Efecto de los lipopolisacáridos de bartonella bacilliformis y de salmonella sp sobre macrófagos de cavia porcellus con hipersensibilidad retardada

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. BI. O. Q. UI M. IC A. ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. AC IA. Y. TRABAJO DE INVESTIGACIÓN TIPO II. EFECTO DE LOS LIPOPOLISACÁRIDOS DE Bartonella bacilliformis Y DE. FA R. M. Salmonella sp. SOBRE MACRÓFAGOS DE Cavia porcellus CON. DE. HIPERSENSIBILIDAD RETARDADA. BACHILLER. TE. CA. PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE:. BL. IO. EN FARMACIA Y BIOQUÍMICA. BI. AUTORES:. ARROYO ORBEGOSO, LUIS ALFREDO CARMEN AÑAZCO, JUAN ELIEZER. ASESOR: Prof. CRUZADO RAZCO, LIZARDO. TRUJILLO – PERU 2008. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. Dedico y agradezco este trabajo:. IC A. A Dios, por haberme acompañado e iluminado en mis decisiones. A mis abuelos Luis Orbegoso y Celicia Obeso por alimentar mi fuerza de voluntad.. UI M. A mis padres Hilda Orbegoso y Nicolas Arroyo por enseñarme con su ejemplo la paciencia y. O. Q. perseverancia en el camino hacia nuestros sueños.. Y. BI. A mi hermana Cinthia por el ejemplo de persistir tras nuestros sueños.. AC IA. A mi compañera incondicional Karla Estrada por enseñarme nuevas experiencias en la vida. Luis Alfredo Arroyo Orbegoso. BI. BL. IO. TE. CA. DE. FA R. M. de dos.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) IC A. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UI M. Dedico este trabajo a:. O. Q. A mis viejos Rosa Añazco y Juan Carmen, por enseñarme la persistencia, el ejemplo de. BI. superación, el amor al estudio y brindarme todo su apoyo incondicional.. AC IA. Y. A mis hermanos Elio, Arely, Lober, Yamile por su fraternidad y su ayuda incondicional. A Karim, por estar a mi lado en todos estos momentos, comprendiéndome.. Juan EliezerCarmen Añazco. BI. BL. IO. TE. CA. DE. FA R. M. A doña Angelita, por su atención y diligencia en los trámites.Gracias!. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IC A. AGRADECIMIENTO. UI M. Un agradecimiento sincero y especial por los consejos, la paciencia y el apoyo para poder guiarnos y realizar este trabajo:. Y. BI. O. Q. Prof. LIZARDO CRUZADO RAZCO. M. BI. BL. IO. TE. CA. DE. Mg. William Sagástegui Guarníz. FA R. Dr. Ramón Piminchumo Carranza. AC IA. A los distinguidos miembros del jurado calificador por sus consejos y recomendaciones que llevaron a la presentación del presente trabajo:. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO: En cumplimiento con las normas dispuestas en el reglamento de grados. IC A. de la Escuela de Pre Grado de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la. UI M. Universidad Nacional de Trujillo, someto a su consideración el Informe de. Y. BI. O. Q. Proyecto de Investigación:. AC IA. EFECTO DE LOS LIPOPOLISACÁRIDOS DE Bartonella bacilliformis Y DE Salmonella sp. SOBRE MACRÓFAGOS DE Cavia porcellus CON. FA R. M. HIPERSENSIBILIDAD RETARDADA. DE. Expresamos vuestro más sincero reconocimiento a todos los docentes que. CA. están contribuyendo con sus enseñanzas y experiencias en nuestra formación. BI. BL. IO. TE. profesional.. Est. ARROYO ORBEGOSO, LUIS ALFREDO. Trujillo, Julio del 2008. Est. CARMEN AÑAZCO, JUAN ELIEZER. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Q. UI M. IC A. JURADO DICTAMINADOR. (PRESIDENTE). Y. BI. O. Dr. RAMÓN PIMINCHUMO CARRANZA………………………... (MIEMBRO). Mg. WILLIAM SAGÁSTEGUI GUARNÍZ…………………………. (MIEMBRO). BI. BL. IO. TE. CA. DE. FA R. M. AC IA. Mg. LIZARDO CRUZADO RAZCO………………………………... Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE. Pág.. Abstract. …………………….…………….…………………..9. IC A. …………………….…………….…………………. 8. Introducción. …………………….…………….…………………..10. UI M. I.-. Resumen. O. Q. II.- Material y Métodos ……………….…………….…………………..14. …………………….…………….…………………..20. IV.- Discusión. …………………….…………….…………………..29. V.- Conclusiones. …………………….…………….…………………..34. …….…………….…………………..35. BI. BL. IO. TE. CA. DE. VII.- Referencias Bibliográficas. FA R. M. AC IA. Y. BI. III.- Resultados. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN En el presente trabajo se estudia el efecto que ejercen los lipopolisacáridos (LPS) de Bartonella bacilliformis y de Salmonella sp. sobre macrófagos activados de Cavia porcellus, con hipersensibilidad retardada. Con esta finalidad se llevó a cabo la obtención del lipopolisacárido de ambas cepas, por un método específico, basado en las características físico químicas del LPS. Se emulsionó en aceite de oliva a la concentración de 0.1 mg/mL y se procedió a antigenizar a los especímenes, los cuales fueron dividos en tres grupos de cuatro. IC A. ejemplares cada uno (blanco, testigo y problema) a una concentración de 0.01 mg/kg p.c.. UI M. Después de 10 días se procedió a realizar el cultivo de linfocitos (transformación linfoblástica) y macrófagos (activación de macrófagos) sobre láminas portaobjetos. Luego de. O. Q. 24 horas (para cultivo de macrófagos) y 96 horas (para cultivo de linfocitos) se procedió a la. BI. tinción con colorante Wright de las láminas y su respectiva observación en el miscroscopio.. Y. Los resultados obtenidos revelaron que el LPS de Bartonella bacilliformis no produjo la. AC IA. muerte de macrófagos, como si ocurre con el LPS de Salmonella sp. De esto se conlcluye que el LPS de Bartonella bacilliformis no es una factor importante en la patología de la. FA R. M. enfermedad de Carrión.. BI. BL. IO. TE. CA. DE. Palabras claves: Lipopolisacárido, macrófago, linfocitos, TNF-α. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT. The present study showed the effect produced by the lipopolysaccharide (LPS) from Bartonella bacilliformis on transforming lymphoblastic and activation of macrophages in Cavia porcellus, comparing the effect which generates the lipopolysaccharide of Salmonella sp. To this end was held to obtain the lipopolysaccharide of both strains, for a specific method, based on the physical chemical characteristics of LPS. Once this is in olive oil. IC A. emulsion to the concentration of 0.1 mg / ml and proceeded to antigenizar to specimens,. UI M. which were divided into three groups of four (white, and witness problem) to a concentration of 0.01 mg / kg bw. After 10 days was to make the cultivation of lymphocytes (transformation. O. Q. lymphoblastic) and macrophages (activation of macrophages) on plates slide. After 24 hours. BI. (for cultivation of macrophages) and 96 hours (for cultivation of lymphocytes) were stained. Y. with the dye Wright of the slides and their observation in miscroscopio. The results revealed. AC IA. that LPS Bartonella bacilliformis didn’t resulte in the death of macrophages, as happens with LPS Salmonella sp. Then, LPS Bartonella bacilliformis is not an important factor in the. FA R. M. pathology of the disease Carrion.. BI. BL. IO. TE. CA. DE. Palabras claves: Lipopolysacharide, macrophages, lymphocyte, TNF-α. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I.. INTRODUCCIÓN. La enfermedad de Carrión o bartonelosis es una enfermedad milenaria, causada por el agente etiológico denominado Bartonella bacilliformis. Las culturas Mochica, Chimú, Nazca, Huayla, Wari, y también la cultura Jama (5 a.C.) representaron esta enfermedad en sus cerámicas (huacos) y en ocasiones llego a ser tan severa como los cuadros clínicos representados en la actualidad. Hasta hace más de una década Bartonella bacilliformis era. IC A. la única especie de este género, sin embargo a partir de 1992 fueron incorporándose nuevas especies habiendo en la actualidad 20 especies de bartonella identificadas, de las. UI M. cuales 7 son patógenas para el hombre, ellas son B. bacilliformis, B. quintana, B. vinsonii,. Q. B. elizabethae, B. henselae, B. calrridgeiae y B. grahamamii. Desde entonces Bartonella. O. spp. ha sido reconocida como causante de remotas enfermedades incluyendo la. Y. AC IA. linfadenopatia crónica, retinitis, etc. (10) (17). BI. angiomatosis bacillar, enfermedad del arañazo del gato, bacteriemia crónica,. Bartonella bacilliformis es una bacteria gran negativa, pleomórfica, aeróbica, de. FA R. M. localización intracelular, facultativa y perteneciente a la clase Proteobacteria. Posee de 2 a 16 flagelos unipolares que le confieren la invasividad, adopta formas cocoide, ovoide,. DE. cocobacilar y bacilar tiene un tamaño aproximado de 2-3 µm de largo por 0.2 – 0.5 um de. CA. ancho. Su único reservorio hasta ahora conocido es el hombre (12) (13) (19).. TE. En el Perú, la diseminación del agente etiológico ha hecho perder la vigencia de los. IO. valles interandinos como áreas endémicas. Actualmente se registran casos humanos de. BL. bartonelosis en la Selva Baja y la Selva Alta y también en áreas de la costa. La diversidad. BI. fisiográfica de nuestro país dan una configuración especial a la epidemiología de la enfermedad, asi como también los fenómenos actuales como el calentamiento global y cambios climáticos (8) (10) (11) (13) (15).. La bartonelosis es considerada un problema de salud pública. En el año 2007 se reportó en Perú una tasa de morbilidad de 12.31 por 100,000 habitantes. En la ultima década se han registrado 10 000 defunciones causadas por esta enfermedad (11) (8).. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Esta enfermedad es transmitida por un vector hematófago del género Lutzomyia (enfermedad metaxénica). Una vez que el artrópodo infectado Lutzomyia verrucarum o Lutzomyia peruensis pica al hombre, el desarrollo de la enfermedad dependerá fundamentalmente del estado inmunológico de la persona que desarrollará la enfermedad en su primera fase, en su segunda fase o simplemente se volverá temporalmente un reservorio de la bartonella, ahora el periodo de incubación de Bartonella bacilliformis puede ser de 5 a 210 días o quizás mas como se ha descubierto últimamente. Los factores que condicionan esta enfermedad son el estado inmunológico, la virulencia y la ruta de. UI M. IC A. inoculación. (10) (13) (17) (20).. Bartonella bacilliformis invade las células endoteliales de los capilares y de vasos. Q. linfáticos. Ahí se reproduce hasta la lisis de la célula hospedadora endotelial por el. BI. O. proceso infeccioso; de esta manera el agente liberado infecta nuevamente a otras células. Y. endoteliales. Mientras esto ocurre, simultáneamente las bartonelas liberadas van. AC IA. parasitando a los eritrocitos. La invasión de los eritrocitos empieza por la adherencia de la bacteria y esta mediada por proteínas específicas de la superficie bacteriana. La bacteria al. M. secretar la deformina o “factor deformante” induce la invaginación intraeritrocitaria,. FA R. también utiliza los flagelos unipolares con las células endoteliales, en esta etapa se requiere el concurso de la bacteria. Dentro de los eritrocitos la bacteria se reproduce pero. DE. en una intensidad menos que en los endotelios, a su vez ocurre que Bartonella. CA. bacilliformis adopta un cambio morfológico a medida que avanza la enfermedad de forma. TE. bacilar a forma cocoide. Sin embargo la parasitación eritrocítica no es la causa de la. IO. generación de la fase grave de la enfermedad. La acción de los macrófagos y. BL. polimorfonucleares, fagocitando a los eritrocitos infectados empieza en esta fase,. BI. produciéndose el síndrome anemizante grave (1) (4) (5) (8) (19).. Tradicionalmente el cuadro clínico de la enfermedad se ha dividido en tres fases: Fase aguda o hemática, Fase intercalar, Fase eruptiva o verrucosa; aunque como plantea Ciro Maguiña en sus trabajos de investigación se puede ir mucho mas allá de esto encontrándose las siguientes características clínicas: Asintomático, Fase aguda leve, Fase aguda clásica no complicada, Fase aguda clásica complicada, Fase Aguda recurrente, Fase aguda y luego fase eruptiva, Fase eruptiva sin fase aguda, Fase eruptiva y luego retroceccion aguda, Fase eruptiva recurrente, basándose sin lugar a dudas a los diferentes. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. estadios que puede presentar la persona presentando algunos de ellos y otros no. (5) (11) (17) (19).. Los seres humanos defienden constantemente su integridad biológica frente a agresiones procedentes del exterior, asi como también del propio organismo, de no ser asi morirían como consecuencia de tumores o infecciones causadas por bacterias, virus y hongos. Para que estos sistemas de defensa se lleven a cabo, los organismos disponen de un conjunto de sistemas especiales, conocidos como sistema inmune que es altamente. IC A. especifico y se basa en el reconocimiento de materiales exógenos como extraños para el. UI M. cuerpo, denominándose antígenos a toda las sustancias asi reconocidas (2) (8) (16) (21).. Q. Existen dos categorías mayores de antígenos bacterianos que provocan respuestas. BI. O. inmunitarias: Endotoxinas, que forman parte integral de la pared celular microbiana de las. Y. bacterias gram negativas y las exotoxinas, que son secretadas activamente por las. AC IA. bacterias gram positivas y Vibrio cholerae. Las paredes de las bacterias Gram negativas contienes tres componentes que yacen exterior a la capa peptidoglucano: lipoproteína,. FA R. M. membrana externa y lipopolisacárido (LPS) (2) (9) (12) (16).. El LPS se caracteriza por su toxicidad para los animales, se le ha denominado. DE. endotoxina de las gram negativas debido a que esta unido firmemente a la superficie. CA. celular y sólo es liberado cuando las células son lisadas. Esta constituído por tres. TE. fracciones: Lípido A hidrofóbico (actividad tóxica); la porción central del polisacárido. IO. (antígeno común); y el polisacárido específico “O” (altamente variable) (2) (7) (9) (15). BI. BL. (16).. El LPS proveniente de la degradación de la célula patógena por acción de los macrófagos y otras células fagocíticas, tiene una actividad fundamental en la activación de los macrófagos mediante receptores específicos. El macrófago activado secreta principalemte el Factor de Necrosis Tumoral alfa (FNT-α) que. juega un papel. importantísmio en el denominado Shock endotóxico o Shock séptico, caracterizado por una inflamación sistémica, lesiones en múltiples órganos, colapso circulatorio y muerte (2) (7) (9).. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Por otro lado se sabe que la anemia intensa que sufren los pacientes carriónicos llega hasta valores de 1 millon de eritrocitos, no produciéndose Shock endotóxico. El paciente carriónico muere debido a la anemia aguda intensa y/o complicaciones de la misma enfermedad, jugando un papel importante el estado inmunológico del paciente (19).. Por todo lo descrito nos propusimos plantearnos el siguiente problema.. IC A. PROBLEMA: ¿Qué efecto produce el Lipopolisacárido de Bartonella bacilliformis sobre los macrófagos. Q. UI M. de Cavia porcellus con hipersensibilidad retardada?. BI. O. HIPÓTESIS:. Y. El lipopolisacárido de Bartonella bacilliformis sobre los macrófagos de Cavia porcellus. BI. BL. IO. TE. CA. DE. FA R. M. el lipopolisacárido de Salmonella sp.. AC IA. con hipersensibilidad retardada no causa la muerte de los macrófagos como sí sucede con. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II. MATERIALES Y MÉTODOS 1. MATERIAL 1.2.. Material biológico. Se utilizaron cepas bacterianas de Bartonella Bacilliformis, y de Salmonella sp, donadas por la cátedra de Toxicologia de la Facultad de Farmacia y. IC A. Bioquímica y la Escuela de Microbiología, de la Universidad Nacional de Trujillo; y 12 Cavia porcellus, entre 3 y 4 meses y pesos promedios de 300 y. Q. UI M. 400 g.. Material y Equipo de Laboratorio:. Y. BI. O. 1.3. AC IA. - Agujas Nª 21. - Algodón estéril.. M. - Asa bacteriológica.. FA R. - Jeringas de tuberculina.. -Jeringa Hipodermica de 5 y 10 ml. DE. - Laminas porta objetos.. CA. - Material de uso común en el laboratorio.. TE. - Pipetas Pasteur. - Placas Petri.. BL. IO. - Tubos para cultivo.. BI. - Tubos de ensayo.. 1.4. Reactivos. -. Aceite de cedro.. -. Aceite de oliva.. -. Acido Tricloroacético al 3%.. -. Agua bidestilada.. -. Agua destilada.. -. Alcohol: metílico, etílico, yodado.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Ampolla de gentamicina. -. Colorante Wright.. -. Histopaque 1.077.. -. Solución Buffer fosfato a pH 7.2. -. Solución de EDTA disódico al 10%. -. Solución de Hank’s.. -. Solución Salina Fisiológica estéril.. -. Suero fetal de ternera.. Medios de cultivos. UI M. 1.5. IC A. -. Agar Salmonella - Shigella. -. MEM (Minimal Esencial Médium-Sigma Diagnosting – USA). -. Agar sangre cerebro corazón. Equipos. AC IA. 1.6. Y. BI. O. Q. -. Autoclave Boeckel-Philadelpfia P.A. -. Balanza analítica Ainsworth.. -. Cenrtrifuga Hocttic.. -. Congeladora Scien Temp.. -. Equipo de baño María Prescisterm S-140. -. Equipo de Filtración Bacteriológica Millpore. -. Estufa Memmert.. -. Incubadora Lab –Line.. -. Microscopio Binocular Leite.. -. Agitador magnético. BI. BL. IO. TE. CA. DE. FA R. M. -. 2. MÉTODOS Y TÉCNICAS. 2.1. Distribución de los grupos de trabajo. Se trabajó con 12 ejemplares de Cavia porcellus (cobayos), aparentemente sanos; siguiendo el criterio del azar se dividió en Sub grupos denominados A, B y C, cada uno con cuatro ejemplares. El subgrupo A es testigo, el Subgrupo. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. B, se le administrará LPS de Barnella bacilliformis y al Sub grupo C se le administrará en LPS de Salmonella sp.. 2.2. Cultivo de Bartonella bacilliformis.. En medio agar sangre-cerebro corazón,. se cultivó la cepa de Bartonella. bacilliformis. El cultivo se llevó a incubación a 28°C durante 8-15 dias. Luego. IC A. se hizo una resiembra en medio cerebro-corazón y medio Mínimo Esencial. El. UI M. cultivo se llevó a incubación a 28°C durante 8 días, para luego proceder a la. O. Cultivo de salmonella sp.. Y. BI. 2.3. Q. obtención del lipopolisacárido.. AC IA. En caldo peptonado estéril se cultivó la cepa de Salmonella sp. El cultivo se. M. llevará a incubación a 37ªC durante 24 horas.. Obtención del lipopolisacárido (LPS) – Método para ambas cepas. FA R. 2.4. DE. bacterianas.. CA. Se realizó en paralelo a la obtención del LPS de Salmonella sp, y de Bartonella. TE. b., por el mismo método.. IO. Se tomó 10 mL del cultivo respectivo en caldo de Bartonella b., se centrifugó. BL. a 3000 rpm. por 10 minutos. Se eliminó el sobrenadante (3veces) hasta obtener. BI. un sedimento homogeneo. Se diluyó en 5 ml de solución salina fisiológica (SSF). Se sometió a la nueva suspensión de Bartonella b. a distintas temperaturas utilizando estufa (50º C) y congeladora (4º C) alternadamente cada media hora (5 veces). Luego de realizada esta operación se centrifugó y se eliminó el sobrenadante. Al sedimento total se le agregó una solución de ácido tricloroacético (3%), en un volumen igual al 10% del volumen del caldo del cultivo del cual procedió. Luego se le agregó agua bidestilada (5 ml) se le dejó por 30 minutos. Luego se agitó por 72 horas.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En un matraz previamente esterilizado de 250 mL con 200 mL de solución buffer fosfato pH 7.2 se sumergió en una bolsa de diálisis conteniendo el sobrenadante de la solución de lipopolisacárido antes descrita y se agitó por de 72 horas. La solución de buffer fosfato se cambió cada 24 horas. El lipopolisacárido obtenido se depositó en viales tapados con torundas de algodón previamente esterilizados los que serán llevados a la estufa a 42ªC. Preparación de las suspensiones de LPS. UI M. 2.5. IC A. para eliminación del liquido por evaporación.. Con el LPS obtenido en la fase anterior, se cuantificó el lipopolisacárido. Q. obtenido y luego se preparó la suspensión oleosa para la que se utilizó aceite. Y. BI. O. de oliva, llevándola a una concentración de 0,1 mg/ml de LPS.. Sensibilización de los animales de experimentación. AC IA. 2.6. M. Se administró por vía intradérmica a cada uno de los animales de. FA R. experimentación del subgrupo B (para el LPS de Salmonella sp.) y del subgrupo C (para el LPS de Bartonella bacilliformis), la solución a una dosis. CA. DE. de 0.01 mg/kg p.c.. Siembra y Cultivo de Linfocitos. IO. TE. 2.7. BI. BL. 2.7.1 Purificación de linfocitos T y B. Transcurrido el tiempo requerido para la sensibilización de los cobayos (10 días), se procedió a la purificación de los linfocitos, según la técnica descrita por SIGMA DIAGNOSTICS. En un tubo de centrifuga de 15 ml, se añadió 3.0 ml de histopaque 1.077, se dejó que alcance la temperatura ambiente. Luego se le añadió 3 ml de sangre total extraída por punción cardiáca, dejando caer por las paredes del tubo para evitar mezclar con el histopaque; las jeringas utilizadas para la extracción contenían 0.3 ml de solución EDTA disódico, preparada al 10%.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Al tubo del paso anterior se llevó a centrifugación a 1200 rpm por 30 minutos, se desechó el sobrenadante hasta una interfase blanca lechosa, la que contiene a los linfocitos T y B sensibilizados. Esta interfase se extrajo con pipetas Pasteur y se depositó sobre la lámina portaobjetos que se encuentran dentro de cámaras de cultivo estéril. Se realizó dos cultivos para cada grupo (Salmonella y Bartonella). IC A. 2.7.2 Inducción de la Transformación linfoblástica. UI M. En la lámina portaobjeto de las cámaras de cultivo del paso anterior se agregó IV gotas de suspensión acuosa de LPS de Bartonella b.. Q. (antígeno), después se añadió 2 ml de MEM (Minimal Tagle Médium). BI. O. con gentamicina 80 mg/2ml, se incubó a 37ªC durante 96 horas.. Y. Luego se fijó la lámina con metanol por 5 minutos, se agregó el. AC IA. colorante Wright diluido 1 ml por 9 ml de buffer fosfato a pH 7.2 se dejó reposar por 30 minutos, luego se lavó la lámina con agua a chorro,. M. se dejó secar a temperatura ambiente y se procedió a la lectura en un. FA R. microscopio óptico.. Siembra y Cultivo de Macrófagos. CA. DE. 2.8. IO. TE. 2.8.1 Migración de Macrófagos a la zona peritoneal. BI. BL. Transcurrido el tiempo requerido para la sensibilización de los cobayos (10 días). A cada especímen por grupo se le administró via intraperitoneal 5 ml de solución de Hank’s por tres días (previos al sacrificio del animal) cada 24 horas.. Este tratamiento ocasiona. migación de macrófagos a la zona peritoneal.. 2.8.2 Extracción y Cultivo de Macrófgos. Después de 24 horas de la última administración de la solución de Hank’s, por la misma zona vía intraperitoneal se le administró 5 mL de MEM. Luego de 5 minutos se precedió al sacrificio del animal (abrir. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. asépticamente el abdomen) para extraer exudado peritoneal con una pipeta Pasteur. Se depositó sobre la lámina portaobjetos que se encuentran dentro de cámaras de cultivo estéril.. 2.8.3 Inducción de la activación de Macrófagos. En la lámina portaobjeto del paso anterior se agregó IV gotas de suspensión acuosa de cultivo de Bartonella b., después se añadió 2 ml. IC A. de MEM (Minimal Tagle Médium) con gentamicina 80 mg/2ml, se. UI M. incubará a 37ªC durante 24 horas.. Luego se fijó la lámina con metanol por 5 minutos, se agregó el. Q. colorante Wright diluido 1 ml por 9 ml de buffer fosfato a pH 7.2 se. BI. O. dejó reposar por 30 minutos, luego se lavó la lámina con agua a chorro,. Análisis de los resultados. FA R. M. 2.9. AC IA. microscopio óptico.. Y. se dejó secar a temperatura ambiente y se procedió a la lectura en un. En el microscopio se observó la presencia de macrófagos activados o no. DE. (lisados o no, respectivamente) expuestos ante el LPS de Bartonella. CA. bacilliformis y los macrófagos expuestos ante el LPS de Salmonella sp,. TE. describiendo las carácterísticas morfológicas de los mismos... IO. Se observó y cuantificó en el microscopio a 100 campos la presencia de. BL. linfocitos transformados (linfoblastos), para el cultivo de Bartonella. BI. bacilliformis y Salmonella sp.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III. RESULTADOS. Los resultados obtenidos en el presente trabajo de investigación, es exponen en las tablas 1, 2, 3 y 4; y las figuras 1, 2, 3 y 4.. IC A. En la tabla 1, se expone el recuento porcentual de linfocitos transformados (de Cavia. UI M. porcellus) in vitro, a las 96 horas de incubación enfrentados al antígeno soluble de Bartonella. BI. O. Q. bacilliformis.. Y. En la tabla 2, se expone el recuento porcentual de linfocitos transformados (de Cavia. AC IA. porcellus) in vitro, a las 96 horas de incubación enfrentados al antígeno soluble de Salmonella. FA R. M. sp.. DE. En la tabla 3, se describen las características morfológicas de los macrófagos del. TE. CA. Grupo B enfrentados a la suspesión soluble de Bartonella bacilliformis.. IO. En la tabla 4, se describen las características morfológicas de los macrófagos del. BI. BL. Grupo C enfrentados a la suspensión soluble de Salmonella sp.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 1: Recuento porcentual de linfocitos transformados (de Cavia porcellus) in vitro, enfrentados al antígeno soluble de Bartonella bacilliformis a las 96 horas de incubación.. Nº DE LINFOCITOS TRANFORMADOS ESPECÍMEN DEL GRUPO B. B–1. 125. B–2. IC A. POR 100 CAMPOS MICROSCÓPICOS. UI M. 121 123. AC IA. Y. BI. O. Q. Promedio. M. Tabla Nº 2: Recuento porcentual de linfocitos transformados (de Cavia porcellus) in vitro. CA. DE. FA R. enfrentados al antígeno soluble de Salmonella sp, a las 96 horas de incubación.. Nº DE LINFOCITOS TRANFORMADOS POR 100 CAMPOS MICROSCÓPICOS. C–1. 130. C–2. 128. Promedio. 129. BI. BL. IO. TE. ESPECÍMEN DEL GRUPO C. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 3: Características morfológicas de los Macrófagos del Grupo B enfrentados a la suspensión soluble de Bartonella bacilliformis, a las 24 horas de incubación.. CARACTERÍSTICA. DESCRIPCIÓN. Tamaño. Ligeramente. IC A. variados. UI M. tamaños.. agrandados,. Casi circular. Membrana Citoplasmática. Membrana delimitada con pequeñas. BI. O. Q. Forma. AC IA. Y. deformaciones. Variable de acuerdo a. FA R. M. Núcleo. macrófago. Se observan células de Bartonella b (forma cocoide). es su inerior.. BI. BL. IO. TE. CA. DE. Citoplasma. la forma del. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 4: Características morfológicas de los Macrófagos del Grupo C enfrentados a la suspensión soluble de Salmonella sp, a las 24 horas de incubación.. DESCRIPCIÓN. Tamaño. Sumamente agrandados y variados de. UI M. tamaño. IC A. CARACTERÍSTICA. Diversidad de formas.. Membrana Citoplasmática. Muy. O. Q. Forma. BI. poco. delimitado.. Presenta. AC IA. Y. deformaciones a todo nivel. Núcleo. Presenta variedad de formas y tamaños. Presenta grandes y pequeñas rupturas y deformaciones.. BI. BL. IO. TE. CA. DE. FA R. M. Citoplasma. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Microfotografía de Macrófagos de Cavia porcellus (Grupo B) enfrentado a. Q. Figura 1:. UI M. IC A. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. BI. O. Bartonella bacilliformis.Se observan llenos de celulas de Bartonella bacilliformis en forma. Macrófago activado. BI. BL. IO. TE. CA. DE. FA R. M. AC IA. Y. cocoides. (Aumento 100x). Figura 2: Microfotografía de Macrófago de Cavia porcellus (Grupo C) enfrentado a Salmonella sp. (Aumento 100x). Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UI M. IC A. Linfoblasto. Linfoblasto. BI. BL. IO. TE. CA. DE. FA R. M. AC IA. Y. BI. O. Q. Linfoblasto. Figura 3: Microfotografía de linfoblastos en uno de los ejemplares del Grupo B tratados con las suspensión oleosa de LPS de Bartonella bacilliformis. (Aumento 100x). Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Linfocito en mitosis. BI. BL. IO. TE. CA. DE. FA R. M. AC IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. Linfoblasto. Figura 4: Microfotografía de linfoblastos en uno de los ejemplares del Grupo C tratados con las suspensión oleosa de LPS de Salmonella sp. (Aumento 100x). Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV.. DISCUSIÓN. Con el propósito de prolongar el estímulo antigénico (debido a que el lipopolisacárido posee poco de esta actividad) se utilizó el aceite de oliva que está dentro de la clasificación de los productos denominados ayudante o coadyuvantes, que favorecen o aumentan la respuesta. IC A. inmunitaria. Estos no forman uniones estables con el inmunógeno (liposomas) y se requiere solo en la inmunización inicial. Su mecanismo de acción consiste en inducir reacciones. UI M. inflamatorias locales, que en los macrófagos y células presentadoras de antígenos se asocian. Y. BI. O. Q. con una mayor expresión de coestimuladores, asi como la expresión de citocinas (21).. AC IA. En la Tabla 1, se presenta el recuento de linfocitos transformados (linfoblastos) del Grupo B, los cuales fueron previamente sensibilizados con el lipopolisacárido (LPS) de. FA R. M. Bartonella bacilliformis. Los cultivos in vitro se dejaron por 96 horas puesto que es el tiempo óptimo de desarrollo, según lo demuestran trabajos realizados sobre transformación. TE. CA. DE. linfoblástica (6) (18).. IO. Este dato (123 linfoblastos por 100 campos), de un alto nivel de transformación. BL. linfoblástica, evidencia que se ha producido la sensibilización de los linfocitos inducida por el. BI. antígeno (LPS), lo que da lugar a la expansión clonal, por la cual proliferan dando origen a una gran número de linfocitos con un receptor idéntico y específico capaz de reconocer únicamente al antígeno que inició su activación (2) (9) (14) (16).. En la Tabla 2 también se presenta un alto número de linfoblastos (129 por 100 campos), lo que indica que el LPS de Salmonella sp. causó también una antigenización óptima.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Este resultado se debe a que el antígeno (LPS) tanto de Bartonella bacilliformis como de Salmonella sp., se encontró recubierto por las suspensión oleosa de aceite de oliva, formando un liposoma, en que le permitió una mejor llegada y permanencia por mas tiempo del antígeno en los vasos y ganglios linfáticos. Además el porcentaje obtenido de linfocitos tansformados de este subgrupo nos indica que la suspensión oleosa de LPS de ambas bacterias. IC A. produjo un significativa sensibilización de linfocitos (linfoblastos) (2) (9) (21).. UI M. La hipersensibilidad retardada (HR) es una manifestación de la inmunidad celular,. Q. definiéndose como un aumento de reactividad a antígenos específicos por parte de linfocitos. BI. O. T, los cuales al ser sensibilizados elaboran linfocinas que inducen reacciones inflamatorias,. AC IA. Y. así como la atracción y activación de macrófagos por intermedio principalmente de Interferon gamma (IFN-γ). El desarrollo de una reacción de HR, también va a depender del. FA R. M. reclutamiento de otras células fagocíticas no específicas y de la colaboración con una o varias poblaciones derivadas de la médula ósea, tales como: monocitos/macrófagos, basófilos,. DE. neutrófilos y en algunas instancias eosinófilos. Los mecanismos de esta reacción son. CA. complejos e incluyen diversas citocinas que amplifican mecanismos de retroalimentación para. TE. su producción. El procesamiento inicial de antígeno va acompañado de suficiente producción. BL. IO. de IL-1 en los macrófagos para estimular la activación de células CD4+ conocedora de. BI. antégenos (colaboradoras). La retroalimentación de linfocinas de las células T CD4+ a los macrófagos aumenta aún más la producción de IL-1. La Il-2 producida por las células T CD4+ facilita su expansión clonal y activa los linfocitos T CD8+ (citotóxicos). Dentro de los linfocitos T CD4+ existe una subpoblación denominada linfocitos de memoria o coadyuvantes (Th-1) los cuales son los responsables del reconocimiento del antígeno y son los que al mismo tiempo liberan linterleucina-2 (IL-2), que mediante procesos autocrinos y paracrinos estimulan la proliferación de linfocitos (2) (8) (16) (21).. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La IL-2 es producida por las células T CD4+ y en menor cuatía por las células T CD8+ activadas y las células naturales asesinas (NK), esta interleucina es la principal y más potente citocina responsable del crecimiento y activación de los linfocitos T y B en células T y B respectivamente. La IL.2, estimula también la síntesis de otras citocinas producidad porn las. IC A. células T, como el INF- γ y la linfotoxina (LT) (2) (8) (16) (21).. UI M. El INF- γ es un potente activador de los fagocitos mononucleares por lo que aumenta. Q. la expresión de moléculas del CMH de calse II favoreciendo la presentación del antígeno. El. BI. O. INF- γ actúa sobre los linfocitos T favoreciendo su diferenciación, así también es la citocina. AC IA. Y. requerida para la maduración de los linfocitos T citolíticos (LTC o CD8+) y para la estimulación de la actividad citolítica de las células NK. Esta citocina es producida por las. FA R. M. células T CD4+, T CD8+ y por las células NK (2) (8) (16) (21).. DE. Los resultados en las tablas 1 y 2 nos permite afirmar que la linfoblastogenesis se debe. CA. exclusivamente a la atigenicidad del LPS y la respuesta inmune de Cavia porcellus, como. BL. IO. TE. también lo demuestran trabajos anteriores realizados con el LPS como antígeno (6) (18).. BI. En la tabla 3 se describen las características de los macrófagos activados enfrentados con Bartonella bacilliformis. A la vez en la Figura 1 se observan macrófagos activados, los cuales están invadidos con la forma cocoide de Bartonella bacilliformis. Los macrófagos presentan variados tamaños, casi agrandados, con la membrana citoplasmática con ligeras deformaciones, con un núcleo de formas variadas de acuerdo a la forma del macrófago (7).. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En la tabla 4 se anotan las descripción de los macrófagos sensibilizados enfrentados con Salmonella sp. Y también se puede obervar en la figura 2, en el cual se halla un macrófago con deformaciones y pérdida de citoplasma, lo que indica que el LPS de bartonella ha causado la muerte de los mismos.. Los lipopolisacáridos bacterianos, también llamados endotoxinas, son inductores de la. IC A. síntesis y secreción de diversas citocinas necesarias para la activación de los mecanimos. UI M. innatos de defensa en la erradicación de los procesos infecciosos, pero a la vez son potentes. Q. agentes proinflamatorios e inductores de la muerte (por procesos de apoptosis) de los. BI. O. macrófagos principalmente a través de la producción autocrina del Factor de necrosis tumoral. AC IA. Y. alfa (TNF-α). Este mismo produce la muerte indiscriminada de tejido celular (7) (15).. FA R. M. La activación de los macrófagos es un proceso complejo y estrictamente controlado que consiste en una serie de modificaciones morfológicas, bioquímicas y funcionales que. DE. culminan en el aumento del potencial de la célula para ejercer funciones complejas, tales. CA. como la presentación de antígenos, la lisis de células tumorales y la actividad bactericida. Los. TE. agentes más potentes en la activación de los macrófagos son la citocina IFN-γ y el. BI. BL. IO. lipopolisacárido (LPS) (7) (8).. El LPS es parte de los residuos celulares provocados por la fagocitosis. Estos al ser liberados a la circulación se unen a una proteína plásmática de unión de lipopolisacáridos (LPB), a través del lipido A del LPS. Luego es presentadon al receptor CD14, una glicoproteína anclada a una molécula de glicofosfatidilinositol (GPI) en la membrana de macrófagos. Esta a su vez esta asociada al complejo proteíco que incluye a una de las proteínas involucradas en la transducción que son las proteínas transmembranales tipo Toll,. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. siendo la TLr4 la proteína transductora de la actividad de los LPS. Todo ello lleva a la activación de los macrófagos y los procesos febriles inflamatorios y de Shock séptico (en el caso grave). (2) (7) (8).. Como se señaló, la producción autocrina de TNF-α de los macrófagos activados por LPS, produce la muerte celular a través de procesos de apoptósis. Ésta se produce de manera. IC A. rápida y ordenada, iniciandose con la fragmentación del DNA. Este resultado se observa con. UI M. el LPS de Salmonella sp. Sin embargo no se ve este resultado con el LPS de Bartonella. Q. bacilliformis. Esto es debido posiblemente a una degradación total del LPS por parte del. BI. O. macrófago y una peculiaridad morfológica de la bacteria. La nula actividad del LPS de. AC IA. Y. Bartonella bacilliformis permitiría responder al porque no se genera un shock séptico en los enfermos carriónicos a pesar de la intensa actividad de eritrofagocitosis (llegando a 1 millon. FA R. M. de eritrocitos). Como se apunta en trabajos anteriores el LPS no es un factor importante en la. BI. BL. IO. TE. CA. DE. patología de la enfermedad de Carrión (3) (7) (8) (19).. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. V.. CONCLUSIONES. Del análisis de los resultados se concluye que: 1.- El lipopolisacárido de Bartonella bacilliformis no causa la muerte de los macrófagos y por tanto no juega una papel importante en el desarrollo en la enfermedad de Carrión.. BI. BL. IO. TE. CA. DE. FA R. M. AC IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. 2. El lipopolisacárido de Salmonella sp. causó la muerte de los macrófagos.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. VI.. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1. Abanto J., Barreto J. Infección experimental con Bartonella bacilliformis en Cavia porcellus y Mus musculus: Efectos histopatológicos. Tesis para optar al Título Profesional de QUÍMICO FARMACÉUTICO. Trujillo. 200. p, 25-29.. IC A. 2. Abbas A., Lichtman M. Inmunología Celular y Molecular. 5º Ed. ED. Elsevier.. UI M. Madrid. 2004. p, 254 – 268.. Q. 3. Aguilar R., Huiman C. Efecto de la suspensión oleosa del lipopolisacárido de. BI. O. Salmonella Typhi sobre carcinogénesis química inducida con 3,4 benzopireno. Y. administrado por vía subcutánea en Mus musculus var. Swiss. Tesis para optar al. AC IA. Título Profesional de QUÍMICO FARMACÉUTICO. Trujillo. 2003. p, 30-33.. M. 4. Andersen-Nissen E., Smith K. D., Strobe K. L., Barrett S. L. R., Cookson B. T., Logan. FA R. S. M., Aderem A. (2005). Evasion of Toll-like receptor 5 by flagellated bacteria. Proc.. DE. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102: 9247-9252.. CA. 5. Benson L. Entry of Bartonella bacilliformis into erythrocytes. Infect Immun.. TE. 1986;54:347–353.. IO. 6. Cañola L., López I. Efecto de la suspensión oleosa de Lipopolisacárido de Salmonella. BI. BL. enteritidis sobre la transformación linfoblástica en Cavia porcellus. Tesis para optar al Título Profesional de QUÍMICO FARMACÉUTICO. Trujillo.2001. p, 30-35. 7. Comalada M. Decisiones en los macrófagos, proliferar, activarse o morir. Tesis Doctoral. Madrid. 2002. p, 41-53; 221-222. 8. Cruzado J. Hipersensibilidad retardada inducida con membrana de Bartonella bacilliformis en Mus musculus var. Swiss y su efecto sobre la infección experimental. Tesis de Maestría. Trujillo. 2008. p, 1-3;16-18.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

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