNA in Tail en linfocitos humanos, de cinco donantes, expuestos a diferentes tratamientos que corresponden a tres repeticiones por donante, evaluadas por el Test del Cometa, analizadas con el Software Comet Score™.. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) FO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. M UN IC AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST E. M. AS. DE. IN. FIGURA 7: Valores promedios de Tail Moment en linfocitos humanos, de 5 donantes, expuestos a diferentes tratamientos que corresponden a tres repeticiones por donante, evaluadas por el Test del Cometa, analizadas con el Software Comet Score™.. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DISCUSION. Para la determinación del daño del ADN, el Test del Cometa es uno de los. M UN IC AC IÓ. N. métodos más usados en células animales, o en cultivos celulares aislados (ej.,. Linfocitos obtenidos de sangre, o células de tejidos desagregados) 21, los linfocitos han sido intensamente estudiados y desde hace muchos años son utilizados para una gran diversidad de investigaciones biológicas. Las técnicas para cultivar. CO. linfocitos se basan en la capacidad que tienen estas células para proliferar en. A. Y. presencia de agentes inductores de la división celular y su desarrollo en un gran. ÁT IC. número de medios de cultivos entre los cuales se encuentra el RPMI41.. RM. El presente estudio muestra un incremento significativo de los valores. IN. FO. %DNA in tail y Tail Moment a medida que aumentan las dosis de los extractos de. DE. L. trichodes. Este hecho evidencia, un incremento importante de rupturas de. AS. hebra simple en la molécula de ADN que se evidencian por la migración. ST E. M. aumentada desde el núcleo hacia el ánodo dando la apariencia de la cola de un cometa que se manifiesta después de la electroforesis alcalina de las muestras. DE. SI. como se observa en los resultados de la presente investigación. Sustento de. N. rupturas de hebra simple en el ADN que migran hacia el ánodo en el test del. Al analizar los promedios y desviación estándar de la medición del %DNA. DI. RE. CC. IO. cometa23, 42.. in Tail, del control negativo (PBS) en linfocitos humanos, que corresponden al promedio de tres repeticiones por donante, se observa que dichos valores 2,76% (d1); 2,69% (d2); 2,13% (d3); 2,61% (d4) y 2,35% (d5) se aproximan a lo reportado por Arencibia43, quien estimó que las células controles tienen un bajo número de. 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. roturas, en estas células el ADN tiene cierta migración de 2,45%. Las diferencias que existen con esta investigación, se debería probablemente a las diferencias. N. metodológicas empleadas.. M UN IC AC IÓ. Los promedios y desviación estándar de las mediciones del %DNA in. Tail, del control positivo (Peróxido de Hidrógeno 100uM) en linfocitos humanos, son coincidentes con lo reportado por otros autores44,45,46, quienes demostraron la. CO. labilidad de la estructura del ADN y ruptura del ADN al interactuar con el. Y. Oxígeno y el Hierro del peróxido de hidrógeno. Estudios sobre la inducción de. ÁT IC. A. daño del ADN en células sanguíneas de peces marinos por peróxido de hidrógeno. RM. reportó un valor de 24% del Tail Moment, valores que difieren a lo registrado en. FO. linfocitos humanos.. IN. El daño de ADN producida por L. trichodes, se explicaría a la presencia de. DE. un aminoácido tóxico47,48,49, denominado mimosina por su presencia en la familia. AS. Mimosidae. La mimosina, es un aminoácido no proteico de estructura similar a la. ST E. M. tirosina y está presente en todas las especies del género Leucaena50.. SI. Existen evidencias de que la mimosina no detiene las células en la fase G1. DE. tardía, sino más bien, impide la iniciación de Síntesis de ADN en los orígenes de Mimosina. IO. N. la replicación, además, degrada la elongación de la cadena51.. RE. CC. inhibiendo la síntesis de ADN a el nivel elongación de las cadenas de ADN. DI. causando un agotamiento de pools intracelulares de desoxinucleótido trifosfatos (dNTPs)52. Guilbert y Hugges53,54 argumentan que mimosina pueda perturbar la. función de la Ribonucleotido Reductasa (RNR) a través de su capacidad de quelar. 36 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. iones metálicos, ya que mimosina es un fuerte quelante de hierro y la enzima RNR tiene un esencial requisito de hierro para su apropiada función.. N. En la presente investigación se reporta las roturas del ADN en linfocitos. M UN IC AC IÓ. humanos por efecto de L. trichodes a través de los valores %DNA in tail y Tail. Moment. Sin embargo no se conoce el mecanismo molecular que probablemente la mimosina induce roturas del ADN. Un posible mecanismo es que mimosina,. CO. siendo un fuerte agente quelante se une al hierro y los iones de cobre, y por lo. A. Y. tanto, facilita la generación de radicales libres55.. ÁT IC. El extracto etanólico de hojas de L. trichodes, al poseer componentes. RM. como el aminoácido mimosina estaría actuando inhibiendo el ciclo celular en la. FO. fase S, bloqueando de forma reversible la progresión del ciclo celular, por efectos. IN. de la quelación del hierro estudiada en líneas celulares según lo reportado por. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST E. M. AS. DE. William12.. 37 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONCLUSIONES. El extracto etanólico de hojas de Leucaena trichodes “chapra”. a las. N. . M UN IC AC IÓ. concentraciones de 0,4%; 1,6% y 3,2% produce roturas de cadenas. simples de ADN demostrada a través de los parámetros %DNA in tail y. Los valores de los %DNA in tail y Tail Moment en linfocitos humanos. Y. . CO. Tail Moment.. ÁT IC. A. entre los cinco donantes no expuestos al peróxido de hidrógeno y a los. RM. extractos etanólicos de L. trichodes se establece el rango de variación. El rango de variación de parámetros %DNA in tail y Tail Moment en. AS. . DE. IN. FO. comprendido en 8.06558 - 8.73607 y 3.45688 - 3.74743 respectivamente.. M. linfocitos humanos expuestos a PBS es de 2.17104 - 2.84153 y 3.38847 -. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST E. 3.67902 respectivamente.. 38 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. M UN IC AC IÓ. N. 1. Hartewell Jl. Types of anticancer agents isolated from plants. Cancer Treat Rep. 1976; 60:1031-6.. 2. Colom L. Y. et al. Actividad antitumoral de extractos de plantas de la flora cubana frente de Leucemia Linfocítica P-388. Rev. Cubana Plant Med. Y. CO. 2005; 10(2).. ÁT IC. A. 3. Cragg. G. M & D. J. Newman. 2003. Plants as a source of anti-cancer and. RM. anti-HIV agents. Annals of Applied Biology 143: 127-133.. FO. 4. Buendía J, López J, García A. 2008. Drug prescription patterns in patients. IN. attended at a middle- and high-complexity level institution. Rev. salud. AS. DE. pública, vol.10, no.4, p.605-614. ISSN 0124-0064. M. 5. Goodman A. Las bases farmacológicas de la terapéutica. McGraw-Hill. ST E. Interamericana. Decima edición, 2003.. DE. SI. 6. Hughes, C. 1998. Leucaena: Manual de recursos genéticos. Oxford. N. Forestry Institute, Department for International Development, University. DI. RE. CC. IO. of Oxford. Reino Unido (UK).. 7. Skerman, P. J. Tropical forage legumes. Rome: FAO, 1977. 8. Budelman, A. The performance of the leaf mulches of Leucaena leucocephala, Flemingia macrophylla and Gliricidia sepium in weed control. Agroforestry Systems, 6:137-145, 1988.. 39 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 9. Evaluación del potencial Forestal del Bosque Seco Piedra del Toro. Perú. Octubre de 2003.. N. 10. Mostacero León J, Mejía Coico F; Gamarra Torres O. Taxonomía de la. M UN IC AC IÓ. Fanerógamas Útiles del Perú. 2002. Editora Normas Legales S.A.C, 2002; 1323 páginas.. 11. Albrecht Glatzle. Leucaena En Ganadería: Cómo Controlar La Mimosina.. Y. CO. 2008.. ÁT IC. A. 12. William D, et al. Anti-tumor Effect of the Amino Acid Mimosine. Europ.. RM. J. Cancer Vol. 9, pp. 281-283. Pergamon Press 1973.. FO. 13. Kuo, Y. L.; Chou, C. H.; & Hu, T. W. Allelopathic potencial of Leucaena. IN. leucocephala. Leucaena Research Report, 3: 65-70, 1982.. DE. 14. Souza Filho, A.P., Rodrigues, L.R.A., & Rodríguez, T.J.D. Efeitos do. M. AS. potencial alelopático de três leguminosas forrageiras sobre três invasoras. ST E. de pastagens. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 32: 165-170, 1997.. DE. SI. 15. Chou, C.H.; Kuo Y.L. Allelopathic research of subtropical vegetation in III.. Alelopathic. exclusion. of. understrory. by Leucaena. N. taiwan.. DI. RE. CC. IO. leucocephala (Lam.) de Wit. Journal of Chemical Ecology, 12: 14311448, 1986.. 16. Ward, K.A.; & Harris, R.L.N. Inibition of wool follicle DNA synthesis by mimosine and related 4(1H)-pyridones. Australian Journal Biology Science, 29: 189-196, 1976.. 40 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 17. Jacobi, U.S.;. &. Ferreira, A.G. Efeitos alelopáticos de Mimosa. bimucronata (DC) sobre espécies cultivadas. Pesquisa Agropecuária. N. Brasileira, 26: 935-943, 1991.. M UN IC AC IÓ. 18. Vestena, S.; Fett-Neto, A. G.; Duarte, R. C.; Ferreira, A. G. Regulation of. Mimosine Accumulation in Leucaena leucocephala seedlings. Plant. Science, Amsterdam, v.161, p. 597-604, 2001.. CO. 19. Te, C., J.M. Gentile, B.C. Baguley y A.E. Pearson, 1997. In vivo effects of. A. Y. chlorophyllin on antitumour agent cyclophosphamide. International. ÁT IC. Journal Cancer, 70(1): 84-89.. RM. 20. Fenech M, Neville S, Rinaldi J, 1994. Sex is an important variable. FO. affecting spontaneous micronucleus frequency in cytokinesis-blocked. DE. IN. lymphocytes. Mutation Research 313: 203-207.. AS. 21. Collins AR. The Comet Assay for ADN Damage and Repair. Principles.. ST E. M. Mol. Biotech 2004; 26:249-261.. SI. 22. N. P. Singh, M. T. McCoy, R. R. Tice, E. L. Schneider, 1988: A simple. DE. technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual. CC. IO. N. cells. Exp. Cell Res. 175 184-191.. DI. RE. 23. Lee R, Steinert S. Use of the single gel electrophoresis/comet assay for detecting DNA damage in acuatic (marine and freshwater) animals. Mutat. Res 2003; 544:43-64.. 41 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 24. Tice RR, Agurell E, Anderson D, Burlinson B. 2000 Single cell gel/Comet assay: Guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.. N. Environ Mol Mutagen; 35:206-221.. M UN IC AC IÓ. 25. Nadin S, Vargas-Roig LM, Ciocca DR. 2001. A Silver Staining Method for Single-cell Gell Assay. J. Histochem. Cytochem; 49(9):1183-1186.. 26. Mañas, F., Peralta, L., Raviolo, J, et al, 2009. Genotoxicity of Glyphosate. CO. assessed by the Comet Assay and cytogenetic test. Environ. Toxicol.. ÁT IC. A. Y. Pharmacol. Vol. 28:37-41.. 27. Duez P, Dehon G, Kumps A, Dubois J. 2003. Statistics of the Comet. RM. assay: a key to discriminate between genotoxic effects. Mutagenesis;. IN. FO. 18(2):159-166.. DE. 28. Frieauff W, Hartmann A, Suter W. Automatic analysis of slides processed. M. AS. in the Comet assay. Mutagenesis 2001; 16(2):133-137.. ST E. 29. Hartmann A, Agurell E, Beevers C, Brendler-Schwaab S, Burlinson B.. SI. 2003. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay.. N. DE. Mutagenesis; 18(1):45-51.. DNA damage (strands breaks and oxidized pyrimidines) in human cells, Mut. Res. (DNA Repair) 336 (1995) 69-77.. DI. RE. CC. IO. 30. A.R. Collins, A. G. Ma, S. J. Duthie. The kineties of repair of oxidative. 31. Matilde H. Navarrete, Pilar Carrera, Marta de Miguel, Consuelo de la Torre. A fast comet assay variant for solid tissue cells. The assessment of DNA damage in higher plants. Mutation Research 389 (1997) 271–277.. 42 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(43) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 32. Cintya A., Christofoletti José and Carmem Fontanetti. 2009. Application of the comet assay in erythrocytes of Oreochromis niloticus (Pisces): A methodological comparison. Genetics and Molecular Biology, 32, 1, 155-. M UN IC AC IÓ. N. 158.. 33. Prieto, Zulita, León-Incio, Julio, Quijano-Jara, Carlos et al. Efecto Genotóxico del Dicromato de Potasio En Eritrocitos de sangre periférica. CO. de Oreochromis niloticus (Tilapia). Rev. Perú. med. exp. salud pública,. A. Y. ene./mar. 2008, vol.25, no.1, p.51-58. ISSN 1726-4634.. ÁT IC. 34. Klaude, M., Eriksson, S., Nygren, J., Ahnstrom, G., 1996. The comet. RM. assay: mechanisms and technical considerations. Mutat. Res. 363, 89–96.. FO. 35. Keile Brugés, María Teresa Reguero Reza. Evaluación preliminar de. DE. IN. toxicidad, genotoxicidad y actividad antimicrobiana de Sida rhombifolia L.. AS. Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. IX No. 1 Julio 2007 5-13.. ST E. M. 36. Tice, R. 2000. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in. SI. vivo genetic toxicology testing. Enviromental and Molecular Mutagenesis. DE. 35: 206-221.. DI. RE. CC. IO. N. 37. Lazarová, M.; Lábaj, J.; Eckl, P.; Slamjnov, D. 2006. Comparative evaluation of DNA damage by genotoxicants in primary rat cells applying the comet assay. Toxicology Letters 164: 54-62. 38. Carthy, P. J.; Sweetman, S.; Makenna, P.; Mckelvey, P. 1997. Evaluation of Manual and Image Analysis Quantification of DNA Damage in the alkaline Comet Assay. Mutagenesis 12 (4): 209-214.. 43 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(44) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 39. Daryl W. Fairbairn, Peggy L. Olive, Kim L. O'Neill. The comet assay: a comprehensive review. 1994. Mutation Research 339 (1995) 37-59.. N. 40. Peralta, L., Mañas F., Gentile N. et al, 2011. Evaluación del daño genético. M UN IC AC IÓ. en pobladores de Marcos Járez expuestos a plaguicidas: estudio de un caso en Córdova, Argentina. Diálogos-UNSL. Vol. 2, 7-26.. 41. Carrano, A. V., A. T. NATARAJAN. Considerations for population. CO. monitoring using cytogenetic techniques. Mutat. Res., 1988, 204: 379-406. A. Y. 42. Lee F. Richard. Use of the Single cell gel electrophoresis/Comet Assay for. ÁT IC. detecting DNA damage in aquatic animals. Mutatios Research 544 (2003). RM. 43-64.. FO. 43. Arencibia A. Daniel, Algunas consideraciones sobre el desarrollo de la. IN. técnica para el ensayo cometa in vivo en leucocitos de sangre periférica y. DE. células de hígado. Revista de Tecnología en línea. La Habana, Cuba.. M. AS. 44. Silva, F.E.; Meschede, D.K. Azevedo, et al. Efeito Alelopático Da. ST E. Leucena (Leucaena leucocephala) No Crescimento E Desenvolvimento. SI. Inicial Da Cultura Do Milho (Zea mays) e Da Soja (Glicine Max).. DE. Ribeirão Preto – SP. Julho de 2010.. IO. N. 45. D'Mello, J.P.F. 1989. Toxic amino acids. In: Association of Applied. DI. RE. CC. Biologists (Ed.) Aspects of Applied Biology 19. Antinutritional factors, potentially toxic substances in plants pp: 29-50. Institute of Hortocultural Research, Wellesbourne, Warwick CV35 9EF, U. K.. 46. Johnson, A.E., R.J. Molyneux and G.B. Merrill. 1985. Chemistry of toxic range plants. Variation in pyrrolizidine alkaloid content of Senecio, Amsinckia, and Crotalaria species. J. Agric. Food Chem., 33: 50-55. 44 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(45) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 47. Kronberg, S.L. and J.W. Walker. 1993. Ruminal metabolism of leaf spurge in sheep and goats: a potential explanation for differential foraging on spurge by sheep, goats and cattle. J. Chem. Ecol., 19: 2007-2017.. M UN IC AC IÓ. N. 48. Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. 2009. Comet assay: a reliable tool. for the assessment of DNA damage in different models. Cell Biology and Toxicology. 25, 5-32.. CO. 49. Kobayashi, H., Sugiyama, C., Morikawa, Y., Hayashi, M., Sofuni, T.. Y. 1995. A comparison between manual microscopic analysis and. ÁT IC. A. computerized imagen analysis in the single cell gel electrophoresis. Mammalian Mutagenicity Study Group Communications. 3, 121-133.. RM. 50. Speit, G., Hartmann, A. 1999. The comet assay (Single-cell gel test): a. FO. sensitive genotoxicity test for detection of DNA damage and repair.. DE. IN. Methods in Molecular Biology.113, 203-212.. AS. 51. H.-B. Lin, R. Falchetto, P. Mosca, J. Shabanowitz, D. Hunts, J. Hamlin,. M. Mimosine targets serine hydroxymethyltrans-ferase, J. Biol. Chem. 271. ST E. _1996. 2548–2556.. SI. 52. A.N. Jha, P.M. Hande, L.H.F. Mullenders, A.T. Natarajan, Mimosine is a. DE. potent clastogen in primary and transformed hamster fibroblasts but not in. DI. RE. CC. IO. N. primary and transformed human lymphocytes, Mutagenesis 10 _1995. 385–391.. 53. D. Gilbert, A. Neilson, H. Miyazawa, M. DePamphilis, W. Burhans, Mimosine arrests DNA synthesis at replication forks by inhibiting deoxyribonucleotide metabolism, J. Biol. Chem. 270 _1995. 9597–9606.. 45 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(46) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 54. Hughes, P. Cook, Mimosine arrests the cell cycle after cells enter S-phase, Exp. Cell Res. 222 _1996. 275–280. 55. O. Ji, L.J. Marnett, J.A. Pietenpol, Cell cycle re-entry following. M UN IC AC IÓ. N. chemically induced synchronization leads to elevated p53 and p21 protein. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST E. M. AS. DE. IN. FO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. levels, Oncogene 15 _1997. 2749–2753.. 46 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..


(48) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. M UN IC AC IÓ. N. ANEXO 1. 2.- Selección de hojas de L. trichodes para ser lavadas y secadas.. AS. DE. IN. FO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. 1.- Identificación de L. trichodes. 3.- Pesado de hojas de L. trichodes.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST E. M. 4.- Hojas de L. trichodes expuestas en alcohol de 96º. 5.- Extracción al vacío del extracto etanólico de L. trichodes. 6.- Placas petri conteniendo el extracto etanólico de L. trichodes para su evaporación.. 48 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(49) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CO. M UN IC AC IÓ. N. ANEXO 1 (continuación). 7.- Dilución del extracto etanólico de L. trichodes.. ÁT IC. A. Y. 8.- Solución madre de extracto etanólico de L. trichodes.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST E. M. AS. DE. IN. FO. RM. Figura 8: Metodología utilizada para la obtención del extracto etanólico de hojas de Leucaena trichodes “chapra”. 49 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(50) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ANEXO 2. sangre. 2.- Linfocitos humanos en medio de cultivo RPMI.. ÁT IC. A. de. ST E. M. AS. DE. IN. FO. RM. 1.- Extracción periférica.. Y. CO. M UN IC AC IÓ. N. PROTOCOLO DEL TEST DEL COMETA PARA LINFOCITOS. 3.- Exposición de linfocitos a los diferentes tratamientos.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. 4.- Preparación de las láminas con agarosa.. 5.- Exposición de las muestras en el buffer de lisis.. 6.- Colocación de las muestras en el buffer de electroforesis.. 50 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(51) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CO. M UN IC AC IÓ. N. ANEXO 2 (Continuación). 7.- Electroforesis.. SI. ST E. M. AS. DE. IN. FO. RM. ÁT IC. A. Y. 8.- Observación de las muestras en Microscopio de fluorescencia.. 9.- Captación de imágenes.. N. DE. 10.- Análisis de los linfocitos con el Software Comet Score™.. DI. RE. CC. IO. Figura 9: Metodología utilizada para el Test del Cometa en Linfocitos humanos.. 51 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..