Efecto de bacterias endofíticas aisladas de Solanum pimpinellifolium sobre el crecimiento de Medicago sativa

Texto completo

(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. SG RA. DO. ESCUELA DE POSTGRADO UNIDAD DE POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS. DE. PO. Efecto de bacterias endofíticas aisladas de Solanum pimpinellifolium sobre el crecimiento de Medicago sativa. : Br. EDWIN JORGE VEGA PORTALATINO. BL. AUTOR. IO TE. CA. TESIS PARA OBTENER EL GRADO ACADEMICO DE: MAESTRO EN CIENCIAS CON MENCION EN BIOTECNOLOGIA AGROINDUSTRIAL Y AMBIENTAL. BI. ASESORA: Dra. CARMEN DEL ROSARIO TAMARIZ ANGELES. TRUJILLO – PERU 2016 N° de Registro: ………. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. JURADO DICTAMINADOR. PO. SG RA. PRESIDENTE. DO. Dra. Bertha Soriano Bernilla. DE. Ms. Anibal Quintana Diaz. IO TE. CA. SECRETARIO. BI. BL. Dra. Carmen Del Rosario Tamariz Angeles. MIEMBRO. II Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. A Dios por ser mi creador, el motor de mi vida por no haber dejado que me en. ningún. iluminarme. para. momento salir. e. adelante,. DO. rinda. porque todo lo que tengo, lo que. SG RA. puedo y lo que recibo es regalo que él me ha dado.. A Melania, mi madre, que es el ser. PO. más maravilloso de todo el mundo. Gracias por el apoyo moral, tu cariño. DE. y compresión que desde niño me has brindado, por guiar mi camino y estar. IO TE. CA. junto a mí en los momentos difíciles. A Benjamín, mi padre, porque desde pequeño ha sido para mí un gran hombre al que siempre he admirado por ser ejemplo de perseverancia y. BL. superación.. BI. Gracias a ustedes por guiar mi vida con energía, esto ha hecho que sea. A todos mis familiares y amigos que. lo que soy.. de una u otra manera estuvieron pendientes proceso,. a. lo. largo. brindándome. de su. este apoyo. incondicional. III Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTOS. DO. Infinitas gracias a Dios, mi fortaleza y soporte, por permitirme concluir este trabajo con salud y vida y por mantener siempre encendido en mí, la luz que me guía.. SG RA. A mis padres Benjamín y Melania, por darme la vida, por ser el impulso necesario para dar grandes pasos, porque me enseñaron a querer lo que hago y por todos los sabios consejos que me permitieron hacer las cosas bien.. DE. PO. A mi asesora la Dra. Tamariz Angeles Carmen del Rosario por impartirme sus conocimientos, por su tiempo, su paciencia, sugerencias y correcciones al realizar este trabajo y por su invaluable supervisión que permitió la culminación de esta tesis.. IO TE. CA. A mi colega Dr. Olivera Gonzales Percy Eduardo por apoyarme durante la ejecución y culminación de mi proyecto de tesis, por sus valiosos aportes e incansable búsqueda de la verdad y las causas justas, así como sus abnegados trabajos por la ciencia.. BI. BL. A la Ing. Rosales Cuentas Miriam Marleni, por su inmensa colaboración en todo el proceso de la ejecución de mi tesis y siempre estar alentándome día a día.. Al laboratorio de Biología de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional Santiago Antúnez de Mayolo, por la facilidades prestadas para la realización de la presente tesis.. A todos muchas gracias.. IV Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE. DEDICATORIA ............................................................................................... III AGRADECIMIENTOS .................................................................................... IV V. DO. INDICE ............................................................................................................. INDICE DE TABLAS ...................................................................................... IX. SG RA. INDICE DE FIGURAS ..................................................................................... XIV INDICE DE SECUENCIAS ............................................................................. XX. PO. RESUMEN ...................................................................................................... XXI. DE. ABSTRACT ....................................................................................................XXII. 1. Objetivo general ................................................................................... 19. Objetivo específico ............................................................................... 19. IO TE. CA. 1. INTRODUCCION .................................................................................... 20. 2.1. Objeto de estudio .......................................................................... 20. 2.2. Población y muestra...................................................................... 20. 2.3. Variables......................................................................................... 21. 2.4. Instrumentación ............................................................................. 21. 2.5. Métodos y Técnicas....................................................................... 22. a. Lugar de toma de muestra ......................................................... 22. b. Lugar de Procesamiento de muestras y trabajo laboratorio ....... 23. c. Aislamiento de los microorganismos endofíticos ........................ 23. BI. BL. 2. MATERIAL Y MÉTODOS....................................................................... V Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. d. Pruebas de promoción de crecimiento a partir de las bacterias 25. Producción de Ácido Indol Acético............................................. 25. Efecto antagónico sobre Fusarium oxysporum .......................... 26. Solubilización de fosfatos .......................................................... 28. DO. endofíticas aisladas ................................................................... 28. Actividad celulolítica ................................................................... 29. Actividad proteolítica .................................................................. 29. SG RA. Producción de sideróforos ......................................................... e. Inoculación de bacterias endofíticas seleccionadas sobre 30. Preparación de suspensiones bacterianas ................................ 30. DE. PO. semillas de Medicago sativa “alfalfa” ....................................... 30. Inoculación de las semillas de alfalfa ......................................... 31. f. Análisis de resultados .............................................................. 32. IO TE. CA. Desinfección de las semillas de alfalfa ...................................... g. Identificación Molecular de la cepa con mejores resultados. 33 34. 3.1. Aislamiento de bacterias endofíticas ............................................... 34. 3.2. Producción de Ácido Indol Acético a 24 horas ................................ 34. 3.3. Producción de Ácido Indol Acético a 48 horas ................................ 36. BI. BL. 3. RESULTADOS ....................................................................................... 3.4. Efecto Antagónico de las cepas bacterianas endofíticas aisladas sobre Fusarium oxysporum a los 6 días .................................................. 38. 3.5. Solubilización de fosfatos de las cepas bacterianas endofíticas aisladas a los 7 días ..................................................................................... 41. VI Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 3.6. Evaluación de Sideróforos de las cepas bacterianas endofíticas aisladas a los 7 días ....................................................................... 43. 3.7. Evaluación de la Actividad Celulolítica de las cepas bacterianas endofíticas aisladas a 48 horas ...................................................... 46. DO. 3.8. Evaluación de Actividad Proteolítica de las cepas bacterianas endofíticas aisladas a 48 horas ...................................................... 48. SG RA. 3.9. Selección de las cepas promotoras de crecimiento para la evaluación de su efecto sobre Medicago sativa ............................................... 52. PO. 3.10. Porcentaje de Germinación de semillas de alfalfa inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas a 24 horas .............. 54. DE. 3.11. Evaluación del Tamaño Radicular de las Semillas de Alfalfa Inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de. CA. 5 días ............................................................................................. 57. IO TE. 3.12. Evaluación del Tamaño del Tallo de las Semillas de Alfalfa Inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 5 días. 59. 3.13. Evaluación del Número de Hojas Cotiledonales de las Semillas de. BL. Alfalfa Inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas. BI. luego de 5 días............................................................................... 61. 3.14. Evaluación del Tamaño Radicular de las Semillas de Alfalfa Inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 5 días ............................................................................................. 63. 3.15. Evaluación del Tamaño del Tallo de las Semillas de Alfalfa Inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 5 días. 65. VII Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 3.16. Evaluación del Número de Hojas Cotiledonales de las Semillas de Alfalfa Inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 5 días............................................................................... 67. 3.17. Identificación Molecular de las cepas bacterianas endofíticas. DO. seleccionadas ................................................................................ 69 71. Identificación molecular de la Cepa 24 ........................................ 72. Identificación molecular de la Cepa 26 ........................................ 73. Identificación molecular de la Cepa 29 ........................................ 74. PO. SG RA. Identificación molecular de la Cepa 21 ........................................ DE. Identificación molecular de la Cepa 35 ........................................ 75. 76. 5. CONCLUSIONES ................................................................................... 96. 6. RECOMENDACIONES .......................................................................... 97. IO TE. CA. 4. DISCUSIÓN............................................................................................ 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................... 98. BI. BL. 8. ANEXOS ............................................................................................... 122. VIII Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE DE TABLAS. Tabla 1. Datos de ubicación de la colecta en la localidad de pedregal –Trujillo ....................................................................................................... 22. DO. Tabla 2. Análisis de varianza de la producción de AIA (μg/mL) de la cepa 35 a las 24 horas................................................................................... 128. SG RA. Tabla 3. Análisis de varianza de la producción de Ácido Indol Acético (AIA) de la cepa 24 a las 24 horas .............................................................. 129. PO. Tabla 4. Prueba de DUNCAN de la producción de Ácido Indol Acético (AIA) de la cepa 24 a las 24 horas .............................................................. 129. DE. Tabla 5. Análisis de varianza de la producción de Ácido Indol Acético (AIA) de la cepa 21 a las 24 horas .............................................................. 130. CA. Tabla 6. Prueba de DUNCAN de la producción de Ácido Indol Acético (AIA) de. IO TE. la cepa 21 a las 24 horas .............................................................. 130 Tabla 7. Análisis de varianza de la producción de Ácido Indol Acético (AIA) de. BL. la cepa 26 a las 24 horas .............................................................. 131 Tabla 8. Prueba de DUNCAN de la producción de Ácido Indol Acético (AIA) de. BI. la cepa 26 a las 24 horas .............................................................. 131. Tabla 9. Análisis de varianza de la producción de Ácido Indol Acético (AIA) de la cepa 29 a las 24 horas .............................................................. 132 Tabla 10. Prueba de DUNCAN de la producción de Ácido Indol Acético (AIA) de la cepa 29 a las 24 horas .............................................................. 132. IX Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 11. Análisis de varianza de la producción de Ácido Indol Acético (AIA) de la cepa 35 a las 48 horas .............................................................. 133 Tabla 12. Prueba de DUNCAN de la producción de Ácido Indol Acético (AIA) de la cepa 35 a las 48 horas .............................................................. 133. DO. Tabla 13. Análisis de varianza de la producción de Ácido Indol Acético (AIA) de la cepa 24 a las 48 horas .............................................................. 134. SG RA. Tabla 14. Prueba de DUNCAN de la producción de Ácido Indol Acético (AIA) de la cepa 24 a las 48 horas .............................................................. 134. PO. Tabla 15. Análisis de varianza de la producción de Ácido Indol Acético (AIA) de la cepa 21 a las 48 horas .............................................................. 135. DE. Tabla 16. Análisis de varianza de la producción de Ácido Indol Acético (AIA) de la cepa 26 a las 48 horas .............................................................. 135. CA. Tabla 17. Análisis de varianza de la producción de Ácido Indol Acético (AIA) de. IO TE. la cepa 29 a las 48 horas .............................................................. 136 Tabla 18. Prueba de DUNCAN de la producción de Ácido Indol Acético (AIA) de la cepa 29 a las 48 horas .............................................................. 136. BL. Tabla 19. Análisis de varianza del porcentaje de inhibición de las bacterias. BI. endofíticas aisladas sobre Fusarium oxysporum a los 6 días ....... 137. Tabla 20. Prueba de DUNCAN del porcentaje de inhibición de las bacterias endofíticas aisladas sobre Fusarium oxysporum a los 6 días ....... 137 Tabla 21. Análisis de varianza de solubilización de fosfatos de las bacterias endofíticas aisladas a los 7 días ................................................... 138. X Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 22. Prueba de DUNCAN aplicado a solubilización de fosfatos de las bacterias endofíticas aisladas a los 7 días .................................... 138 Tabla 23. Evaluación de sideróforos de las bacterias endofíticas aisladas según su desempeño a los 7 días ............................................................ 43. DO. Tabla 24. Análisis de varianza de la actividad celulolítica de las bacterias endofíticas aisladas a los dos días................................................ 139. SG RA. Tabla 25. Prueba de DUNCAN aplicado a la actividad Celulolítica de las bacterias endofíticas aisladas a los dos días ................................ 139. PO. Tabla 26. Análisis de varianza de la actividad proteolítica de las bacterias endofíticas aisladas a los dos días................................................ 140. DE. Tabla 27. Prueba de DUNCAN aplicado a la actividad proteolítica de las bacterias endofíticas aisladas a los dos días ................................ 140. CA. Tabla 28. Análisis de varianza del porcentaje de germinación de semillas de. IO TE. alfalfa inoculadas con bacterias endofíticas seleccionadas luego de 24 horas ........................................................................................ 141 Tabla 29. Prueba de DUNCAN al porcentaje de germinación de semillas de. BL. alfalfa inoculadas con bacterias endofíticas seleccionadas luego de. BI. 24 horas ........................................................................................ 141. Tabla 30. Análisis de varianza del tamaño radicular de las plántulas de alfalfa inoculadas. con. bacterias. endofíticas. seleccionadas. luego. de. 5 días ............................................................................................ 142. XI Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 31. Análisis de varianza del tamaño del tallo de las plántulas de alfalfa inoculadas. con. bacterias. endofíticas. seleccionadas. luego. de. 5 días ............................................................................................ 142 Tabla 32. Prueba de DUNCAN del tamaño tallo de las plántulas de alfalfa con. bacterias. endofíticas. seleccionadas. luego. de. DO. inoculadas. 5 días ............................................................................................ 143. inoculadas. con. bacterias. SG RA. Tabla 33. Análisis de varianza del número de hojas cotiledonales en alfalfa endofíticas. seleccionadas. luego. PO. de 5 días ....................................................................................... 143 Tabla 34. Prueba de DUNCAN del número de hojas cotiledonales en alfalfa con. bacterias. endofíticas. seleccionadas. luego. DE. inoculadas. de 5 días ....................................................................................... 144. con. IO TE. inoculadas. CA. Tabla 35. Análisis de varianza del tamaño radicular de las plántulas de alfalfa bacterias. endofíticas. seleccionadas. luego. de 30 días ..................................................................................... 144 Tabla 36. Prueba de DUNCAN del tamaño radicular de las plántulas de alfalfa. BL. inoculadas. con. bacterias. endofíticas. seleccionadas. luego. BI. de 30 días ..................................................................................... 145. Tabla 37. Análisis de varianza del tamaño del tallo de las plántulas de alfalfa inoculadas. con. bacterias. endofíticas. seleccionadas. luego. de 30 días ..................................................................................... 145. XII Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 38. Prueba de DUNCAN del tamaño del tallo de las plántulas de alfalfa inoculadas. con. bacterias. endofíticas. seleccionadas. luego. de 30 días ..................................................................................... 146 Tabla 39. Análisis de varianza del número de hojas verdaderas por plántulas de. DO. alfalfa inoculadas con bacterias endofíticas seleccionadas luego de 30 días ..................................................................................... 146. SG RA. Tabla 40. Prueba de DUNCAN del número de hojas verdaderas por plántulas de alfalfa inoculadas con bacterias endofíticas seleccionadas luego de. PO. 30 días .......................................................................................... 147 Tabla 41. Pruebas de promoción de crecimiento realizadas para las cepas 52. BI. BL. IO TE. CA. DE. bacterianas endofíticas aisladas .................................................... XIII Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE DE FIGURAS. Figura 1. Colectando las muestras de tomate silvestre en la localidad de pedregal – Trujillo........................................................................ 122. DO. Figura 2. Lugar de colecta Solanum pimpinellifolium en la provincia de Trujillo localidad de pedregal .................................................................. 122. SG RA. Figura 3. Prensando el material biológico para su posterior identificación.. 123 Figura 4. Selección, corte y desinfección de raíz, tallo y hojas de. PO. Solanum pimpinellifolium ............................................................ 123 Figura 5. Cepas bacterianas endofíticas presentes en los tejidos desinfectados. DE. .................................................................................................... 124 Figura 6. Aislamiento de cepas bacterianas endofíticas por siembra en estrías. CA. en placas con TSA ...................................................................... 124. IO TE. Figura 7. Siembra de cepas bacterianas endofíticas en tubos inclinados ... 125 Figura 8. Almacenamiento de cepas bacterianas endofíticas en tubos inclinados. BL. .................................................................................................... 125. Figura 9. Realizando las pruebas promotoras de crecimiento .................... 126. BI. Figura 10. Realizando pruebas de producción de AIA ................................ 126 Figura 11. Curva estándar de producción de AIA ....................................... 127 Figura 12. Realizando pruebas de sideróforos ........................................... 127 Figura 13. Revelación de actividad celulolítica en las cepas bacterianas endofíticas aisladas..................................................................... 128. XIV Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 14. Producción de AIA (μg/mL) de las cepas bacterianas endofíticas aisladas a 24 horas ...................................................................... 34. Figura 15. Producción de AIA (μg/mL) de las cepas bacterianas endofíticas aisladas a 48 horas ...................................................................... 36. DO. Figura 16. Porcentaje de inhibición del crecimiento de Fusarium oxysporum por cepas bacterianas endofíticas aisladas........................................ las cepas bacterianas aisladas sobre. SG RA. Figura 17. Actividad antagónica de. 38. Fusarium oxysporum a los 6 días ................................................ 40. PO. Figura 18. Solubilización de fosfatos de las cepas bacterianas endofíticas aisladas a los 7 días..................................................................... 41. DE. Figura 19. Confirmación de solubilización de fosfatos por las formación de un halo transparente alrededor del disco correspondiente a las cepas. CA. 35, cepa 26 y cepa 21 con respecto a su control negativo a los 7 días 42. IO TE. ..................................................................................................... Figura 20. Confirmación de producción de sideróforos por el cambio de coloración de azul a amarillo alrededor del disco correspondiente a. BL. las cepas 32, 23, 20, 29, 24 y 26 con respecto a su control negativo a. BI. los 7 días...................................................................................... 45. Figura 21. Evaluación de la actividad celulolítica de las cepas bacterianas endofíticas a los 2 días ................................................................ 46. Figura 22. Confirmación de actividad celulolítica por la formación de un halo amarrillo alrededor del disco correspondiente a las cepas 35, cepa 24 y cepa 29 con respecto a su control negativo a los dos días ....... 47. XV Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 23. Evaluación de la actividad proteolítica de las cepas bacterianas endofíticas aisladas a los dos días............................................... 48. Figura 24. Confirmación de actividad proteolítica por la formación de un halo transparente alrededor del disco correspondiente a las cepas 20, 31,. DO. 21, 24 y 35 con respecto a su control negativo a los dos días. Cepas con actividad proteolítica alta ....................................................... 50. SG RA. Figura 25. Confirmación de actividad proteolítica por la formación de un halo transparente alrededor del disco correspondiente a las cepas 42, 29. PO. y 27 con respecto a su control negativo. Cepas con actividad proteolítica media ......................................................................... 51. DE. Figura 26. Porcentaje de germinación de semillas de alfalfa inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 24 horas. 54. CA. Figura 27. Germinación de semillas de alfalfa a las 24 horas después de ser. IO TE. inoculadas con las cepas 29, 31, 26, 23, 21, 35 y 24................... 56. Figura 28. Tamaño radicular de las plántulas de alfalfa inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 5 días de haber. BL. germinado las semillas de alfalfa ................................................. 57. BI. Figura 29. Evaluando el tamaño radicular de las semillas de alfalfa inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 5 días de haber germinado las semillas de alfalfa ....................................... 58. Figura 30. Tamaño del tallo de las plántulas de alfalfa inoculadas con las cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 5 días de haber germinado las semillas de alfalfa ................................................. 59. XVI Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 31. Evaluando el tamaño del tallo de las semillas de alfalfa inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 5 de haber germinado las semillas de alfalfa ................................................. 60. Figura 32. Número de hojas cotiledonales en alfalfa después de ser inoculadas. DO. con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas a los 5 día de habergerminado las semillas de alfalfa ........................................ 61. SG RA. Figura 33. Evaluando el número de hojas cotiledonales de las plántulas de alfalfa inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas 62. PO. luego de 5 días de haber germinado las semillas de alfalfa......... Figura 34. Tamaño radicular de las semillas de alfalfa inoculadas con cepas. DE. bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 30 días de haber germinado las semillas de alfalfa ................................................. 63. CA. Figura 35. Evaluando el tamaño radicular de las semillas de alfalfa inoculadas. IO TE. con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 30 días de haber germinado las semillas de alfalfa ....................................... 64. Figura 36. Tamaño del tallo de las semillas de alfalfa inoculadas con cepas. BL. bacterianas endofíticas seleccionadas luego de 30 días de haber. BI. germinado las semillas de alfalfa ................................................. 65. Figura 37. Evaluando el tamaño del tallo de las semillas de alfalfa inoculadas con bacterias endofíticas seleccionadas luego de 30 días de haber germinado las semillas de alfalfa ................................................. 66. XVII Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 38. Número de hojas verdaderas en alfalfa después de ser inoculadas con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas a los 30 días de haber germinado las semillas de alfalfa ....................................... 67. Figura 39. Número de hojas verdaderas en alfalfa después de ser inoculadas. DO. con cepas bacterianas endofíticas seleccionadas a los 30 días de haber germinado las semillas de alfalfa ....................................... 68. SG RA. Figura 40. Fenograma expresado en las relaciones de las cepas bacterianas endofíticas identificadas taxonómicamente similares basados en las. PO. secuencias del gen 16S rDNA . Número de acceso TheGenBank se da para cada organismo. Las posiciones de las cepas de endófitos. DE. están basadas en el mejor grupo para género y especie de la Cepa 21 ................................................................................................. 71. CA. Figura 41. Fenograma expresado en las relaciones de las cepas bacterianas. IO TE. endofíticas identificadas taxonómicamente similares basados en las secuencias del gen 16S rDNA . Número de acceso TheGenBank se da para cada organismo. Las posiciones de las cepas de endófitos. BL. están basadas en el mejor grupo para género y especie de la Cepa. BI. 24 ................................................................................................. 72. Figura 42. Fenograma expresado en las relaciones de las cepas bacterianas endofíticas identificadas taxonómicamente similares basados en las secuencias del gen 16S rDNA . Número de acceso TheGenBank se da para cada organismo. Las posiciones de las cepas de endófitos. XVIII Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. están basadas en el mejor grupo para género y especie de la Cepa 26 ................................................................................................. 73. Figura 43. Fenograma expresado en las relaciones de las cepas bacterianas endofíticas identificadas taxonómicamente similares basados en las. DO. secuencias del gen 16S rDNA . Número de acceso TheGenBank se da para cada organismo. Las posiciones de las cepas de endófitos. SG RA. están basadas en el mejor grupo para género y especie de la Cepa 29 ................................................................................................. 74. PO. Figura 44. Fenograma expresado en las relaciones de las cepas bacterianas endofíticas identificadas taxonómicamente similares basados en las. DE. secuencias del gen 16S rDNA . Número de acceso TheGenBank se da para cada organismo. Las posiciones de las cepas de endófitos. CA. están basadas en el mejor grupo para género y especie de la Cepa 75. BI. BL. IO TE. 35 ................................................................................................. XIX Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE DE SECUENCIAS. DO. Secuencia 1: gen 16s rRNA de Yokenella sp. Cepa 21.............................. 148. SG RA. Secuencia 2: gen 16s rRNA de Bacillus subtilis Cepa 24 ........................... 149. PO. Secuencia 3: gen 16s rRNA de Paenibacillus sp. Cepa 26 ........................ 150. DE. Secuencia 4: gen 16s rRNA de Serratia liquefaciens Cepa 29 ................... 151. BI. BL. IO TE. CA. Secuencia 5: gen 16s rRNA de Bacillus subtilis Cepa 35 ........................... 152. XX Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Efecto de bacterias endofíticas aisladas de Solanum pimpinellifolium sobre el crecimiento de Medicago sativa. RESUMEN. BI. BL. IO TE. CA. DE. PO. SG RA. DO. La inoculación de semillas con bacterias promotoras de crecimiento vegetal incide de forma positiva en la germinación y emergencia de las semillas; además su aplicación sobre plantas jóvenes puede llevar a la obtención de plantas de tamaño homogéneo, vigorosas y con desarrollo radicular adecuado para su trasplante a campo. En tal sentido se determinó el efecto de las bacterias endofíticas aisladas de Solanum pimpinellifolium sobre la germinación y crecimiento de Medicago sativa, como una alternativa para optimizar el manejo agronómico. Se colectaron muestras de S. pimpinellifolium en la localidad de Pedregal – Trujillo, se aislaron las bacterias endofíticas de las raíces, hojas y tallo usando técnicas microbiológicas. Las cepas aisladas fueron evaluadas en la capacidad de producir AIA, sideróforos, solubilizar fosfatos, actividad celulolítica, actividad proteolítica y actividad antagónica in vitro sobre Fusarium oxysporum. Las cepas con mejores propiedades fueron inoculadas sobre semillas de Medicago sativa en condiciones in vitro y se evaluó el porcentaje de germinación, crecimiento radicular, crecimiento del tallo, formación de hojas cotiledonales y verdaderas. La identificación taxonómica de las cepas se realizó mediante el análisis del gen 16S del ADN ribosomal. De las doce cepas endofíticas aisladas, 5 produjeron AIA, 12 tuvieron efecto antagónico sobre Fusarium oxyporum, 3 solubilizaron fosfatos, 6 produjeron sideróforos, 3 presentaron actividad celulolítica, y 8 presentaron actividad proteolítica. Se seleccionaron 5 cepas que fueron inoculadas por separado, las cuales indujeron al mayor porcentaje de germinación, crecimiento de la raíz y tallo, formación de hojas cotiledonales y verdaderas en Medicago sativa “alfalfa”. De acuerdo a la identificación taxonómica molecular las cepas 24 y 35 correspoden a Bacillus subtilis; las cepas 21, 29 y 26 pertenece a los géneros Yokenella, Serratia y Paenibacillus respectivamente. Estos resultados, indican que Solanum pimpinellifolium se encuentra asociada a bacterias endofíticas con cualidades apropiadas para promover crecimiento de Medicago sativa. Palabras claves: AIA, antagonismo, Fusarium oxysporum, sideróforos, celulolítico, proteolíticos, solubilización fosfatos, germinación, y caracterización molecular.. XXI Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Efecto de bacterias endofíticas aisladas de Solanum pimpinellifolium sobre el crecimiento de Medicago sativa. ABSTRACT. BI. BL. IO TE. CA. DE. PO. SG RA. DO. Seed inoculation with plant growth promoting bacteria has a positive effect against seed germination and emergence; besides its application against young plants can lead to the obtaining of plants with homogeneous size, vigorous and adequate root development for their field transplant. In this sense, the effect of isolated endophytic bacteria from Solanum pimpinellifolium against the germination and growth of Medicago sativa was determined as an alternative to optimize agronomic management. Samples of S. pimpinellifolium were collected in the locality of Pedregal - Trujillo, the endophytic bacteria of roots, leaves and stem were isolated using microbiological techniques. The isolated strains were evaluated for their ability to produce AIA, siderophores, phosphate solubilization, cellulolytic activity, proteolytic activity and antagonistic activity in vitro against Fusarium oxysporum. The strains with better properties were inoculated on Medicago sativa seeds under in vitro conditions, and the germination percentage, root growth, stem growth, cotyledonal and true leaf formation were evaluated. The taxonomic identification of the strains was performed by 16S gene of the ribosomal DNA analysis. Of the twelve endophytic strains isolated, 5 produced AIA, 12 had antagonistic effect against Fusarium oxyporum, 3 solubilized phosphates, 6 produced siderophores, 3 had cellulolytic activity, and 8 had proteolytic activity. Five strains selected were inoculated separately, and induced the highest percentage of germination, root and stem growth, cotyledonal and true leaves formation in Medicago sativa "alfalfa". According to the molecular taxonomic identification strains 24 and 35 were Bacillus subtilis; the strains 21, 29 and 26 belong to the genera Yokenella, Serratia and Paenibacillus respectively. These results show that Solanum pimpinellifolium is associated with endophytic bacteria with appropriate properties to promote growth of Medicago sativa. Keywords: AIA, antagonism, Fusarium oxysporum, siderophores, cellulolytic, proteolytic, phosphate solubilization, germination and molecular characterization.. XXII Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1.. INTRODUCCIÓN. El tomate cultivado Solanum lycopersicum L. es una de las hortalizas de mayor importancia para la alimentación humana, su consumo y uso es de manera. DO. fresca o industrialmente; es así que después de la papa es el segundo cultivo. SG RA. vegetal de mayor consumo y como cultivo de jardín es el más popular en el mundo (Foolad et al., 2012).. PO. A pesar de la gran cantidad de cultivares de esta especie; el cultivo de tomate se encuentra expuesto a una serie de limitaciones tal como la baja calidad, el. DE. empobrecimiento del suelo y el uso. indiscriminado de agroquímicos. CA. (Hernández; 2011); siendo susceptible a una amplia variedad de plagas y. IO TE. enfermedades capaces de ocasionar pérdidas del cultivo (Labate et al., 2007).. A pesar de la amplia variabilidad genética presente y explotable en las especies. BL. silvestres de Solanum existen pocos cultivares con resistencia a plagas; entre. BI. ellas esta el S. habrochaites, S. Knapp, S. peruvianum y S. pennellii Correll (Razdan, 2007), S. lycopersicum , S. pimpinellifolium, S. cheesmaniae, S. chmielewskii y S. chilense (Farrar, 1991).. El Solanum pimpinellifolium L. “tomate silvestre”, según Mostacero y Mejía, (2002) es una especie herbácea de 4 – 5 m de alto con flores amarillas, nativa. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. de América y probablemente del Perú. Se extiende desde Ecuador hasta Bolivia y Norte de Chile; crece entre los cultivos, laderas abiertas y rocosas, suelos arcillosos, arenosos y pedregosos de aluvión ubicadas entre los 130 – 2700. DO. m.s.n.m. en los departamentos de la Libertad, Cajamarca, Lima y Arequipa.. La investigación minuciosa de todas las alternativas que puedan aumentar la. SG RA. producción y favorecer el cultivo del tomate en favor de la economía de nuestro país ha estimulado el estudio de la posibilidad de disminuir el uso de. PO. agroquímicos en el cultivo de tomate y sugiere que el uso de la fertilización. DE. orgánica y el uso de inoculantes microbianos (Matson et al., 1977).. En este sentido, el interés por organismos benéficos que incrementan la. CA. productividad, mejoran la salud de la planta y que reduzcan el uso. IO TE. indiscriminado de agroquímicos, ha permitido generar alternativas de el control biológico para el manejo de plagas y enfermedades entre ellos se encuentra el. BL. uso de endofíticos (Hernández, 2011).. BI. Se define como endofíticos vegetales a aquellos organismos no agresivos que viven dentro de tejidos vegetales y en los últimos años han adquirido gran importancia como una alternativa de control biológico debido a la creciente necesidad de disminuir el uso de agroquímicos en los sistemas de producción agrícola (Petrini, 1986).. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La palabra endófito se deriva del griego endon, que significa dentro y phyte que significa planta; de Barry fue el primero en utilizar este término (Wang et al., 2006). Hasta la fecha, el término endófitos se refiere a los microorganismos que pueden ser aislados de tejidos vegetales desinfestados por superficie o. DO. extraídos del interior de la planta (Shulz y Boyle, 2006).. SG RA. También se puede definir como microorganismos que colonizan espacios intercelulares y vasculares en plantas sin expresar patogenicidad (Wang et al., 2006). Anteriormente se desconocían las funciones de los endófitos;. PO. inicialmente fueron consideradas como patógenos latentes o contaminantes de. DE. una incompleta desinfestación de la superficie (Compant et al., 2005).. Sin embargo, en la actualidad varios reportes han demostrado que las. CA. microorganismos endofíticos son capaces de promover el crecimiento y la salud. IO TE. de la planta (Compant et al., 2005). Los microorganismos endofíticos también inhiben patógenos, ayudan a remover contaminantes, solubilizan fosfatos y. BL. contribuyen a asimilar el nitrógeno por las plantas (Wang et al., 2006).. BI. La inducción de crecimiento vegetal por microorganismos puede ser a consecuencia de la fijación de nitrógeno o la producción de fitohormonas, biocontrol de fitopatógenos en la zona de raíz a través de la producción de agentes antifúngicos, antibacteriales, producción de sideróforos o inmunidad (Sessitsch et al., 2002).. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Las bacterias endofíticas presentes en las plantas son muy diversas, en una misma planta se han encontrado varias especies de endófitos, es así que los estudios moleculares sobre diversidad de bacterias endofíticas han revelado una gran riqueza de géneros y especies endofíticas en las misma planta. DO. (Rosenblueth y Martínez, 2006).. SG RA. El número de bacterias endofíticas varía por planta y región que colonizan; por ejemplo, existen reportes de poblaciones endofíticas en raíz de arroz de 102 a 103 UFC g-1 de peso fresco (Gyaneshwar et al, 2001). También se reportó en. PO. cítricos de 103 a 104 UFC g-1 peso fresco (Araujo et al., 2002) y en caña de. DE. azúcar 102 a 106 UFC g-1 peso fresco (Mendes et al., 2007).. CA. Dentro de los mecanismos realizados por las bacterias endofíticas promotoras del crecimiento vegetal encontramos dos tipos, mecanismos directos e. IO TE. indirectos; los mecanismos directos son aquellos donde los microorganismos actúan sobre la planta, como la producción de fitohormonas por ejemplo. BI. BL. auxinas, gliberelinas y citoquininas (Bobadilla y Rincón, 2008).. La producción de estos metabolitos generan una mejor regulación de estomas, evitando su deterioro asociado a depresión del crecimiento y síntomas de marchitamiento en la planta (Reyes et al., 2008). Ocasionan también un desarrollo radicular más ramificado jugando un papel fundamental en la absorción de agua y nutrientes (Rivieros, 2008).. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Las auxinas participan en la mitosis, alargamiento celular, formación de raíces adventicias,. dominancia. apical,. gravitropismo,. floración,. emergencia. y. elongación radicular (Hans et al., 1997). Las auxinas sintetizadas durante el proceso de germinación por el endospermo y embrión; inducen el alargamiento. DO. de los meristemos radiculares primarios y el tallo (Li et al., 2008).. SG RA. Dentro del grupo de las auxinas, el ácido indol acético (AIA), es una de las auxinas naturales más importantes que pueden ser sintetizadas por diferentes especies de bacterias, hongos y algas (Bobadilla y Rincón, 2008). Entre los más. PO. destacados encontramos a los géneros bacterianos Azospirillum, Azotobacter,. DE. Pseudomonas, Rhyzobium y Bacillus (Patten y Glick, 2002).. CA. Aunque la producción de estas fitohormonas por parte de los microorganismos está debidamente documentada, aún no se encuentran muchos estudios acerca. IO TE. de los efectos fisiológicos que producen en ellos mismos (Tudzinzki y Sharon, 2002). Las bacterias que habitan en varias plantas son capaces de estimular la. BI. BL. producción de auxinas, gracias a su acción elicitora (Waisel, 2002).. Las vías de síntesis de AIA en bacterias son diversas y varios genes están implicados en su regulación y expresión; como la vía del indol-3-acetamida (IAM) en fitopatógenos y la vía del ácido indol-3-pirúvico (IpyA) en bacterias benéficas (Lambrecht et al., 2000). Los genes responsables de la síntesis de AIA, se encuentran en plásmidos o integrados a cromosomas (Kapulnik, 2002).. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Según Hans et al. (1997), la síntesis de AIA es a partir del L-triptófano que puede estar libre o formando parte de proteínas, donde una transaminasa se transforma en ácido indolpirúvico el cual se descarboxila por acción de una descarboxilasa formándose indol-acetaldehído; luego actúa una oxidasa que lo. DO. transforma en ácido indol acético.. SG RA. Existen otras vías de síntesis que conducen al compuesto mediante la formación intermedia de triptamina, o bien mediante un intermediario nitrílico. PO. (Hans et al., 1997). Por lo tanto, existen dos vías principales de producción de AIA en bacterias: la vía indol-3-piruvato (IpyA) y la vía indol-3-acetamida (IAM),. DE. ambas son dependientes de triptófano (Lambrecht et al., 2000).. CA. El aminoácido triptófano se considera el mayor precursor de la síntesis de las. IO TE. auxinas; sin embargo los mutantes auxotrófos de tiptófano mostraron evidencia de una ruta de síntesis independiente de triptófano (Patten y Glick, 2002) en la que se utiliza el indol-3-glicerol fosfato como precursor, pero esta es poco. BI. BL. conocida (Soberón et al., 2005).. Adicionalmente, las bacterias endofíticas pueden promover el crecimiento vegetal mejorando la disponibilidad de fosfatos en el suelo mediante la solubilización (Bobadilla y Rincón, 2008). Los géneros Pseudomonas, Bacillus, Serratia, Enterobacter Flavobacterium, Streptomyces y otros; son capaces de solubilizar in vitro fosfatos insolubles en el suelo (Mehta y Nautiyal, 2001). 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Hameeda et al. (2008), reportaron que las bacterias Serratia marcescens EB 67 y Pseudomonas sp. incrementan la producción de biomasa en plantas de maíz en condiciones de campo e invernadero, mediante la capacidad de solubilizar. DO. fosfatos; en varios trabajos se han aislado y caracterizado de diversas especies. SG RA. vegetales bacterias rizosféricas solubilizadoras de fósforo.. Por ejemplo, Fernández et al. (2005) estudiaron la habilidad para solubilizar. PO. fosfatos de diferentes grupos bacterianos y cepas de Bradyrhizobium sp. aislados de suelos soyeros, la evaluación fue en función del tamaño de los. DE. halos que las cepas generaban al crecer en un medio con fosfatos insolubles. CA. como fuente de fósforo y del porcentaje de fosfato solubilizado en medio líquido.. IO TE. En el medio natural, la solubilización del fosfato debe ocurrir en la rizósfera debido a la lenta difusión del fosfato en el suelo y la falta de sustratos fuera de la zona rizosférica; además los exudados radicales y residuos vegetales. BL. proveen el sustrato energético para soportar la intensa actividad microbiológica. BI. como solubilizadores de fosfato (Burbano, 1989).. La solubilización de fosfatos por bacterias se da por secreción de ácidos orgánicos como el láctico, oxálico y cítrico (Mehta y Nautiyal, 2001). En los medios utilizados para establecer la acción fosfato solubilizadora a nivel in vitro. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. se desarrollan zonas claras alrededor de las colonias microbiales, las cuales indican un viraje en el pH del medio por los ácidos orgánicos (Burbano, 1989).. Las bacterias fosfato solubilizadoras como Bacillus megaterium y Pseudomonas fluorescens producen fosfatasas o ácidos orgánicos que solubilizan formas. DO. orgánicas e inorgánicas de fósforo no disponible en la solución del suelo (Mehta. SG RA. y Nautiyal, 2001). Los mecanismos que emplean las bacterias para solubilizar compuestos insolubles de fósforo son varios y se citan a continuación.. PO. La acidificación del medio permite la liberación de fosfato en condiciones alcalinas (Arcand y Schneider, 2006). Algunos de los principales ácidos. DE. orgánicos producidos por bacterias son el ácido glucónico y el ácido 2-. CA. cetoglucónico; también se producen los ácidos láctico, isovalérico, isobutírico,. IO TE. acético, glicólico, oxálico, malónico y succínico (Rodríguez y Fraga, 1999).. Los ácidos orgánicos no son las únicas estrategias, algunas bacterias liberan. BL. ácidos sulfúrico y nítrico durante la actividad quimioautótrofa oxidante de. BI. amonio y azufre, por ejemplo el género Thiobacillus (Fernández et al., 2005; Vassilev et al., 2006). Según Martin (1980), la secreción de sustancias quelantes, es otra manera en que las bacterias solubilizan el fósforo.. Los aniones de los ácidos orgánicos pueden solubilizar fósforo a través de reacciones de quelación; que son reacciones en las que se forman dos o más. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. enlaces coordinados entre moléculas aniónicas o polares y un catión, resultando una estructura de anillo también denominada complejo (Rodríguez y Fraga, 1999).. DO. Los aniones de ácidos orgánicos, son capaces de formar complejos estables con cationes tales como el Ca+2, Fe+2, Fe+3 y Al+3, que comúnmente están. SG RA. unidos con fosfato en compuestos insolubles (Arcand y Schneider, 2006). A parte del fósforo, la concentración de hierro disponible en el suelo constituye. PO. una limitación para el desarrollo de las plantas (Rodríguez y Fraga, 1999).. DE. Del cual los microorganismos requieren hierro para su crecimiento, ya sea mediante la producción y excreción de sideróforos que son agentes quelantes. CA. de bajo peso molecular de alta especificidad por Fe3+, formando un complejo Fe. IO TE. sideróforo; reconocidos y transportados al citosol por una proteína receptora específica de membrana la externa (Hantke, 2001; Mehta y Nautiyal, 2001).. BL. En este sentido, la capacidad que tienen muchas bacterias de internalizar el. BI. hierro no disponible es fundamental para la obtención de este; las formas en que lo logran son por la producción de sideróforos y ácidos orgánicos que pueden formar complejos de hierro mejorando sus sistemas de asimilación (Montie, 1998).. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Una vez en el citoplasma se produce la liberación de hierro de los sideróforos por una reducción de Fe (III) a Fe (II) (Faraldo y Sansom, 2003). El gen fur, se encuentra en todas las especies bacterianas que han sido secuenciadas; es el encargado de regular las proteínas encargadas de la captación de hierro y de. DO. almacenamiento y uso de hierro (Miethke y Marahiel, 2007).. SG RA. Según Hantke ( 2001), la proteína Fur (ferric uptake regulation) es la encargada de regular la expresión de genes implicados en la captación de hierro. El. PO. reconocimiento ocurre cuando la proteína Fur forma un complejo con Fe II, por lo cual la transcripción de estos genes se bloquea en presencia de hierro y así. DE. se inhiben los procesos de captación almacenamiento y uso de hierro.. CA. La estructura de los sideróforos así como la biosíntesis varían según las. IO TE. especies; sin embargo, se coincide que hay tres tipos de sideróforos según su estructura y los grupos quelantes que poseen: los hidroxamatos poseen ácidos hidroxámicos en su estructura, los catecolatatos contienen anillos catecol y los. BI. BL. carboxilatos contienen grupos hidroxiácidos (Miethke y Marahiel, 2007).. Mientras que algunas bacterias producen un tipo de sideróforos, otras secretan varias siendo más eficientes al permitirles colonizar diferentes hábitats; por ejemplo, E. coli produce dos tipos de sideróforos: enterobactina y aerobactona (Montie, 1998). Estas también son consideradas sideróforos primarios en Shigella sp., Salmonella sp., Klebsiella sp. y Yersinia sp. (Kapulnik, 2002). 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En el caso de los sideróforos producidos por Pseudomonas fluorescens; se ha observado pioverdinas o piocianinas que se producen en ausencia de hierro soluble (Montie, 1998). Una forma de detectar su presencia es la siembra en agar King B donde los pigmentos difusibles (piverdinas o piocianinas) presentan. DO. o no fluorescencia y difusión en el medio (Kapulnik, 2002).. SG RA. El significado ecológico de los sideróforos por parte de las bacterias endofíticas reside en su capacidad para capturar un nutriente esencial del medio y de privar. PO. a los competidores de él, en un ambiente en el cual el hierro es escaso (Montie, 1998). Se conocen más de 500 sideróforos en bacterias Gram negativas y. DE. positivas (Kapulnik, 2002).. CA. Por otro lado, la presencia de bacterias con actividad proteolíticas que pueden. IO TE. mejorar la disponibilidad de nitrógeno; estos microorganismos son capaces de degradar proteínas extracelularmente; por lo tanto, participan en los procesos de mineralización del N proteínico de los residuos orgánicos (Robertson y. BI. BL. Groffman, 2007).. Este grupo de microorganismos es importante porque inician el ciclaje del N en el suelo a partir de residuos orgánicos; además, su actividad permite la liberación de aminoácidos y amonio que pueden ser utilizados directamente por las plantas o microorganismos del suelo o en el proceso de nitrificación (Hofmockel et al., 2010). 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Del mismo modo, se ha demostrado que las bacterias endofíticas ayudan a disminuir la resistencia a la conductividad hidráulica, permitiendo a las plantas una mayor tolerancia a la sequía (Rivieros, 2008). Los mecanismos indirectos son aquellos en donde el microorganismo es capaz de inhibir diferentes. DO. patógenos que interfieren con el desarrollo de la planta (Shulz y Boyle; 2006).. SG RA. Los fitopatógenos como hongos y bacterias son neutralizados por diversos mecanismos propios de las bacterias endofíticas asociadas a las plantas; por ejemplo, competencia por espacio o nutrientes, producción de metabolitos. PO. antibióticos y secreción de diversas enzimas hidrolíticas que degradan la pared. DE. celular de los patógenos (Reyes et al., 2008).. CA. Se ha evidenciado la producción de sideróforos por bacterias, hongos y plantas. IO TE. monocotiledóneas en respuesta al estrés por escases de hierro (Perez et al., 2007). Como la biodisponibilidad de hierro es limitada en el suelo, la producción. BL. de sideróforos por las bacterias juega un papel importante en la competencia por este recurso porque tienen una mayor afinidad que los producidos por. BI. hongos, limitando así a posibles patógenos (Compant et al., 2005).. Según Ramírez (1998) en los últimos años, la superficie dedicada al cultivo de tomate ha disminuido gradualmente debido a diversos factores, entre ellos: la incidencia creciente de plagas y enfermedades. Aunque en Sinaloa se conocen. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. al menos 10 enfermedades radiculares vasculares del tomate, la más importante es el marchitamiento vascular o fusariosis (Fusarium oxysporum).. Esta enfermedad es más agresiva en climas cálidos y suelos con textura. DO. arenosa; sin embargo, fuertes infecciones en cultivares susceptibles se han reportado bajo condiciones de invernaderos y los daños se presentan con. SG RA. mayor severidad cuando las plantas son sometidas a un período de estrés. PO. hídrico, principalmente en la etapa de floración y fructificación (González, 1974).. DE. Según Girlanda (2001), Pseudomona fluorescens puede ejercer control biológico sobre hongos fitopatógenos y puede deberse a dos mecanismos: a). CA. la producción de sideróforos al secuestrar el hierro quedaría no disponible para. IO TE. los fitopatógenos y b) la producción de distintos antibióticos capaces de suprimir. BL. el crecimiento de hongos patógenos en cultivos agrícolas.. BI. Existen referencias bibliográficas de los últimos cinco años que contienen una gran variedad de información científica donde los autores exponen el porcentaje de inhibición micelial máximo obtenido en sus ensayos de antagonismo entre bacterias y diferentes formas especiales de Fusarium oxysporum evaluadas (González, 1974).. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Se pudo evidenciar que en algunos casos el mejor desempeño in vitro alcanza un 18% de inhibición micelial del patógeno, mientras que en otros casos hubo 100% de inhibición; las bacterias evaluadas en las diferentes investigaciones provienen en su mayoría de la rizósfera de la planta de interés y en algunos. SG RA. DO. casos la procedencia fue de la rizósfera de otras plantas (Nandhini et al., 2012).. Nandhini et al. (2012), han encontraron antagonismos frente a Fusarium oxysporum de los géneros Streptomyces sp. y Bacillus sp. con porcentajes de. PO. inhibición de 18% aproximadamente (Rocha y Moura, 2013), de Bacillus subtilis. DE. con 46.04% (Ramyabharathi y Raguchander, 2014), de Bacillus sp. con 50% y. CA. de Pseudomonas sp. con 70%.. IO TE. Todas estas bacterias provenían de rizósfera de tomate, excepto el Streptomyces sp. que fue aislado de rizósfera de árboles de naranja. Por lo. BL. tanto, se puede notar que existe gran variedad en la capacidad antagónica de. BI. los diferentes géneros de bacterias, aun cuando el patógeno es el mismo y provienen en su mayoría de la misma planta (Rocha y Moura, 2013).. Según Valencia et al. (2005), el mecanismo antagónico de la cepa Pseudomonas fluorescens ZUM80 en concentraciones menores de hierro,. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. mostraron la inhibición total del hongo Fusarium oxysporum a menos 48 horas de la siembra. Pero en condiciones de suficiencia de hierro, la cepa ZUM80. DO. perdió su capacidad para inhibir al hongo.. La actividad proteolítica de las bacterias endofíticas podrían jugar un papel. SG RA. antagónico en hongos e insectos, habiéndose observado que podrían estar involucradas dentro del proceso de patogenicidad (López et al., 2002). Otro mecanismo indirecto es el incremento de la capacidad de respuesta sistémica. DE. PO. de la planta frente a los patógenos (Vessey, 2003).. CA. También se debe considerar que una bacteria promotora de crecimiento puede tener diferentes mecanismos para beneficiar a su hospedero vegetal como la. IO TE. producción de fitohormonas, sideróforos, solubilizar fosfatos y además presentan antagonismo con uno o varios patógenos de plantas, es decir los. BI. BL. mecanismos no son excluyentes (Rodríguez y Fraga, 1999).. En los años 70 se demostró que la baja tasa de germinación de algunas semillas de hortalizas podía ser aumentada mediante el tratamiento con cepas de Pseudomonas sp. (Kapulnik, 2002). Eklund (1970), sugirió que las quinonas sintetizadas por las bacterias promotoras de crecimiento eran las responsables de este fenómeno induciendo un incremento en la emergencia de las semillas.. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Posteriormente, el mismo evento fue reportado en Canadá en la emergencia de semillas de soya y canola (Kapulnik, 2002). Es evidente que las hormonas vegetales juegan un papel importante en el proceso de germinación y su. DO. aplicación exógena mejora el proceso (Eklund, 1970), y las bacterias son una. SG RA. fuente potencial exógena de hormonas vegetales (Rojas, 1987).. La diversidad de bacterias dispersas en la naturaleza es difícil de estudiar. PO. debido a la complejidad de sus hábitats y problemas para obtener cultivos puros, desconociéndose hasta el 99% de estos (Vandamme et al., 1996). En. DE. algunos casos se conoce parcialmente sus requerimientos metabólicos y en. CA. otros requieren períodos de incubación prolongados (Lathe, 1985).. IO TE. Sin embargo, en los últimos años se han descrito técnicas moleculares aplicadas a la ecología microbiana; las cuales han facilitado la identificación y clasificación de microorganismos que incluso se encuentran como parásitos,. BL. saprofitos, comensales, simbiontes o endófitos de las plantas (Rademaker et. BI. al., 2005).. Entonces, las técnicas moleculares basados en el secuenciamiento del ADN es utilizada para la identificación taxonómica y se aplica por la necesidad de establecer un sistema de identificación de nuevos microorganismos que. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. complemente la identificación morfológica y química (Vandamme et al., 1996), donde la mas utilizada es del gen ARNr 16S (Lathe, 1985).. aproximadamente. 1500. nucleótidos,. que. DO. El gen ribosómico 16S (Woese, 1987) conocido también como 16S ADNr tiene además. de. tener. regiones. SG RA. conservadas que permiten el estudio de las relaciones entre taxones distantes, contiene regiones muy variables que se utilizan en la diferenciación de géneros. PO. y especies (Stackebrandt et al., 2002).. DE. Por otro lado, el uso de bacterias endofíticas para la mejora de la planta en su producción y en la disminución del uso de agroquímicos para no contaminar. CA. agua y suelos se está convirtiendo en una práctica más ampliamente aceptada. IO TE. en muchos países como Australia, Bélgica, Egipto, Nueva Zelanda, Rusia, Los Países Bajos y EE.UU (Rodríguez y Fraga, 1999).. BL. El producto comercial "Azotogen" contiene Azotobacter que se introdujo en. BI. Rusia durante 1937, así mismo el biofertilizante "Azogreen" es usado comercialmente por los productores de maíz en Francia; en Cuba varios biofertilizantes esta compuesto por cepas de Azotobacter, Rhizobium, Azospirillum y Burkholderia que se producen comercialmente y se emplean en diferentes cultivos (Fages, 1994).. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Considerando lo anterior, en el presente trabajo se aislaron 12 cepas bacterianas endofíticas de Solanum pimpinellifolium los cuales se evaluaron las capacidades de promoción de crecimiento vegetal en la producción de AIA a 24 y 48 horas, efecto antagónico sobre Fusarium oxysporum, solubilización de. DO. fosfatos, sideróforos, actividad celulolítica y actividad proteolítica a fin de seleccionar 5 cepas bacterianas endofíticas y evaluar sus efectos sobre la. SG RA. germinación y el crecimiento de Medicago sativa, lo cual servirá de referente. BI. BL. IO TE. CA. DE. PO. para posteriores estudios y aplicaciones biotecnológicas.. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.