I N F O R M E D E L P R O Y E C T O D E INVESTIGACION

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I N F O R M E D E L P R O Y E C T O D E INVESTIGACION

JAISLAMIENTO, PURIFICACION Y

P R U E B A S BIOLOGICAS D E

E X T R A C T O T O T A L D E TIMO BOVINO.

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M a r g a r i t a L a d o Sanz

y' I n g . Bioq, Ind.

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CPS

J D r . Salvador Martínez C a i r o Ciieto Jefe d e l Depto. d e Inrnunología, A l e r g i a y Keumatoiogía _{. e}

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A s e s o r A s e s o r Interno

OBTENCION Y ACTIVIDAD bIOLOGICA DE TIMOSINA BOVINA

Introducción

.

El estudio de l a s hormonas tímicas s e inician en e l año d e 1930 con l a s

investigaciones s o b r e e l efecto de la radiación s o b r e

la

capacidad d e regenera

-

c i l n del timo en envolturas artificiales ( 1 ) . E n e s t a m i s m a época s e demostró

-

que l o s implantes de titrio de conejos y coballos, previamente radiados y deplc

tados de timocitos c o r t i c a l e s , inducian hipoplasia de l o s tiódulos linfoides

Posteriormente s e demostró que la timectomia en el cobayo, induce cambios

en el tejido h f o i d e s , que s e puede c o r r e g i r con la administración de extracto

de timo (3).

(2).

-

S e h a demostrado en ratones neonatos la influencia d e l a timectornia e n

la respuesta inmunológica señalandose con esto, q u e

la

participación dol timo-

es esencial en la función del s i s t e m a inmunológico (4); a s í mismo, la d e m o s - -

tración experimental de r e s t a u r a r la función inmunológica con tejido tímico e n

capsulado en c á m a r a Millipore, sugirió una función endocrina d e l timo ( 5 - 8 ) ;

simultaneamente s e h a demostrado por medio d e marcadores cromosomicos, que

l a s células precursoras d e los linfocitos perifericos, que responden a fitoherna-

glutinina, s e localizan en el timo y con esto s e sugirió la t e o r i a "celular" que

-

postula: que l a diferenciación del linfocito T , o c u r r e al contacto "in situ" con

-

e l epitelio tímico (9).

L o s mayores avances en la comprensión de la influencia d e l timo y de

-

las secreciones endocrinas, en la ontogenesis, homeostasis del sistetna linfoide

1

..

I .

. ..

, ,

, ,.

I

,.

..

.

. .

_ .

...

L a s consecuencias fisiológicas d e l a timectomia experimental en anima

les, o

l a

falla en e l desarrollo normal d e l timo en el hombre, han demostrado que este Órgano tiene una influencia importante en l o s mecanismos de rechazo

de los Órganos y tejidos transplantados ( l O , l l ) , en el desarrollo d e enfermeda des autoinmunes ( 1 2 , 1 3 ) , en l a tolerancia inoiunológica ( 1 4 , 1 5 ) , en deficiencias inmunológicas (16,17) y en l a resistencia a l a inducción tumoral por células e

virus oncogénicos (18,lg).

Con estos estudios que dieron conlo resultado la identificación de un fac

tor linfopoyetico, en extractos d e timo de ratas (20) y posteriormente un purifi cado homogéneo (21); s e demuestra la función endocrina del timo y su participa

ciÓii en la diferenciación y función d e los linfocitos T (tiniodependientes).

-

-

-

S e ha demostrado que los ratones tratados con tiiriosina, precozmente

-

desarrollan resistencia a l crecimiento tumoral, después de la inoculación con

-

virus d e sarcoma de iMaloney (22) y significativament.e prolonga la sobrevida

-

de ratas con leucemia Dunning (23).

El defecto en inmunidad celular parece s e r un defecto general en l o s pa

cientes con malignidad avanzada (24,25,26,27). El grado d e inmunodeficiencia

-

puede s e r correlacionado directamente con un pronóstico favorable (28,29); aque

110s pacientes con inrriunocompetencia, esta es restaurada con procedimientos

-

que reduzcan l a maza tumoral, o con l a administración de inmunoestimdantes

-

(30,31).

-

L a timosina, ha demas trado m e j o r a r algunos indicadores de inmunidad

-

rriediada por células. en pacientes con inmunodeficiencias primarias y enferme dades malignas avanzadas.

- 3

-

P o r l o que l a timosina incrementa in vitro, el número de iinfocitos T

-

de los pacientes con inrnunodeficiencias- (rosetas- E tempranas y tardias)

.

primarias o secundarias y en pacientes con enfermedades malignas (32).

Con estos antecedentes nos intereso r e a l i z a r este trabajo que como p r i

m e r a meta tiene

la

de purificación y demostración in v i t r o de actividad bioló- gica d e l purificado de timo, en linfocitos T , de individuos normales y d e pacien

tes cdn enfermedades autoinmunes y linfoproliferativas.

Objetivos :

Obtener cantidades considerables de timosina.

D e s a r r o l l a r bioensayos "in vitro" para demostrar l a actividad biológica

de la timosina.

Demostrar la actividad biológica de

la

timosina en linfocitos T de indivi

-

duos normales y en pacientes con depresión de linfocitos T , como son aquellos que cursan con padecimientos autoinmunes

(

artritis reumatoide juvenil, derrna

-

topolimiositis) y enfermedades iinfoproliferativas, como la leucemia linfoblastica.

Planteamiento d e l problema.

L o s pacientes con padecimientos autoinrnunes y linfoproliferativos tienen depresión d e la inmunidad celular, que s e manifiesta por una disminución de l i n

focitos T (linfoci tos formadores d e rosetas E) en sangre periferica.

ii

ip6tesis.

E l extracto total d e l timo y/o l a timosina son capaces de incrementar e l número de linfocitos forinadores de rosetas E (linfocitos _T).

Aislamiento y Purificación de Timosina Bovina

Material biológico.

T i m o s de bovino neonato

Material

Equipo de disección

Honiogenador de alta velocidad

Centrifuga de alta velocidad con enfriamiento

Baño M a r f a con termostato

Uoiiiba de v a a o

Desecador de presión reducida P a r r i l l a magnética

Agitadores tnagnéticos Membrana para diálisis

Equipo de ultrafiltación Amicon

Material d i v e r s o de vidrio (matraces, pipetas, embudos, etc.

P a p e l í i l t r o Watman 42

Reactivos

Solución de N a C l O . 1 5 M (0.9%) O cíanol

- 5 -

Solución de

Na

HP04 10

Sulfato d e amonio

Acido acetic0 al 10%

Buffer P B S p l i r 7 . 2 ( 0 . 2 M)

P o l i etilenglicol

Procedimiento.

[ll(pI~lr7)

2

1.

-

Se obtiene tejido tímico d e bovino neonato, recién muerto; el tejido s e limpia, diseca y fracciona en pequeños trozos.

2.

-

El tejido tímico s e hornogeniza con solución de NaCl O. 15 M (0.9%) y octanol, en l a relación siguiente: 50 gr d e tejido tímico por 150 m l de s o l u -

ción de N a C l y 15 nil de octanol.

3 .

-

La.

m e z c l a s e centrifuga a

14000Xg

durante 10 minutos. El p r e c i p i

lado (tejido) s e desecha y e l sobrenadante s e incuba en baño maría a _8OoC du

-

ratite 1 hora.

4.

-

El precipitado d e proteinas desnaturalizadas por el calor s e separa mediante centrifugación a 14, OOOXg durante 10 minutos.

5.

-

El sobrenadante obtenido s e mantiene a 4OC e l cual s e agrega a 5

-

volumenes de acetona a -1OOC

6.

-

El precipitado formado s e pasa a un embudo Buchner, con papel Wat

-

man 42

y

s e lava con varios volumenes d e acetona a - 1 O O C .

7.

-

El precipitado limpio s e deseca a preción reducida.

8 .

-

Se obtiene un polvo blanco que s e resuspende en 10 volumenes de

Na2

H P 0 4 10 mhlu pH.7

. .

* .

.

10.

-

]La soluci6n s e centrifirga a 1 5 , O O O X g durante 20 minutos a

E l reiiiduo no soluble ubtcnido s e guarda para análisis de proteinas.

1 1 . -

El

sobrenadante s e lleva a una saturación de 25% con sulfato de O°C.

amonio solido, conservando un pIi-7. S e agita por u n a hora.

12.

-

S e centrifuga una vez más c u n el fin de s e p a r a r el precipitado.

E s t e precipitado s e desecha y el sobrenadante s e lleva a un pH.4 con-

ácido a c e t i c 0

ai

10%.

13.

-

Esta solución s e lleva a una saturación del 50% con sulfato de

-

amonio solido.

14.

-

La

m e z c l a s e centrifuga

a

10,OOOXg a O°C

15.

-

El

preci!’itado obtenido s e disuelve en un volumen conocido d e T r i s durante 15 minutos.

HC1, con

pH&.

16.

-

La m u e s t r a s e concentra pur ultrafiltración, s e dializa contra agua

destilada y desionizada, contra una cantidad de 10 a 100 v e c e s el volumen d e

-

l a m u e s t r a , s e equilibra con

PBS

pHz7.2, 0.2 M y s e deshidrata con polieti--

Ienglicol.

17.

-

Cuando el volumen s e redujo a una décina parte del volumen i n i - -

cial. s e s a c a de la membrana y s e l e practica análisis de proteinas.

Estandarización de la concentración d e proteinas respecto a

la

albumina

s é r i c a bovina

(BSA).

Material.

Baño M a r í a con termostato

- 7

-

Material d i v e r s o de vidrio

Keactivos

Seroalbuniina bovina (BSA) Agua destilada y desionizada

Solución d e carbonatu de sodio a l Z'+o en hi.droxido de sodio O.

IN

Sulfato d e cobre

T a r t r a t o d e potasio

K e a c l i v o k'olin -k'enol Yr uc e<tr (ni e n t o .

Soluciones:

I .

-

Soluciones de seroalbuniina bovina (BSA) con una concentración c o

-

nacida (Stock). Aproximadanente 800

m g

d e

BSA

cristalina s e disuelve en

100

ml

d e agua destilada y desionizada para tener una solucion co'1 8 ulg/mi.

-

i.

-

biirva estandard d e albumina s é r i c a bovina (BSA).

Una alícuota d e l a solución stock s e diluye 1:50, con lo que tiene una s o h c i ó n d e 160 gr/niI aproxiniadanie:lte.

L a . concentración c o r r e c t a s e determina leyeudo la solucion en 1 1 ~ 1 e s - 2eci.ruiotornetw

(utrdvluiecu

.I

- C L ~ U nivi y multiplicando ¡a absorvancia por

-

el coeficiente d e extinci6ti 1.515

P o r i o tanto l a concentración en rng/mi es: iiig/nil absorción a 280 n M x 1.515

3.

-

F o l i n A

- 8 -

S e prepara cmno sigue:

40 g r de NaZC;V,

Y g r d e .NaUfi

2000 ml d e a g u a destilada y desionizada

4 .

-

Fol.in

U

S e prepara disolviendo:

100 mg de siilfato de cobre

10 nil de a g u a destilada y desionizada

5 .

-

Folin fi2

Se prepara disolviendo:

200 imp, de tartrato de potasio

I U riiJ de agua ciestitaan

p

qesionizdua

8 .

-

F o h n (reactivo de cobre).

S e

prepara mezclando:

49 in1 d e Folin

A

0 . 5 tnl de Foliin B

0.5 _{L ~ d} de Folin B2

S e requieren 5

ml

por cada tubo

7 .

-

Folin Fenol

Se prepara haciendo una dilución 1:4.4

Se ocopa I ni.1 por cana tubo

Nota:

El

Folin debe quedar 1 N d e concentracijn final

Determinación de proteinas (33).

2 .

-

P r e p a r a r las soluciones de:

a) Keactivos cobre

-

koolin ( L K )

b)

Reactivos de k'enol-l.'oltn

(E'PK)

c) BSA. s i se c o r r e curva standard

S e puede emplear e l siguiente protocolo:

Tubo ml BSA n i l agua

CR

F

P R

1

o.

O 1.0 5 iiil agitar, esperar 1 in!

2 O . ¿ O .

8

5 15 minutos 1

3

0.4 O. 6 5 ₁

4

O .

6

O. 4 5 1

5 0. 8 O. 2 5 1

6

1.0 O. 0 5 1

Anadir la proteina y e l agua destilada y luego 5 in1 de C R . A.,itar (no

vibrador) y s e deja reposar 15 minutos a temperatura ambieute. Agregar 1

-

ml de FPK e inmediatamente agitar con el vibrador y colocar en bario maría

de 50°C por 1.0 minutos.

Después enfriar l o s tubos a temperatura ambiente, s e l e e la absorción

a 700 nm.

Se utiliza fototubo rdjo y tiltro en eL especir,~iotornetro cio~c'iiaii Jr. ii

LI blanco usado s e ajusta al 100 5 T .

Preparación d e

la

solución buffer de Hank's

nutritivo y algunas v e c e s , antiséptico en el cual permanece durante el tiempo

que sea necesario para s u manipulación.

. .

Este e s e l caso de l a solución Hank's buffer, e i cual reune a todas

-

las sales necesarias, i n c ~ u y e n a ~ oext ro;;ii, p e r o por no tener incluidas alguna I .

..

clase d e proteinas, no l o hace adecuado para un cultivo d e células d e niás d e

20 horas. Si esto s e desea, s e l e puede rnezclar suero fetal d e ternera y a p

tibioticos con l o que teriernüs :in buen inet1i.a 3 c . c~~1I1:tvo p d ~ i esta c i a j e u*: c&

lulas.

* .

Reactivos:

Na(;I.

. . .

8 g r

K C L .

. . .

0.4

CaCIZ

. . .

O. 14

MgS04:2 H20

. . .

0.2 con 7 HZO.

. . .

0 . 1 g r

NaLHlr>04:lL

n

u.

. . .

u . l L

K H L P V 4

. . .

O . 16

L

N d I C 0 3

. . .

.0.35

Destrosa

. . .

1 . 0

Rojo Fenol a l 1% O

. . .

0.007 Agua dest. y desionianda, cbp.

. . .

1000 .nl

NaOH O.LN

csp ajustar e l p H a 7.L-7.4

HCL

I . V N Mat erial:

ilaianza analítica Es pat u1 a

L - 4 . - m - c p

-

11

-

Charola para transportar reactivos

. .

1

Procedimiento.

JLn el matraz depositar SO0 iril d e agua ciestilauii y desionizada, f i l t r a

da agregar l o s reactivos en el orden en que s e pesen agitando brevemente.

A f o r a r a 1000

nil

y colocar en el agitador hasta s u completa disolu-

ciGn. ( K s t e r i l si s e quiere conservar mas tiempo)

Separación d e linfocitos por gradiente d e densidad.

Los gradientes de densidad por ceiitrifugación fueron usados para sepa r a r células de diferentes tipos. L o s Linfocitos s e pueuen sapdira ua rlcueruo-

d s u s aiferantes propiedades físicas e inmunológicas.

Material para preparar e l gradiente d e densidad (esteril).

Matraz Erlenmeyer d e 250

rnl

esteril con tapon

J: iltro rriilipore

Jeringa iiipoaeriniLa U < : ,L.J rni i2)

P a r a arribas iormas:

Papel f i l t r o Papel aluminio

Balanza graiiataria Espátula

R eactivos:

Ficol.

. . .

_9.0 g r

Hypaque (Conray)

. . .

20 m l

-

I L

-

Procediiniento:

Una v e z pesados l o s reactivos agregarlos a l matraz con e l agua desti-

lada agitarlos hasta s u disolución total y conservarlo tapado. X o cecesira r e f r i

g eración.

Nota: No utilizar embudo para vaciar e l b icctll.

Solo s e e s t e r i l i z a con e l f i l t r o miJ.ipore para cultivo d e células.

L a solucióri debe quedar con l a densidad d e 1.076

p a t e r i a l para l a separación de linfocitos.

Tubos Oak-Ridge d e propileno d e 5 ü in1 para centriruga .Jeringa hipodermica d e ZO rnl

Centrífuga

Pipetas "Pasteur"

Sifón

Cámara cuentacélulas (Hemocitómetro) Pipeta d e blancos

Microscopio 6ptico

Contador manual

Material d e v i d r i o a i v e r s o

iteactivos:

ciraiiieriw u c ,r icoii-nypaque

Heparina (Lipo-Hepiri 1000 unidades) Buffer d e Hank's

Material Biol6gico

P r oc edirni erito:

I .

-

s e loinan 5 mi a e i grauieritr a e r ; . c o ~ l - r i y p a q u e y s e deposita en un tubo

Oak-Ridge di? polipropileno d e 50 ml

2 . - El especirnen d e sangre s e toma con una j e r i n g a d e plástico con 0.Z ml

d e heparina por cada 5 ml d e sangre total.

k'or cana 3 nil at: satlyre hepari.iiizaaa, s e usríii 2 m i a e l a solución

-

de Ficoll-Hypaque, formando una suspensitn d e dos fases. L a f a s e d e F i c o l l -

Ilypaque debe quedar en l a parte inferior del tubo y l a f a s e d e sangre es d e - positada cuidadosamente en l a parte superior.

J .

-

.3t: centrifuga a una velocidad d e

400Xg

(1500-1,800 rmp) durante 40 minu

-

l o s a temperatura ambiente.

Despu,és d e e s e tiempo, se r e t i r a l a ;.,terfase con un sifón o pipeta

-

Pasteur, cuidando d e no 'soniperia.

XI

terminar d e centriiugar, las fases quedan distribuidas d e la siguien

te manera: L a f a s e superficial es suero, la segunda fase es e l paquete d e blaE cos o linfoci,tos. L a t e r c e r a f a s e es e i gradieiite de .cicuI.i-nypaque. L a cuaE La y úitima f a s e son los eritrocito?,.

4 .

-

Se obtiene un volumen aproximado d e 2.5-3 rnl d e suspensión d e células,

-

y estas s e 1a.van t r e s veces con solución de Hank's.

L o s lavados s e realizan d e l a sigui ente manera: y r i i n e r u se slisTenue- el paquete del gradiente en un volurrien adecuado d e Hank's por ejeiiiplo 3-4

-

ri:l mediante una pipeta Pasteur. Se centrifuga a 400 x g durante 11 minutos. Se saca d e

la,

centrífuga, s e r e t i r a aprr>xiniactwnent.e las aos t e r c e r a s partes-

uei volumen. cuidando d e no resuspender los linfocitos, s e vuelven a resiispe-

I

c

-

14

-

S e sacan, s e l e r e t i r a cuidariosariiei-ite lobu '.:L v o i i l i i i e r i p > s i b l e u e H a n k ' s con

e l fin de no {arrastrar cGlulas, s e resuspenden, s e centrifuga d e nuevo; s e - sacan; se les r e t i r a e l Hank's y s e resuspenden iirialinente las células e!i 1

..

i d de Hank's

S e cuentan e n cá:liara ciieiitacétuias y s e ajustan las células a una

-

concentración d e 5 millones d e células por mililitro.

r

I

I

, .

. .

Material:

Tubos de centrífuga d e propileno de 25-50 ml

Baño maría

Getitr íf ug a

Yipeta Yasteur

r o r t a o o j etos Cubreobj etos

Microscopio tiptko

Reactivos:

SRBC _{a l} 0.5%1

Población purificada de lirifocitos, ajustada a una concentración de 5 :nillo- ,les d e ceiuias/ iriiiiiitro

r a r a i t na

(eritrocitos d e carnero)

,. ,

-

I>

-

P r o cedi mi ento:

1.

-

D e las células ajustadas a 5 millones/ml, s e toman 0.25 nil y 0.25

.d

de

S R B C

a l 0.5%, la mezcla se incuba 15 minutos a 37OC.

L o s eritrocitos de carnero ( 3 K ü C J se preparan corno sigue:

S e toma aproximadamente 1 nil de eritrocito d e carnero, los cuaies

-

se lavan tres veces siguiendo e l procediiiiiento descrito para el lavado de

cp

lulas blancas, despues de las céiulas s i n Hank's (este se decanta) s e toman-

0.05 in1 de eritrocitos y se diluyen en 10 in1 de Hank's, con l o que s e obtie

ne una solución a l 0.5%.

2.

-

Después d e ese tiempo se incuba durante

una

hora inás a 4'C;, posteriof mente s e centrifuga durante dos minutos para precipitar las células f o r m a d o

ras d e rosetas, se descarta la mitad del sobrenadante y s e resuspende suave

rrieiite. Posteriorineiite se toma una alicuota con Pipeta Pasteur y s e coloca- en un portaobjetos, se s e l l a el cubreobjetos con parafina encima d e l a gota

-

extendida.

Se cuentan 100-200 células totales, incluyendo celulas en rosetas y c i

luias s i n rosetas, segun corno s e veaa en e l campo, con objetivo de 40X y

-

l o s resultados s e dan en

%.

L a s células a s í contadas recibirán el nombre-.

d e rosetas tempranas.

3.

-

Una vez 'hecho e l conteo las células s e incuban a 4°C; durante 1 0 horas.

-

l h

-

h i e c l o de l a ' l i n i ~ ~ s i n a w i

iac

c61~tIas '.l d e sangre periferica de huiiiano

Se deiiiostró recientemente q u e la timosina, es un evtracto de timo de be-

c e r r o (bovino) puede rápidamente inducir la aparición d e marcadores de super-

í i c i e de células T específicas en células linfoides de ratones.

Se postuló que l a timosina produce este efecto, actuando en células

-

embrionarias de células T para conferirles caract.er;sticas d e células

T.

Esto e s , l a tiinsina puede ser e l factor responsable de la difereaciacijn de células

T

dentro del tirno. En animales y hombres s e asume que las células

'i.' presentes en l a sangre p e r i l i r i c a están completamente diferenciadas.

L a timosina no es un espécimen específico, ya que l a mayoría de los

-

extractos están preparados de timo d e bovino y h a 1 sido ensayados eii ratones. U e cualquier iorina, la tiniosina puede afectar en f o r m a similar a las células

-

hunianas.

En vista de l a dificultad para conseguir médula ósea humana, s e utili26

para este estudio sangre humana periferica, para observar el efecto d e l a t i -

riiosina en linfocitos, a través de s u habilidad para unirse a células normales rojas de carnero (SRBC). Cada unión produce una configuración llamada r o s 2 ta.

L a s c d u i a s forinadoras de rosetas a s í detectadas son células

T.

En el presente reposte s e utiliza dos técnicas.

E l llarnado ensayo de rosetas activas, que necesita tin corto tiempo de

y liniocitos. hsto detecta alguna subpoblaci6n d e cél: inciibaa ón entre SKBL

las

T.

El otro análisis d e rosetas tardias requiere un tiempo substancialmen- te largo d e incubación entre SKBL y linfocitos, este prnbab1eineiit:e detecta t o

_ _

-

17

-

Material:

Tubos de centrífuga de propileno de 25-50 n i l

liemocitónietro

Pipeta cuenta -globules blancos Gontador maiiual

. .

fiafio niaria con termostato

centrífuga

.

, .

Microscopio locular

R eactivos: Hank's buffer

Gradiente de Ficoll-Hypaque

Soluciones d e Timosina e n Hank's a concentraciones de:

1 , I O , 1 0 0 y 1000 microgramos/miiiiitro Solución d e eritrocitos de carnero a l 0.57'0

Material biológico:

Sangre venosít p e r i f é r i c a , heparinizada. recién rutraída

Procedimiento:

1.

-

L a timosina s e diliiye en Hank's a una concentración d e 1, 10, 100 y 1000

microgramos/miiiiitro.

I

.

2.

-

S e separan las células rnononucleares d e sangre heparinizada mediante un gradierite de 1' icoll-Hypaque.

3 .

-

L a s células s e lavan t r e s v e c e s y se resuspenden en Hankls a una concen-

-

18

-

4.

-

P a r a cada examen d e rosetas (teinpraiia-; y tardias) s e totria 0 . 5

m l

d e

la solución d e células anterior y s e l e agrega 0.03 ml d e timosina, poniep

do un tubo para cada dilución, y un testigo o blanco de control.

6.

-

L a s células s e incuban durante una hora a 573C; en baño maría s i l a

-

hormona fue"extraída recientemente, d e lo contrario s e incuba durante dos horas.

7.

-

Después

las

células s e lavan t r e s veces coa Hank's siguiendo la iéc!ii.ca

de separación d e liiifocitos por gradiente de densidad y después del hltimo- lavado, s e deja un volunien d e 0.25 ml, se l e agregan 0.25 in1 d e e r i t r o c i -

tos d e carnero

a l

0.511/o, s e m e z c l a cuidadosa!nerite y s e centrifuga a 1500-- 1800 rpm durante 5 minutos.

8.

-

S e r e t i r a l a mitad d e l volumen, s e resuspenden las células cuidadosame" t e y s e leen

a l

microscopio con objetivo d e

4 ü X .

L o s resultados s e dan en

70.

9 .

-

Una v e z realizada l a lectura d e rosetas tempranas, s e incuban a _4OC

-

durante un lapso d e 12-20 horas, siendo e l tiempo óptimo e l d e 18 horas.

10.

-

L a

cuenta s e real.iza d e l a misma f o r m a que l a tempranas, dando e l resultado en

%,

para una confiabilidad en l o s resultados, l a s cuentas se d e

berán hacer 'por triplicado.

, .,+{'a*:; ,.

.. .. .

-

19

-

M a t e r i a l y Metudos. M a t e r i a l liuniano.

S e estudiarán v a r i o s grupos d e pacientes

a

l o s que s e l e s extraerá

d r l pliegue d e l codo, mediante p u n c h venosa 5 1111 d e sangre p e r i f é r i c a

-

siniultaneamente a l a realización d e estudios rutinarios.

..

Grupo I: s e f o r m a r á con 10 pacientes cnn e l diagnóstico d e leuc- niia linfobl.astica activa, bajo tratamiento niédico tradicional d e esteroides

,

"

..

, ,

. ,

I .

.

y citotóxicos.

Grupo 11: s e f o r m a r á con 10 pacientes con A r t r i t i s Reumatoide

-

tratados con ácido a c e t i l salicilico.

Grupo 111: s e f o r m a r á con

6

pacientes con Dermatopolimiositis tra

tados con esteroides a dosis d e 0.5 mg/kg p.c. día.

Grupo IV: estará formado con

24

individuos sanos donadores p r o - fesionales d e l Banco Central d e Sangre.

K

esultados:

Resultados d e l a extracción d e timosina.

Siguiendo l o s pasos d e l a técnica, s e obtuvieron los siguientes res- tados: s e partió d e dos kilogramos d e glándula, una v e z homogena.do s e a l -

calzó un volumen total de 200 inl. A I descartar el tejido, e l sobrenadante

-

quedo en u11 volumen de 870

_nil.

S e obtiene por Último un volumen d e 10 nil, en e l cual tenemos e l

-

extracto a l que s e l e practicó análisis d e proteinas con e l método Folín,

ob

-

20

-

Curva d e Proteitias SLaiidart

I .

..

" .

I)

No.

muestra mil prot

ml

H20 conc rng/ml

2

1

o.

o

1.

o

Ox10 2

o.

2

o.

8 1.6665

3 O. 4 O . 6 3.3333 4

o.

t>

0 . 4 4 . 9 9 9 5

5

o.

8

o.

2 6 . 6 6 6 6

6

1.0 0 . 0 8 . 3 3 2 5

log conc

-

0 . 2 2 1 8

O . 5228

O . 6989

O . 8238

O . 9207

abs

-

9 6 -95

9 1 - 9 1

8a -87

86 -86

83 -84

log abs.

-

1 . 9 8

1 . 9 5 9 0

1.9432

1.9345

1.9217

Usando un Stock de O. 83325 m g prot/iril Curva d e l problema

Di1 uci Ón Absorvancia Long de l a absorvancia

1:20 ; 39 - 3 8 . 5 1.5883

1:50 47-67 1 . 8 2 6 1

1:lOO ; 97-98 1.9890

P o r l a pendiente de l a g r á f i c a s e obtiene una concentracifin de:

log c o n c i O. 14 antilog O. 1 4 ~ 1 . 3 8 ~ lo-' ~ ( 0 . 0 1 3 8 ) (100): 1 . 3 8 rngprot/ml

-.,____. .. .

< .

. . ~ ..

,. . < , : , . . , ~

. , ...*I-

. i j. ,

..

I ’,

r

,

,

,

2 ‘ ~,

.

L

-

L

---

El*-EC1’0

L)E

LA CONCLN’TRA<;ION DE?: ‘TIMOSINA SOBRE L A S C E L U J A S

FORMADORAS DE KOSETAS E: ( ~ E M P N A N A S ) EN INDIVIDUOS

ADULTOS

SANOS.

No. Paciente

1 2 3 4 5 6 7 8

X ,

DE; O

%

25.3 24.3 22.7 21.0 22.7 19.3 26.7 25.7 23.46 2.51

Concentracibn d e Timosina (ug/ml)

1

7;

28.6 23.7 37.7 33.3 35.7 24.0 26.7 27.0 29.59 5.33 10 “10

30. O

47.3

50. O

49.3

50. O

43.3 38.3 39.3 43.44 7. 17 100

%

39.3 47.3 48.7

48.

o

49.3 42.3 44.3 47.7 45.86 3.55 1000 t.7 10 34.3 27. O 29.3 20.7 25.3 36. O 25.3 26.7 28.08

5 . 0 1

E F E C T O D E LA CONCENTRACION D E TIiMOSINA SOBRE L A S CELULAS FORMADORAS D E ROSETAS -E (TARDLAS) EN INDIVIDUOS ADULTOS

-

S A N O S

1 2 3 4 5 6 7 8 X ;

D E =

39.3 42.3 46. 7 49.3 46.0 48.0 48.7 44.3 45.58 3.44

39.7 49.3

58.7 64.3

61.7 67.7

51.7 64.7

58.3 61.7

43.7 52. O

58.3 57.7

55.0 58.3

53.39 59.46

7.86 6.60

49.0 61.7 60. O 58.7 61.7 54.3 64.3 58.7 58.55 4.85 39.3 39.3 47.0 48.7 50. O 44.3 55.3

46. O

E F E C T O DE L A CONCENTRACION D E TIMOSINA SOBRE

LAC

CELULAS

F O R M f D O R A S DE ROSETAS-E ( T E M P R A N A S ) EN

NINOS

CON LEüCEiMIA

No.

_paciente

O

%

1 1 6 . 7 2 1 2 . 7

3 2 7 . 7

4 14.3

X.

1 7 . 9

D E - 6 . 8

Concentración de

Timosina

(

ug/nil)

1 1 O' 100 1000

YO

70

?O

70

18.3 3 6 . O 3 6 . 0 28.3 1 2 . 0 2 9 . 7 3 5 . O 2 9 . 0 3 2 . 3 3 2 . 7 4 2 . 7 2 5 . 7

1 4 . 0 3 1 . 7 3 4 . 7 2 3 . 7

1 9 . 2 3 2 . 5 3 7 . 1 2 5 . 4

9 . 2 2 . 6 3 . 8 2 . 6

E F E C T O D E L A CONCENTRACION D E TIMOSINA SOBRE LAS C E L U L A S FORMADORAS DE ROSETAS -E (TARDIAS) E"

NIÑOS

CON L E U C E M I A

1

2

3

4

XZ

D E ::

2 4 . 3 4 0 . 7 3 9 . 3 4 4 . O 3 1 . 7 2 4 . 3 3 5 . 7 4 2 . 7 4 3 . 7 3 9 . 7

4 0 . 7 4 2 . 3 5 1 . 3 4 9 . 7 3 2 . O

22.

o

24. O 4 3 . 3 4 3 . 3 3 1 . 7 2 7 . 8 3 5 . 7 4 4 . 2 4 5 . 2 33.8

8 . 7 8 . 3 5 . 1 3 . 0 4 . O

E F E C T O D E L A TIMOSINA SOBRE

LAS

CELULAS FORMADORAS D E

ROSETAS - E ( T E M P R A N A S ) EN NIÑOS CON A R T R I T I S R E U M A T O I D E No. Paciente

. .

5

6

x

::

D E z

O

7 0

9.7

18.7

18.3

16.

O

16. O

15.74

3.60

Concentración d e Tiinosina (ug/inl)

1 10 100 1000

<r

70

5‘0

7 0 10

12.3 28.3 32.3 15. O

20.3 36. O 38. O 20.

o

18.7 32.7 32.3 19.3

17. O 33.3 36.7 17.7

17. O 33.3 36.7 17.7

17.1 32.7 35.2 17.9

2.9 2.78 2.70 1.9

E F E C T O D E L A TIMOSINA SOBRE LAS C E L U L A S F O R M A D O R M DE

ROSETAS (TARDIAS) EN NIÑOS CON ARTRITIS REUMATOIDE JUVENIL

5 20.7 20.7 38.7 43.0 26.3

6

33.0 39.3 37. O 47.7 37.7

7 37.3 38.7 43.3 44. O 40.7

8 32. O 35 41.7 46. O 38.7

9 32. O 35.0 41.7 46. O 38.7

X Z 3 1 33.74 42.48 45.34 36.42

DE: : 6.16 7.56 3.0 1.8 5.7

r

E F E C T O D E L A TIMOSINA SOBRE L A S CELULAS FORMADORAS DE

ixosma

-E ( T E M P R ~ A S ) EN

NINOS

CON DEXMATOPOUMIOSITLS

No. Paciente Concentración de Timosina ( u g / m l )

O 2 10 1 O0 1000

7 0

%

70

YO

7 0

10 1 6 . 7 16.3 3 2 . O 3 1 . 3 1 7 . 3

1 1 1 5 . 3 1 7 . 3 3 8 . 7 4 0 . 7 1 9 . 3

x

:: 16. O 1 6 . 8 3 5 . 4 3 6 . O 1 8 . 3 DEE 1.0

o.

7 4 . 7 6 . 6 1.4

E F E C T O D E

LA

TIMOSINA SOBRE L A S C E L U L A S FORMADORAS D E ROSETAS -E (TAEZDIAS) EN

NIÑOS

CON DEXMATOPOLIMIOSITIS

10 3 4 . 0

36.

O 4 1 . 7 4 1 .

7

3 9 . 3

11 35.3 3 8 . 7 4 4 . 7 4 4 . O 3 6 . 0

X I 3 4 . 7 3 4 . 7 4 3 . 2 4 2 . 9 3 7 . 7

EFECTO

DE

LA

F4

DE

TIMO

BOVINO COBRE

LOS

LINFOCITOS FORMADORES

DE

ROSETAS DE PACIENTES CON DERMATOPOLIMIOSITIS

-

v>

0

_n a 4

I-

w

v)

W

v>

-

I

2

O

w

a

n

e

z

U

O

11

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a

5(

40

30

20-

10-

0-

e

.

*.

.

.

t

. .

f

.

.

. . *

. .

t

.

*

I I 1 I I

-

O

I

IO 100 ₁₀₀₀

EFECTO DE L A

F4

DE TIMO BOVINO

SOBRE

LOS LINFOCITOS FORMADORES DE

ROSETAS DE PACIENTES CON

DERMATOPOLIMIOSITIC

. .

-

_{U J}

a _z 4

o-

n

2z w t-

W

I

u7

w

v>

O

n

w

O

I-

z

u

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O

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2

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e

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50

40

30

20

I O

O

* *

I I

o

I

I I I I I

O I IO

100

Kx)O

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F4

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5 0

40

VY

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-

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-

W I

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O

w

0

30

a

e

a

;L:

W U

-

a

20

c

-

-

EFECTO

DE

LA

F4

DE TIMO BOVINO SOBRE LOS LINFOCITOS FORMADORES

DE

ROSETAS DE PACIENTESJON LEUCEMIA

a o

b

. .

1

b

+

I

: . .

i

o

‘I

I I

O I I I

I

10

LOO

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F 4 T B

..,**..,

.

50

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c

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w

U Y

t- 30

s!

e

W

n

z

s

U

n

O

n

20

c

EFECTO

DE

LA

F4

DE

TIMO

BOVINO

SOBRE

LOS LINF0,CITOS

FORMADORES DE

ROSETAS DE

PACIENTES

CON

LEUCEMIA

O .

m e .

z

O

O

O

..

I I I

o

I

₁₀

₁₀₀ I ₁₀₀₀ I

i

EFECTO DE

LA

F4

DE

TIMO BOVINO SOBRE LOS

LINFOCITOS

FORMADORES

DE

ROSETAC DE PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE

. .

e *

8 b

I I

O I 1 I

I

IO

100

1000

EFECTO DE

LA

F4

DE

TIMO BOVINO SOBRE

LOS LINFOCITOC FORMADORES DE

ROSETAS DE PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE

___..__-

I

v)

U _z

4

u

a

I

w

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w

I v) w v)

O

w

2

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w

u

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O

a

-

40

30

20

IC

c

.

e . .

..

7-

..

.

15

.

*

.

.

*

.

.

i.

0 . 0 . .

.

I

.

I I

D

I

I I

I

IO _{100 1000}

_-

EFECTO

IX

L A F4 DE TIMO BOVINO SOBRE

LOS

LINFCCITOS FORMADORES DE

ROSETAS DE INDIVIDUOS NORMALES

c

v>

c3

4

a

2

-

W I

3

_W

v)

O

W

a

n

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w

O

O

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a

70-

60

-

50

4c

(

0 1

e

0..

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e . .

.

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.

e

..

.

e . .

.

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.

e. ..e

-I

e....

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I I

-

7

I IO _{100 1000}

O

. .

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a

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I-

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I

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-

w U z Oz O

3o-

a

20

o

EFECTO

E

LA

F4

DE TIMO BOVINO

SOBRE

LOS LINFOCITOS FORMADORE

DE

ROSETPS DE INDIVIDUOS NORMALES

e

.

1-

..

e..

i'

0 . .

0

.

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.

e .e 8

_L

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...e.

.

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I I I 1 I

10 100

1000

O

I

pg/ml.

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F 4 T B

0

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.