Comparación de antígenos de excreción/secreción y del líquido seudocelómico de Toxocara canis mediante Western Blot utilizando IgG producidos en Oryctolagus cuniculus

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. A. Y. CO. M. UN I. CA. CI. Ó. N. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. ÁT IC. Comparación de antígenos de excreción/secreción y del líquido. RM. seudocelómico de Toxocara canis mediante Western Blot utilizando. AS. DE. IN. FO. IgG producidos en Oryctolagus cuniculus. TE. M. Tesis para optar el título de. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. BIÓLOGO. Br. MIRTHA NOHEMÍ CHUYO ZAVALETA TRUJILLO – PERÚ 2014. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N. DEDICATORIA. CI. Ó. A Dios, por haberme permitido llegar a este. UN I. CA. momento tan especial en mi vida, por. enseñarme. el. camino. A. correcto de la vida, fortaleciéndome y. CO. por. Y. objetivos,. M. haberme dado salud para lograr mis. ÁT IC. guiándome cada día para vencer los. IN. FO. RM. obstáculos.. DE. A mis padres: Nancy y Manuel por su amor,. M. AS. comprensión y apoyo incondicional, quienes. para hacer posible la culminación de mi carrera profesional. A ellos toda la gratitud y los logros de mi vida.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. supieron orientarme con trabajo y sacrificio. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTOS Expreso mi más sincero agradecimiento:. N. A los Docentes de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional. CI. Ó. de Trujillo, por sus conocimientos compartidos, amistad y apoyo en forjarme. UN I. CA. como profesional.. M. A los miembros de mi Jurado por su paciencia y apoyo incondicional en la. Y. CO. elaboración del presente trabajo de investigación.. Jara Campos por compartir desinteresadamente sus. ÁT IC. A. Al profesor César. conocimientos y experiencia en la elaboración del presente trabajo de. FO. RM. investigación. A él mi más sincero aprecio y admiración.. IN. Al Dr. Enrique A. Martín Alva por sus consejos y por compartir. DE. desinteresadamente sus amplios conocimientos. A él mi más sincero aprecio y. M. AS. admiración por ayudarme en mi formación académica.. TE. A mi amiga Miluska C. Malca Camacho que desde el inicio de mi carrera. SI S. profesional estuvo presente conmigo; brindándome su amistad y apoyo en mi. DE. formación profesional, gracias por tu amistad que hasta el momento seguimos. CC. IO. N. cultivando.. RE. A mi amiga Rosa E. Horna Lavado por compartir tus experiencias de vida para. DI. poder tomarlas como ejemplo, por colaborar con la elaboración, culminación del presente trabajo de investigación y brindarme tu amistad de manera desinteresada.. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. Ó. N. Dr. ORLANDO VELÁSQUEZ BENITES. CO. M. UN I. CA. CI. Rector de la Universidad Nacional de Trujillo. A. Y. Dra. VILMA JULIA MÉNDEZ GIL. DE. IN. FO. RM. ÁT IC. Vicerrector Académico de la Universidad Nacional de Trujillo. M. AS. Dra. FLOR MARLENE LUNA VICTORIA MORI. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. Vicerrector Administrativo de la Universidad Nacional de Trujillo. Dr. SANTIAGO ALBERTO UCEDA DUCLOS Secretario General de la Universidad Nacional de Trujillo. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. Ó. N. Dr. JOSÉ MOSTACERO LEÓN. Y. A. Dr. FREDY MEJÍA COICO. CO. M. UN I. CA. CI. Decano de la Facultad de Ciencias Biológicas. IN. FO. RM. ÁT IC. Secretario Decano de la Facultad de Ciencias Biológicas. DE. Dr. MANUEL FERNANDEZ HONORES. Dr. FREDY PELÁEZ PELÁEZ. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. Jefe del Departamento Académico de Ciencias Biológicas. DI. RE. CC. Director de la Escuela Académico Profesional de Ciencias Biológicas. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CERTIFICACIÓN DEL ASESOR El que suscribe, profesor asesor de la tesis: Comparación de antígenos de. Ó. N. excreción secreción y del líquido seudocelómico de Toxocara canis. CA. CI. mediante Western Blot utilizando IgG producidos en Oryctolagus. y aplicando el. M. objetivos propuestos en el correspondiente proyecto. UN I. cuniculus, certifica que ésta ha sido desarrollada de conformidad con los. CO. método científico, igualmente el informe ha sido revisado y acoge las. RM. ÁT IC. A. Y. observaciones y sugerencias pertinentes.. FO. Por lo tanto, la Br. MIRTHA NOHEMÍ CHUYO ZAVALETA está en. ___________________________ Dr. César Jara Campos Asesor. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. DE. IN. condiciones de continuar con el trámite de reglamento correspondiente.. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO:. Ó. N. De conformidad con lo dispuesto por el reglamento de Grados y Títulos de la. CA. CI. Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, es para. UN I. mí un honor poner a vuestra consideración y criterio el presente informe de tesis. M. titulado : “Comparación de antígenos de excreción / secreción y del líquido. CO. seudocelómico de Toxocara canis mediante Western Blot utilizando IgG. Y. producidos en Oryctolagus cuniculus ”, con lo que pretendo cumplir con uno de. ÁT IC. A. los requisitos para optar el Título Profesional de Biólogo.. RM. Con la convicción de que se le otorgará el valor justo y mostrando apertura a sus. FO. observaciones, les agradezco por anticipado las sugerencias y apreciaciones que se. DE. IN. brinden a la investigación.. ______________________________________ Br. MIRTHA NOHEMÍ CHUYO ZAVALETA. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. Trujillo, Abril del 2014.. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CI. Ó. N. MIEMBROS DEL JURADO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. M. PRESIDENTE. UN I. Ms.C. Aida Esther Carbajal Villaverde. CA. ______________________________. IN. FO. ______________________________. DE. Dr.. Luis Pollack Velásquez. ______________________________ Dr. César A. Jara Campos VOCAL. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. SECRETARIO. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DECLARACIÓN DE APROBACIÓN Los profesores que suscriben, miembros del jurado examinador, declaran que el. Ó. N. presente informe de tesis ha cumplido con los requisitos formales y. CO. M. UN I. CA. CI. fundamentales, siendo aprobado por Unanimidad.. A. Y. ______________________________. ÁT IC. Ms.C. Aida Esther Carbajal Villaverde. AS. DE. IN. FO. RM. PRESIDENTE. Dr. Luis Pollack Velásquez SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. ______________________________. ______________________________ Dr. César A. Jara Campos VOCAL viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INDICE. i. Agradecimientos…………………………………………………... N. Dedicatoria………………………………………………………... Ó. Pág.. CA. CI. ii. UN I. Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo……………... M. Autoridades de la Facultad de Ciencias Biológicas……………….. iii iv v. Presentación……………………………………………………….. vi. Y. CO. Certificación del Asesor………………………………………….... ÁT IC. A. Miembros del Jurado………………………………………………. vii viii. Índice………………………………………………………………. ix. Resumen…………………………………………………………... xi. Abstract……………………………………………………………. xii. INTRODUCCIÓN……………………………………………….... 1. MATERIAL Y MÉTODOS………………………………………. 5. RESULTADOS……………………………………………………. 10. TE. M. AS. DE. IN. FO. RM. Declaración de aprobación………………………………………... SI S. DISCUSIÓN………………………………………………………. 15 20. RECOMENDACIONES…………………………………………... 21. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………. 22. IO. N. DE. CONCLUSIONES……………………………………………….... 25. ANEXO 1………………………………………………………….. 26. DI. RE. CC. ANEXOS:. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) 27. ANEXO 3……………………………………………………... 28. ANEXO 4……………………………………………………... 29. ANEXO 5……………………………………………………... 30. ANEXO 6……………………………………………………... Ó. N. ANEXO 2……………………………………………………... CI. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CA. 31 32. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. DE. IN. FO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. M. UN I. ANEXO 7……………………………………………………... x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN Se comparó a los antígenos de excreción-secreción y de líquido seudocelómico de la formas adultas de Toxocara canis mediante la técnica de “Western blot”. Ó. N. utilizando anticuerpos específicos producidos en conejo, Oryctolagus cuniculus,. CI. raza Neozelandesa inmunizado experimentalmente. Para ello, las formas adultas. CA. vivas de T. canis fueron recolectadas del intestino delgado de cachorros de Canis mínimo esencial (MiniumEssential Media –MEM Eagle-. M. medio de cultiv. UN I. familiaris “perro” infectados naturalmente, lavados con PBS y cultivados en el. CO. BioRad) durante 24 horas para obtener los productos de excreción/secreción que. Y. contengan a los antígenos y se obtuvo el líquido seudocelómico de la extracción. A. de parásitos enteros. Los anticuerpos específicos, por su parte, fueron obtenidos. ÁT IC. de los conejos por inoculación vía subcutánea, de 209.0 ug/mL productos. RM. excretados/secretados obtenidos a las 24 horas de cultivo, según esquemas previamente establecidos y de 1410 ug/mL del líquido seudocelómico.. FO. Mediante la técnica de “Western blot”, se detectaron 11 bandas antigénicas de los. IN. productos de excreción/secreción inmunodominantes cuyos pesos moleculares, en. DE. Kilodaltons (KDa), fueron: 70.7, 67.6, 39.8 ,35.4 ,30.1 ,28.2 ,21.1 ,19.1 ,17.8. AS. ,12.6 y 11.2 kDa, de los cuales cinco han sido también halladas en las larvas. M. infectivas y del líquido seudocelómico se detectaron 15 bandas antigénicas cuyos. TE. pesos moleculares, en Kilodaltons (KDa), fueron: 77.6, 70.7, 67.1, 50.1, 48.9,. SI S. 39.8, 30.1, 28.2, 26.3, 22.4, 18.2, 17.8, 12.6, 11.8 y 11.2 KDa donde también seis. DE. bandas han sido halladas en larvas infectivas por lo que podrían utilizarse las dos. IO. N. formas antigénicas en el diagnóstico de la toxocariasis humana.. CC. Se concluye que los antígenos de excreción / secreción de Toxocara canis inducen. RE. la producción de anticuerpos en conejos inmunizados experimentalmente teniendo como. propósito su uso en el. diagnóstico de Toxocariasis canis. en seres. DI. humanos.. Palabras clave: Toxocara canis, Western blot, antígenos de excreción/secreción, antígenos de líquido seudocelómico Canis familiaris. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ABSTRACT It was compared antigens excretory/secretory and seudocelomic fluid of the adult forms of Toxocara canis by the technique of " Western blot" using specific. Ó. N. antibodies produced in rabbit, Oryctolagus cuniculus , New Zealand race. CI. immunized experimentally . To this end , the live adult forms of T. canis were. CA. collected from the small intestine of infected pups naturally Canis familiaris ,. UN I. washed with PBS and grown in minimal essential culture medium ( MEM - Eagle. M. Media MiniumEssential - BioRad) for 24 hours to obtain products of excretory /. CO. secretory antigens containing and liquid extraction seudocelomic integer parasites. Y. was obtained. Specific antibodies, for their part, were obtained from rabbits by. A. subcutaneous inoculation of 209.0 ug / mL of excretory-secretory products. ÁT IC. obtained at 24 hours of culture, according to previously established patterns and. RM. 1410 ug / mL of fluid seudocelomic.. FO. Using the technique of " Western blot" , eleven antigenic bands products. IN. excretory / secretory immunodominant whose molecular weights in kilodaltons (. DE. kDa ) were detected were: 70.7 , 67.6 , 39.8 , 35.4 , 30.1, 28.2 , 21.1 , 19.1, 17.8 , 12.6 and 11.2 kDa also , five of which have been found in infective larvae and. AS. fluid 15 seudocelomic antigenic bands whose molecular weights , in kilodaltons. TE. M. ( kDa ) was detected were : 77.6 , 70.7 , 67.1 , 50.1 , 48.9 , 39.8 , 30.1 , 28.2 , 26.3. SI S. , 22.4 , 18.2 , 17.8 , 12.6 , 11.8 and 11.2 kDa which also have been found six bands in infective larvae could be used so that the two antigenic forms in human. DE. toxocariasis diagnosis .. IO. N. It is concluded that the antigen of excretion/secretion Toxocara canis induce the. CC. production of antibodies in rabbits immunized with the purposes of experimental. DI. RE. use in diagnosing of Toxocara canis in humans.. Keywords: Toxocara canis, Western blot, antigen excretion/secretion antigens fluid. seudocelomic,. Canis. familiaris,. Oryctolagus. cuniculus. xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. I. - INTRODUCCION La toxocariasis es una zoonosis parasitaria importante causada por las formas larvarias de especies de nemátodos del género Toxocara. Existen tres. CI. Ó. N. especies que infectan a Canis familiaris “perro” y a Felis catus “gato”: a gatos y Toxascaris leonina a. CA. Toxocara canis a perros; Toxocara cati. UN I. perros, gatos y otras especies relacionadas1.. M. Toxocara canis desarrolla un ciclo de vida completo en Canis familiaris. CO. “perro” menor de cinco meses, la infección comienza con la ingesta de. A. Y. huevos embrionados que se encuentran en el suelo, los cuales eclosionan y. ÁT IC. liberan las larvas llegando al intestino delgado, luego migran hasta los. RM. pulmones pasando por el árbol bronquial donde son deglutidas hasta llegar 1,2. FO. nuevamente al intestino, donde alcanzan el estadio adulto. . Una. vez. IN. ocurrida la fecundación, se liberan huevos no embrionados con las heces del. AS. DE. perro y el desarrollo del embrión ocurre en el suelo 2, 3,6.. M. Una hembra puede producir hasta 200 mil huevos al día, por lo que solo. TE. un huésped común con una carga de varios cientos de parásitos puede. SI S. contaminar el ambiente diariamente con millones de huevos. Los huevos se. DE. expulsan con las heces y no son infectantes inmediatamente2, 6,7.. IO. N. Los perros pueden infectarse con Toxocara canis de las siguientes formas:. DI. RE. CC. a) por ingestión de huevos infectantes; b) ingestión de tejidos de huéspedes paraténicos que contienen larvas; c) migración transplacentaria de larvas de la hembra preñada a sus fetos; d) pasaje transmamario de larvas contenidas en la leche de la hembra lactante; y e) ingestión de larvas de tercera etapa o de. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. adultos inmaduros contenidos en el vómito o en las heces de los cachorros infectados2, 3, 8. En el humano, cuando los huevos infectivos de estos nematodos son. CI. Ó. N. accidentalmente ingeridos la larva eclosiona en el intestino y las larvas. CA. penetran en la mucosa, migran al hígado por la vena porta, siguen los canales. UN I. vasculares hacia los pulmones y luego entran hacia la circulación sistémica y. CO. M. a los tejidos somáticos. Las larvas migran por todo el cuerpo y pueden. Y. encontrarse en cualquier tejido u órgano, incluidos el hígado, los pulmones, el. A. corazón y a los ojos, y produce las dos clásicas formas de la enfermedad: la. ÁT IC. larva migrans visceral y la larva migrans ocular11, 4, 5,8.. RM. Un fenómeno interesante es que estos parásitos no pueden evolucionar. FO. hacia formas adultas en el ser humano y quedan restringidos a su forma. DE. IN. larval, migrando durante meses e inclusive años, ocasionando reacciones. AS. inflamatorias locales o sistémicas según el órgano afectado 4, 5,6. En ocasiones,. M. el sistema inmune puede incluso matar al parásito; sin embargo, la inmunidad. TE. generada en una primera infección no logra proteger contra futuras. SI S. reinfecciones4, 7, 9.. DE. La prevalencia de la toxocariasis es elevada en países tropicales y en. IO. N. vías de desarrollo y se asocian generalmente con poblaciones de niveles. DI. RE. CC. socioeconómicos bajos. En Perú existen pocos registros de los cuales indican frecuencias de 7.8 a 20 % en poblaciones rurales y 40 % en individuos con sospecha de toxocariasis ocular2, 6,10. El diagnóstico clínico de la infección humana por Toxocara canis resulta dificultoso debido a que la sintomatología es inespecífica y similar a la de. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. otras patologías, al mismo tiempo el parásito adulto no se encuentra en el intestino del ser humano debido a que las larvas no completan su evolución y no llegan a la postura de huevos, lo cual torna imposible el diagnóstico . El método alternativo y factible es el diagnóstico indirecto. N. 11. CI. Ó. coprológico. UN I. herramienta más útil y confiable para su diagnóstico 6, 8,10. CA. mediante la demostración de anticuerpos específicos en suero siendo esta. CO. M. El diagnóstico indirecto de la toxocariasis se realiza comúnmente. Y. mediante ELISA con diferentes tipos de antígenos, entre ellos los de E/S que. “Western Blot” que es básicamente un proceso cualitativo. RM. de la técnica de. ÁT IC. A. han demostrado elevada especificidad sin embargo, se está optando por el uso. FO. que combina la selectividad de la electroforesis en gel de poliacrilamida con. IN. la sensibilidad de inmunoensayos, permitiendo a las proteínas individuales. DE. reaccionar con los anticuerpos formando un complejo que es evidenciado por. M. AS. una prueba inmunoenzimática 10,12,13.. Chuyo. SI S. accesibles,. TE. Con el propósito de buscar fuentes antigénicas de Toxocara canis más y. Jara. 15. detectaron. cinco. bandas. antigénicas. DE. inmunodominantes de antígenos de formas adultas cuyos pesos moleculares. IO. N. fueron de 79.4, 70.8, 32.1, 31.6 y 28.2 kDa utilizando la técnica de Western 16. utilizaron el líquido seudocelómico. DI. RE. CC. Blot posteriormente, Colina et al. detectando bandas de 125.8 – 64.6 y de 57.5 – 9.1 KDa que podrían usarse en el diagnóstico serológico de la toxocariasis humana. La obtención de las formas larvarias requiere del aislamiento de las hembras grávidas, separación de huevos, periodos de embrionamiento que. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. oscilan entre 30 a 40 días con soluciones como el formol al 2% o SSF al 0.85 % 17,18,19con observaciones diarias y posterior liberación de las larvas siendo el. procedimiento 20,21. la. obtención. de. antígenos. de. , debe reclutarse miles de larvas vivas para poder. CI. Ó. excreción/secreción. para. N. laborioso. CA. obtener sus productos de excreción/secreción suficientes para ejecutar la. UN I. técnica de Western Blot o ELISA 22,23,24 ante ello se tiene como alternativa los. CO. M. antígenos de adultos, cuya obtención es relativamente fácil o los antígenos del. Y. líquido seudocelómico que tiene la ventaja que puede obtenerse parásitos. ÁT IC. A. vivos o conservados. Sin embargo se desconoce cuál de las dos fuentes de antígenos expone bandas más reactivas y compatibles con los usados en el. RM. diagnóstico por lo que la presente investigación estuvo dirigida a determinar. FO. cuáles son las bandas que comparten los antígenos de excreción/secreción y. DE. IN. del líquido seudocelómico de formas adultas de Toxocara canis mediante. AS. Western Blot utilizando IgG producidos en Oryctolagus cuniculus que sirvan. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. para el inmunodiagnóstico de la toxocariasis humana.. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. II.- MATERIAL Y MÉTODOS 1. Material Biológico: 60 ejemplares adultos de Toxocara canis encontrados en Canis familiares. N. . CI. Ó. “perro”, obtenidos del Mercado Zonal Palermo de la ciudad de Trujillo de. UN I. 02 ejemplares de Oryctolagus cuniculus “Conejo” Raza Nueva Zelanda. M. . CA. 2 a 3 meses de edad para obtener los antígenos de excreción/secreción.. CO. de 3 meses de edad obtenidos del Bioterio del Instituto de Salud del Perú. Y. (INS) para la producción de anticuerpos a los distintos antígenos de. ÁT IC. A. excreción/secreción de adultos y de líquido seudocelómico de Toxocara. RM. canis (La ejecución del proyecto se realizó en el Laboratorio “Libertad” de. 2. Métodos:. excreción/secreción de ejemplares adultos de. AS. 2.1.1 Antígenos de. DE. 2.1. Obtención de antígenos:. IN. FO. la ciudad de Trujillo).. TE. M. Toxocara canis. SI S. Del intestino delgado de 5 perros infectados con Toxocara canis se. DE. recolectaron 50 ejemplares adultos del parásito (Anexo 5a) de los. DI. RE. CC. IO. N. cuales solo se utilizaron 40 ejemplares que fueron lavados cuatro veces con PBS pH 7.2 estéril adicionándose. penicilina y. gentamicina, Los ejemplares adultos de Toxocara canis una vez desinfectados fueron colocados en cada placa de Petri (8 parásitos en 5 placas) conteniendo medio mínimo esencial o mínimo esencial (Minium. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Essential Media - MEM) para obtener así los antígenos de excreción/secreción a las 24 horas de incubación (Anexo 5b) Transcurrido las 24 horas de incubación, los parásitos fueron. CI. Ó. N. descartados y se procedió a centrifugar el medio a 1 500 rpm por 5. CA. minutos para obtener el sobrenadante con los antígenos, los cuales. conservados en tubos Vacutainer hasta su uso. La. UN I. fueron. M. concentración de proteínas presentes en el medio con los antígenos. Y. CO. se determinó por el método colorimétrico de Bradford 26(Anexo 1).. ÁT IC. A. 2.1.2. Antígenos del líquido seudocelómico de ejemplares adultos de Toxocara canis. RM. Los adultos de Toxocara canis fueron lavados cuatro veces con. IN. FO. PBS pH 7.2 estéril y luego dos veces con la misma solución a la. DE. cual se adicionó penicilina G sódica de 1.000.000 Ul y. AS. Gentamicina de 80 mg. para luego ser fijados sobre un soporte,. TE. M. extrayéndoles el fluido seudocelómico mediante succión con ayuda centrifugándose a 1 500 rpm por 15. SI S. de una jeringa de 1 ml,. DE. minutos y conservado a - 200 C hasta su posterior uso.. N. 2.2. Obtención de anticuerpos :. DI. RE. CC. IO. 2.2.1. Infección experimental en Oryctolagus cuniculus “conejo” utilizando los antígenos de excreción/secreción y de líquido seudocelómico de formas adultas de Toxocara canis Con los antígenos obtenidos. se procedió a inmunizar por vía. subcutánea a cada conejo en cada una de las caras internas de las extremidades posteriores utilizando 1.2 mL de antígeno y 0.8 mL. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. de Adyuvante Completo de Freud en la primera inmunización y con Adyuvante incompleto en las tres restantes inmunizaciones. (Anexo 6) por punción. CI. Ó. N. A las 4 semanas de la inmunización se obtuvo. CA. cardiaca sangre de los conejos, la cual se centrifugó a 3 000 rpm. UN I. por 15 minutos para obtener el suero que fue conservado a – 20 º C. CO. M. hasta el momento de su procesamiento.. Y. 2.3. Evaluación de los antígenos de excreción/secreción y del líquido por la técnica. ÁT IC. A. seudocelómico de formas adultas de Toxocara canis de Western Blot.. 27. y con modificaciones de acuerdo al. FO. de acuerdo al Manual de Tsang. RM. La preparación de los antígenos, su separación e identificación se realizó. DE. IN. protocolo del Laboratorio “Escalabs” cuyos pasos principales son los. AS. siguientes (Anexo 7). TE. M. 2.3.1. Tratamiento de los antígenos. SI S. Los antígenos de excreción-secreción fueron tratados con 0.01 M de. DE. Tris- HCl a pH 8.0; 0.1% de azul de bromofenol; 1% de dodecil sulfato. N. de sodio (SDS), de glicerol, para luego ser calentado a 65°C por 20. DI. RE. CC. IO. minutos, siendo la concentración final 0.086 ug/uL y 0.25 ug/uL para cada antígeno (Anexo 7a) 2.3.2. Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE): El gel de poliacrilamida fue preparado en placa, entre dos láminas de vidrio separadas por espaciadores de plástico. Cada gel estuvo formado en la primera porción por el gel de apilamiento con una concentración de. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 3 % de acrilamida, en éste se elaboró los pocillos donde se colocaron los patrones moleculares y la mezcla de antígenos preparados en una cantidad equivalente a 1 uL por mm de ancho de gel y la segunda. CI. Ó. N. porción por el gel separador con una concentración de 15 % de. CA. acrilamida (Anexo 7b).. UN I. Los corridos fueron hechos en minigeles de 8 x 7 x 0.05 cm a la. CO. M. concentración de 15% de acrilamida. La electroforesis se llevó acabo a. Y. 20 mA (corriente constante) en el gel de apilamiento y a 60 mA en el gel. ÁT IC. A. separador a un voltaje de 200 V por 30 minutos aproximadamente hasta que el colorante trazador alcanzó el extremo inferior del gel. En el. RM. corrido se incluyó el marcador de bajo peso molecular (Low Range. IN. FO. Weigh Standard; Bio Rad) (Anexo 7c).. DE. 2.3.3. Transferencia de proteínas:. AS. Los componentes proteicos separados en los geles de poliacrilamida. TE. M. fueron transferidos al papel de nitrocelulosa en una cámara de. SI S. electroforesis horizontal (Trans-Blot Cell, BioRad) utilizando un buffer. DE. de transferencia constituido por 0.2 M Tris-HCl pH 8, 20% de metanol. IO. N. y agua destilada (Anexo 7d). DI. RE. CC. Para realizar la electroforesis, el gel se unió con el papel de nitrocelulosa, se cubrió con papeles de filtro y esponjas que fueron colocadas en un cassette especial, los cuales fueron colocados en la cámara de transferencia, de tal modo que el gel se encuentre cercano al polo negativo y el papel de nitrocelulosa cerca al polo positivo. La transferencia se realizó a 2 A por espacio de 1.5 horas y a 4 °C.. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. El papel de nitrocelulosa con las proteínas transferidas, se lavaron (4 veces) con PBS/Twen-20 (0.1 M NaCl; 0.05 M Na2PO4, pH 7.2 y 0.35. N. Twen-20) y dos veces con PBS (Anexo 7e).. CI. Ó. 2.3.4. Revelado Enzimático de las proteínas específicas:. CA. Se colocó 500 uL de solución bloqueadora (leche descremada) y 10 uL. UN I. de los dos sueros respectivos a cada tira.. CO. M. Las tiras de nitrocelulosa fueron enumeradas en orden progresivo y. Y. colocado en placas y tubos de ensayo respectivamente, los cuales fueron. ÁT IC. A. incubados por una hora en agitación constante y a temperatura ambiente. Se realizaron tres lavados con PBS Tween 20 cada 5 minutos cada uno. RM. en agitación constante.. IN. FO. Se colocó 500 uL de conjugado enzimático (Puried Goal Anti Rabit IgG. DE. Horseradish Conjugae BioRad) por cada tira en PBS – Tween 20, los. AS. cuales fueron mantenidos en agitación constante por una hora.. TE. M. Se realizaron nuevos lavados con PBS Tween 20 de 5 minutos cada una. SI S. a temperatura ambiente. Para revelar las bandas antigénicas se agregó. DE. 500 uL de la solución de sustrato, se detuvo la reacción al lavarlos con. N. agua destilada (Anexo 7f). DI. RE. CC. IO. 2.3.5. Determinación de los pesos moleculares:. Para la determinación de los pesos moleculares se utilizó como patrón un marcador de bajo peso molecular conocido (SDS- PAGE Molecular Weight Standarts Low Range). Se determinó el peso molecular relativo de las bandas antigénicas encontrando la movilidad relativa (RF) del marcador y de los antígenos en estudio (Anexo 2,3 y 4).. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. III.- RESULTADOS Las lecturas de concentraciones de proteínas de los productos de. N. excreción/secreción de Toxocara. canis usando el método de Bradford a las. CI. Ó. 24 horas de incubación fueron de: 209, 109, 98, 89, 77 ug/mL utilizando el de. CA. mayor concentración para la inmunización y la concentración del líquido. UN I. seudocelómico fue de: 1410 ug/mL utilizándose ésta para la siguiente inmunización. CO. M. (Tabla 1).. Y. Los pesos moleculares de las bandas inmunodominantes del antígeno de. ÁT IC. A. excreción/secreción de Toxocara canis a una concentración de 0.086 ug/uL. RM. fueron de: 70.7- 11.2 KDa (Tabla 2) y (Fig 1).. FO. Los pesos moleculares de las bandas inmunodominantes del antígeno de líquido. IN. seudocelómico de Toxocara canis a una concentración de 0.025 ug/uL fueron. AS. DE. de: 77.6 -11.2 KDa (Tabla 2) y (Fig 1).. M. Las bandas antigénicas que comparten las dos formas de antígenos de. SI S. TE. excreción/secreción y del líquido seudocelómico de Toxocara canis fueron:. DI. RE. CC. IO. N. DE. 70.7, 67, 39.8, 30.1, 28.2 ,17.8, 12.6 y 11.2 KDa (Tabla 2). 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 1.- Valores de las concentraciones de proteínas obtenidas de los antígenos de excreción /secreción y del líquido seudocelómico de las formas adultas de. Lote. Antígeno. Código. [ ] ug/mL. 1. Excreción / Secreción. A. UN I. CA. CI. Ó. N. Toxocara canis. 2. Excreción / Secreción. B. 3. Excreción / Secreción. C. 4. Excreción / Secreción. D. 5. Excreción / Secreción. 6. Liquido seudocelómico. 109 98. ÁT IC. A. Y. CO. M. *209. 89 77. L. * 1410. FO. RM. E. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. DE. IN. * Valor de la concentración de proteínas del antígeno seleccionado para la inmunización.. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC IÓ. Tabla 2.- Pesos moleculares en KDa de las bandas reactivas de los antígenos de excreción/secreción y del líquido seudocelómico de las formas adultas. 77.6. 70.7. 67.6. +. +. 67.1. 50.1. 48.9. 39.8. 35.4. +. +. 30.1. 28.2. 26.3. 22.4. 21.1. 19.1. +. +. 18.2. 17.8. 12.6. +. +. +. +. 11.8. 11.2. RM ÁT IC. A. Peso. Y. CO. M. UN IC. de Toxocara canis determinadas por Western blot.. Antígeno E/S +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. DE. Antígeno. +. IN FO. (KDa). DI. RE C. CI O. N. DE. SI. ST. EM. AS. LS. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.. +. +. +. +.

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 3 – Comparación de bandas encontradas en el presente trabajo con otros autores Forma. % SDS-. evolutiva. PAGE 3 - 15. **Adulto. LS. 3 - 15. Ó CI. E/S. 70.7, 67.6, 39.8 ,35.4 ,30.1 ,28.2 ,21.1 19.1 ,17.8 ,12.6 ,11.2. CA. *Adulto. Referencia. N. Bandas reactivas detectadas en KDa. Chuyo. 12.6, 11.8, 11.2. UN I. 77.6, 70.7, 67.1, 50.1, 48.9, 39.8, 30.1, 28.2, 26.3, 22.4, 18.2, 17.8,. Chuyo. E/S. 2 - 10. 24, 28, 30, 35, 132, 147, 200. L3. E/S. 2 - 10. 26, 32, 45, 55, 70, 120, 400. Maizel. L3. E/S. 4 - 16. 24, 28, 30, 35, 45-56, 67, 117, 136, 152. Roldan. L3. E/S. 3 - 10. 28, 21, 35, 45, 66, 80, 92. L3. E/S. 3 - 12. 16, 20, 23, 24, 28, 32, 38, 120, 200, 400. ÁT IC. A. Y. CO. M. L3. RM. Extracto Adultos. 3 - 12. Peixoto. 28.2, 31.6, 32.1, 70.8, 79.4. Jara. LS. 3 - 15. 23, 24,5 30.9, 35.1, 43.4, 45.2, 57.5, 64.6, 65.3, 66.8, 97.7, 125.8. Colina. FO. Adulto. IN. 3-12. Muñoz. AS. DE. E/S. Morales. 42, 58, 68, 97. Crudo Adultos. Magnaval. TE. M. * Bandas de antígenos de excreción/secreción de formas adultas de Toxocara. SI S. canis halladas en la presente investigación mediante Western blot .. DE. ** Bandas del líquido seudocelómico de las formas adultas de Toxocara canis halladas. DI. RE. CC. IO. N. en la presente investigación mediante Western blot.. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DE. IN. FO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. M. UN I. CA. CI. Ó. N. KDa. AS. Fig 1.- Presencia de bandas antigénicas de excreción/secreción y del líquido. TE. M. seudocelómico de las formas adultas de Toxocara canis determinadas por. SI S. Western blot (A: marcador de peso Molecular (MPM) en KDa, Carril 1. DE. y 2: antígeno de excreción/secreción de formas adultas de Toxocara. IO. N. canis, Carril 3 y 4: antígeno de líquido pseudocelómico de Toxocara. DI. RE. CC. canis, Carril 5: suero pre inmune).. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IV.- DISCUSION Toxocara. canis es un parásito excepcional entre los nematodos por su. N. capacidad para sobrevivir “in vitro” por tiempo prolongado en estado larvario. En. CI. Ó. el medio de cultivo, el parásito se encuentra en un estado infectante para el. UN I. CA. hombre y secreta abundantes cantidades de glicoproteínas muchas de ellas con características antigénicas, las cuales tienen gran importancia para el. CO. M. inmunodiagnóstico. Entre los principales productos metabólicos tenemos a las. A. Y. aminopeptidasas, las fosfatasas y las proteasa15, 17 18,19.. ÁT IC. El volumen del producto secretado “antígeno” y la concentración de proteínas. RM. del mismo depende del tamaño y de la cantidad de parásitos recolectados por lo. FO. que se requiere miles de larvas para obtener productos secretados de (E/S) de. IN. formas larvales 21.22.23, mientras que al utilizar las formas adultas de Toxocara. DE. canis para el mismo objetivo se necesitan menor cantidad de parásitos (alrededor. AS. de seis a ocho) 13,15 y al usar el líquido seudocelómico se puede obtener. TE. M. “antígenos” de parásitos recientemente muertos que solo requieren centrifugar,. SI S. siendo menos laboriosa la obtención de estas dos formas de antígenos.. DE. En la presente investigación se verificó que dichos parásitos en el medio de. IO. N. cultivo (MEM) secretan abundantes cantidades de glicoproteínas antigénicas,. DI. RE. CC. 20,21. esta estabilidad “in Vitro” permitió recolectar los productos de. excreción/secreción en cantidades apreciables y de igual manera sucedió con los antígenos del líquido seudocelómico que sirvieron para el análisis bioquímico (medición de proteínas por el método de Bradford) obteniendo. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. concentraciones viables para la inmunización de Oryctolagus cuniculus “Conejo” y para el análisis. N. La fuente de antígeno debe ser evaluada en tiempo, cantidad y costos por. CI. Ó. lo que se puede evaluar otras formas de obtención de antígenos obteniendo mismos resultados por lo que se propuso obtener antígenos de. UN I. CA. los. excreción/secreción y del líquido seudocelómico de formas adultas de. CO. M. Toxocara canis sin necesidad de contar con parásitos vivos, solo con. Y. parásitos enteros que se pueda extraer el líquido seudocelómico ,. ÁT IC. A. encontrándose un patrón de bandas de bajo peso molecular que comparten las dos formas de antígenos característico de las infecciones causadas por. FO. RM. Toxocara canis 16,21,22 .. IN. La vía que se utilizó para las inmunizaciones de Oryctolagus cuniculus. DE. “conejo” con los antígenos de excreción/secreción y del líquido. M. AS. seudocelómico para obtener los anticuerpos específicos IgG fue la vía. TE. subcutánea; debido a que es la vía más adecuada para desencadenar una. SI S. respuesta inmune eficiente. 21. y obtener una mayor producción de anticuerpos. DE. en relación con otras vías como la intravenosa o la vía oral. La dosis de. IO. N. inmunización fue de una proporción casi igual para lograr una buena. DI. RE. CC. respuesta inmune tomando 1.2 ml de antígeno y 0.8 ml de Adyuvante Completo de Freud para la primera inmunización y con Adyuvante incompleto en las tres restantes debido a que actúa como potenciadores de la respuesta inmune asegurando una suficiente producción de anticuerpos16, 19.. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Al utilizar el medio (MEM). como medio de cultivo. para obtener. antígenos de excreción/secreción de formas adultas de Toxocara canis se pudo comprobar que éstos productos excretados sirven para ejecutar la. CI. Ó. N. técnica de Western Blot sin necesidad de trabajar con las formas larvales. CA. obteniendo bandas compartidas con las dos formas de antígenos. UN I. demostrándose así que los dos tipos de extractos antigénicos : de. CO. M. excreción/secreción y de líquido seudocelómico comparten bandas cuyos pesos moleculares fueron : 70.7, 67, 39.8, 30.1, 28.2 ,17.8, 12.6 y 11.2 KDa. Y. 21, 22, 23,24. ÁT IC. A. , por lo que probablemente compartan enzimas las formas larvales. con los adultos, por ello la similitud de bandas en ambas formas evolutivas 16,24, 25,26. FO. RM. .. IN. Con los resultados obtenidos se puede decir que las dos formas de. DE. antígenos de Toxocara canis son verdaderos mosaicos antigénicos,. AS. destacándose por el número e intensidad de bandas proteicas donde los. TE. M. antígenos de excreción/secreción presentaron 11 bandas inmunodominantes. SI S. y los antígenos del líquido seudocelómico 15 bandas inmunodominantes.. DE. El patrón de bandas encontradas en las dos formas de antígenos que. IO. N. fueron reconocidos por los anticuerpos IgG presentes en el suero de. DI. RE. CC. Oryctolagus caracterizadas. cuniculus por. “conejo”. Maizel. 17. se. correlacionan. que. trabajó. con. con. las. bandas. antígenos. de. excreción/secreción de formas larvales llamándolas Glicoproteinas “TES” de: 26, 32, 45, 50. 55 y 70 KDa, las cuales son: la de 70.7, 30.1 y 28.2 KDa encontradas en la presente investigación con las de 70,32 y 26 KDa por Maizel 17 (Tabla 3). 17. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Otros autores coinciden en que habría dos grupos de bandas, uno de bajo peso molecular (24-45 kDa) y otro grupo de alto peso molecular (66-200 kDa) 12, 19, 21 donde sugieren que las fracciones de alto peso molecular pueden. Ó. N. ocasionar reactividad cruzada mientras que las fracciones de bajo peso. CA. CI. molecular parecen ser más específicas del género Toxocara, 18, 19, 20, 21, 22,24. UN I. Puede citarse los resultados obtenidos por Magnaval13 que encontró un. CO. M. patrón típico de siete bandas también divididas en dos grupos: bajo peso. Y. molecular (24, 28, 30 y 35 kDa) y alto peso molecular (132,147, y 200 kDa). ÁT IC. A. demostrándose semejanzas con las bandas encontradas en la presente. RM. investigación como las de 30.1 y 28.2 kDa) (Tabla 3).. FO. Roldan23 que utilizó también antígenos de e/s de formas larvales obtuvo. IN. también dos grupos de bandas; de alto peso molecular y las de bajo peso. DE. molecular siendo estas las más específicas para la toxocariasis las de: 24, 28, las. M. AS. 30, 35, 48 – 56 y 67 KDa de las cuales tres son semejantes con. TE. encontradas en la presente investigación como son las bandas de: 67, 30.1, y. SI S. la de 28.2 KDa (Tabla 3). 24. DE. Peixoto. trabajó con extractos crudos de parásitos adultos encontrando. IO. N. bandas de: 42, 58, 68 y 97 KDa encontrándose similitud con la banda 67.6. DI. RE. CC. hallada en el antígeno de excreción/secreción y la de 67.1 hallada en el antígeno de líquido seudocelómico que podría tratarse de la misma banda pero con una leve diferencia debido a las diferentes concentraciones de los SDS-PAGE22, 23,24 trabajados en la presente investigación, demostrándose que las bandas con bajo peso molecular son específicas para la toxocariasis (Tabla 3).. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Las bandas antigenicas que comparten las dos formas de antígeno de Toxocara canis detectados en la presente investigación, coinciden con las bandas encontradas por otros autores que trabajaron con extractos antigénicos. CI. 16,23,24,25. , debido a. CA. parte de los productos de excreción/secreción del parásito. Ó. N. larvales ( L3) y se podría deducir que parte del líquido seudocelómico forma. UN I. que comparten bandas y las formas adultas se relacionarían estrechamente con. CO. M. las bandas detectadas en formas larvales por lo que se puede utilizar los. Y. antígenos de excreción/secreción y del líquido seudocelomico de formas. ÁT IC. A. adultas demostrándose que no existe una importante variación antigénica en la evolución del parasito, concluyendo que las dos formas de obtención de 24,25. RM. antígenos son útiles para el inmunodiagnóstico de la toxocariasis humana. FO. (Tabla 3).. DE. IN. El número de bandas, así como el tamaño exacto de los pesos 23,24,25. ,. AS. moleculares de las bandas antigénicas varía de una publicación a otra. M. debido al marcador de peso molecular usado y a las diferentes concentraciones. SI S. TE. del gel concentrador y gel difusor empleados para el SDS-PAGE ( Tabla 3). La técnica de Western Blot es la combinación de la electroforesis en gel. DE. de policrilamida con la sensibilidad del inmunoensayo, convirtiéndose en una. IO. N. prueba de alta sensibilidad y especificidad por lo cual es utilizada para. CC. diagnosticar una serie de parasitosis, sin embargo también se utiliza esta. DI. RE. técnica para poder evaluar la eficacia de los antígenos para poder determinar si el antígeno es de utilidad para el inmunodiagnóstico, por lo que se evaluaron éstas dos formas de antígenos que sirvan para detectar la toxocariasis humana.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. V.- CONCLUSION Las. bandas. antigénicas. que. comparten. los. antígenos. de. N. excreción/secreción y del líquido seudocelómico de formas adultas de. CI. Ó. Toxocara canis fueron: 70.7, 67.1, 39.8, 30.1, 28.2, 17.8 ,12.6 y 11.2 KDa. UN I. CA. determinándose que las bandas de bajo peso molecular son específicas para. M. la toxocariasis humana.. CO. Los antígenos de excreción/secreción de formas adultas de Toxocara. A. Y. canis son una buena fuente de antígeno capaz de producir una respuesta. ÁT IC. inmune presentando 11 bandas antigénicas inmunodominantes.. RM. Los antígenos del líquido seudocelómico de formas adultas de Toxocara. FO. canis son una buena fuente de antígeno capaz de producir una respuesta. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. DE. IN. inmune presentando 15 bandas antigénicas inmunodominantes.. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RECOMENDACIONES. la identificación de anticuerpos IgG contra antígeno. N. En un futuro estudiar. CI. Ó. excreción/secreción, en los humores vítreo y acuoso de los conejos infectados. UN I. CA. previamente con Toxocara canis, mediante las pruebas de ELISA y Western blot.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. DE. IN. FO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. M. Realizar trabajos sobre la incidencia y prevalencia de la toxocariasis en el Perú.. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. VI.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1.. Despommier D. Toxocariasis: clinical aspects, epidemiology, medical. Ó. Glickman LT, Schantz PM. Epidemiology and patghogenesis of zoonotic. CI. 2.. N. ecology, and molecular aspects. Clin Microbiol Rev. 2003; 16(2):265-72.. UN I. 3.. CA. toxocariasis. Epidemiol Rev 1981; 3:230-50.. Schantz PM Glickman LT. Ascaridios de perros y gatos un problema de. CO. M. Salud Pública y de Medicina Veterinaria. Bol Of Sanit Panam 1983; 91: 571-. A. Magnaval JF, Glickman LT, Dorchies P, Morassin B. Highlights of human. ÁT IC. 4.. Y. 85.. Schantz PM, Glickman LT. Toxocaral visceral larva migrans. N Engl J Med.. FO. 5.. RM. toxocariasis. Korean J Parasitol. 2001;39(1):1-11. Flores A. Toxocariosis: zoonosis por nematodos. Rev Nuestros Perros,. DE. 6.. IN. 1978; 298(8):436-39.. M. Taranto N, Passamonte L, Marincon R, de Marzi M, Cajal S, Malchiodi E.. TE. 7.. AS. Madrid, España, N° 5, abril 1992.. SI S. Parasitosis zoonóticas transmitidas por perros en el Chalco salteño. Medicina. Nichols R. The etiology of visceral larva migrans. J Parasitol 1956; 42: 349-. Alonso JM, Chamorro M, Bojanich MV, Stein M, Martin G. Infección por Toxocara canis en niños del Gran Resistencia y estudio de suelos como. RE. 9.. DI. CC. IO. 62.. N. 8.. DE. 2000; 60(2): 217-20.. posible fuente de infectación. Resumen 3-87. Reunión de Comunicaciones Científicas y Tecnológicas. Corrientes (Argentina).1997.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 10. Buijs J, van Knapen F. Toxocara infection in children and the relation with allergic manifestations. Vet Q.1994; 16(Suppl 1):13S-14S. 11. Beaver PC. Zoonoses with particular reference to parentes of veterinary. CI. Ó. N. importance. In; Soulsby EJL. Ed Biology of Parasites. New York: Academic. CA. Press 1951; 215-27.. UN I. 12. Magnaval JF, Fabre R, Maurières P, Charlet JP, de Larrard B. Application of. CO. M. the western blotting procedure for the immunodiagnosis of human. Y. toxocariasis. Parasitol Res. 1991; 77(8):697-702.. ÁT IC. A. 13. Magnaval JF, Fabre R, Maurières P, Charlet JP, de Larrard B. Application of the western blotting procedure for the immunodiagnosis of human. RM. toxocariasis. Parasitol Res. 1991; 77(8):697-702.. FO. 14. Magnaval JF, Galindo V, Glickman LT, Clanet M. Human Toxocara. DE. IN. infection of the central nervous system and neurological disorders: a case-. AS. control study. Parasitology. 1997; 115(Pt 5):537-43.. M. 15. Chuyo M & Jara C, Antígenos de excreción - secreción de las formas adultas. SI S. TE. de Toxocara canis detectados por Western Blot utilizando anticuerpos específicos producidos en conejos. SCIENDO 2010; 13(2):72.79- 39.. DE. 16. Colina J, Leiva D, Escalante H & Jara C. Antígenos del líquido. IO. N. seudocelómico de Toxocara canis identificados mediante la técnica de utilizando. anticuerpos. producidos. en. Oryctolagus cuniculus. REBIOL 2011,31(2). DI. RE. CC. Electroinmunotransferencia. 17. Maizels R, De Savigny D, Ogilvie B. Caracterization of surface and excretory-secretory antigens of Toxocara canis infective larvae. Paras. Immunol.; 6:23-27, 1984. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 18. Lynch, N. R.; WIlkes, L. K.; Hodgen, A. N. et al. – Specificity of Toxocara ELISA in tropical population. Paras. Immunol., 10: 323-337, 1988. 19. Nunes C M, Tundisi R N, García J F, et al. Cross-reactions between Toxocara. CI. Ó. N. canis and Ascaris suum in the diagnosis of visceral larva migrans by western. CA. blotting technique. Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo (1997); 39(5): 253-256.. UN I. 20. El-Massry AA. Characterization of antigenic property of Toxocara canis and. CO. M. Toxascaris adults and larvae through immunodiagnosis electrophoresis (SDS-. Y. PAGE) and western blot technique. J Egypt Soc Parasitol. 1999;29:335-45. ÁT IC. A. 21. Morales O, López M, Nicholls R; Identification of Toxocara canis antigens by western blot in experimentally infected rabbits. Rev. Inst. Med trop. S.. RM. Paulo. 44 (4):213-216, July-August, 2002. IN. humana. 2004 .Universidad Nacional Del Nord Este.. DE. toxocariasis. FO. 22. López A., Bojanich M., El Inmuno blotting en el diagnóstico de la. WH,. Espinoza. Y.A.. Evaluation. of. an. enzymelinked. M. 23. Roldán. AS. Comunicaciones Científicas y Tecnológicas. Resumen: M-052. SI S. TE. immunoelectrotransfer blot test for the conﬁrmatory serodiagnosis of human toxocariasis. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2009; 104(3):411-18.. DE. 24. Peixioto PL, Nascimento E, Lopes Cançado GG, Cambraia de Miranda RR,. IO. N. Lunardi Rocha R, Araujo RN, et al. Identification of candidate antigens from. Mem Inst Oswaldo Cruz 2011; 106 (2): 200-206.. DI. RE. CC. adult stages of Toxocara canis for the serodiagnosis of human toxocariosis.. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 25. Muñoz- Guzmán MA, Alba- Hurtado F. Antígenos de excreción / secreción de Toxocara canis reconocidos por cachorros del área metropolitana de la. CI. Ó. N. ciudad de México. Vet Méx 2010; 41 (1): 59- 64.. CA. 26. Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantification of. UN I. microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding.. CO. M. Anal. Biochem 1976; 72: 248- 254. Y. 27. Tsang, V. 1986. Enzyme Linked Inmunotransfer Blot technique (Western. ÁT IC. A. Blot) for human T Lynphotopic Virus type III/Lynphoadenopathy-associated Virus (Htlv/LAV) Antibodies. US Department of Health and Human services.. FO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. DE. IN. series N° 15. Procedural guide.. RM. Public Health Service Centers for Disease Control. Atlanta. Inmunology. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) ANEXOS. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. DE. IN. FO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. M. UN I. CA. CI. Ó. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ANEXO 1.- Fundamento del Método Colorímetro de Bradford. Algunas moléculas presentan afinidad por las proteínas y pueden fijarse a estas de. N. manera no covalente. El método calorimétrico de Bradford se basa en la unión no. CI. Ó. covalente del azul de Coomassie a las proteínas, se determina colorimétricamente. UN I. CA. y existe una relación directa entre la intensidad del color y la absorción según el estado de pronotración en el que se encuentra: la forma cotiónica es de color rojo. CO. M. marrón (máxima de absorbancia a 470 nm), la neutra es verde (máximo a 650nm). ÁT IC. A. Y. y la aniónica es azul (máximo a 595 nm).. RM. La presencia de las proteínas como los antígenos, favorece el desplazamiento del. FO. equilibrio hacia la forma aniónica debido a la interacción de los grupos sulfónicos. IN. del Coomassie con los grupos catiónicos de las cadenas laterales de algunos. DE. residuos aminoácidos básicos o aromáticos de las proteínas (principalmente. AS. arginina y lisina), produciéndose entonces la coloración azul que puede medirse a. TE. M. 595 nm. El color máximo se desarrolla en 5 minutos pero el color puede disminuir. DE. SI S. el tono a los 10 a 15 minutos, la disminución máxima ocurre a las 4 horas.. N. Este método tiene la ventaja de utilizar pequeñas cantidades de muestras, el rango. CC. IO. de determinación de proteínas es de 1-10 mg/mL (ensayo micro) y de 0.5-1.4. RE. mg/mL (ensayo estándar), de ser fácil de operar y de no tener interferencia con las. DI. formas catiónicas ni los carbohidratos, pero tiene las desventajas de depender de la composición aminoacídica de la proteína, lo cual convierte en una de las principales desventajas, y de interferir con los detergentes(como el SDS, triton X100, etc); también interfieren sustancias fuertemente alcalinas. 27. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ANEXO 2. de. los. antígenos. de. Ó. N. Determinación de los pesos moleculares excreción/secreción de Toxocara canis. CA. Movilidad Relativa de los pesos moleculares. Log( MPM). UN I. Da. CI. MPM. 5.1. MP 1: Rf=. 0.5 / 6.0 =. 0.08. 100 000. 5.0. MP 2: Rf=. 0.6 / 6.0 =. 0.10. 75 000. 4.9. MP 3: Rf=. 0.9 / 6.0 =. 0.15. 50 000. 4.7. MP 4: Rf=. 1.3 / 6.0 =. 37 000. 4.6. MP 5: Rf=. 25 000. 4.4. 20 000. 4.3. MP 7: Rf=. 15 000. 4.2. 10 000. 4.0. A. 1.6 / 6.0 =. 0.26. MP 6: Rf=. 2.4 / 6.0 =. 0.40. 2.7/ 6.0. =. 0.45. MP 8: Rf=. 3.4 / 6.0 =. 0.56. 4.4 / 6.0 =. 0.73. DE. IN. RM. ÁT IC. 0.22. FO. Y. CO. M. 125 000. TE. M. AS. MP 9: Rf=. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. *Estos datos permiten elaborar la curva estándar. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ANEXO 3. N. Pesos en KDa de los antígenos de excreción/secreción de formas adultas de. CA. CI. Ó. Toxocara canis. Inv. Log PM en daltons. PM en Kilodaltons (KDa). 4.85. 70 794.5. 70.7. Ag 2:. 4.83. 67 608.2. Ag 3:. 4.60. 39 810.7. Ag 4:. 4.55. 35 481.3. Ag 5:. 4.48. 30 199.5. Ag 6:. 4.45. 28 183.8. Ag 7:. 4.325. 21 134.8. 21.1. Ag 8:. 4.28. 19.1. Ag 9:. 4.25. Ag 10:. 4.10. Ag 11:. 4.05. FO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. M. Ag 1 :. IN. Log.Peso Molecular. UN I. Cultivo: Excreción/ Secreción ( ES ). 39.8 35.4 30.1 28.2. 17 782.7. 17.8. 12 589.2. 12.6. 11 220.1. 11.2. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. DE. 19 054.6. 67.6. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(43) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ANEXO 4. Pesos en KDa de los antígenos de líquido seudocelómico de formas adultas de. 70 794.5. Ag 3:. 4.82. 66 680.6. Ag 4:. 4.70. 50 118.7. Ag 5:. 4.69. 48 977.8. Ag 6:. 4.60. 39 810.7. Ag 7:. 4.48. 30 199.5. Ag 8:. 4.45. Ag 9:. 4.42. Ag 10:. 4.35. Ag 11:. 4.26. Ag 12:. 4.25. Ag 13: Ag 14:. IN. 70.7 67.1 50.1 48.9 39.8 30.1. 26 302.6. 26.3. 22 387.2. 22.4. 18 197.0. 18.2. 17 782.7. 17.8. 4.10. 12 589.2. 12.6. 4.07. 11 748.9. 11.8. 4.05. 11 220.1. 11.2. IO. DE. SI S. TE. M. AS. 28.2. N. DE. 77.6. 28 183.8. DI. RE. CC. Ag 15:. CO. 4.85. Y. Ag 2:. A. 77 624.7. ÁT IC. 4.89. FO. Ag 1 :. PM en Kilodaltons (KDa). M. Inv. Log PM en daltons. RM. Log.Peso molecular. UN I. Cultivo: Líquido seudocelómico ( LS ). CA. CI. Ó. N. Toxocara canis. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(44) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ANEXO 5 (a) Formas adultas de Toxocara canis y (b) formas adultas de Toxocara canis. N. conteniendo medio mínimo esencial o mínimo esencial (Minium Essential. a. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. DE. IN. FO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. M. UN I. CA. CI. Ó. Media -MEM).. DI. RE. b. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(45) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ANEXO 6. Inmunización de Oryctolagus cuniculus con antígenos de excreción/secreción de. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. DE. IN. FO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. M. UN I. CA. CI. Ó. N. formas adultas de Toxocara canis. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(46) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ANEXO 7 del. Western. Blot:. Preparación. (a). de. los. antígenos. de. Ó. N. Secuencia. CA. CI. excreción/secreción, (b) preparado del gel de poliacrilamida con los posibles. UN I. antígenos, (c) corrido electroforético de los posibles antígenos, (d) transferencia. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. DE. IN. FO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. horizontal, (f) revelado Enzimático de las proteínas específicas. M. de los componentes proteicos al papel de nitrocelulosa, (e) electroforesis. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

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