Aislamiento y selección de bacterias celulolíticas a partir de compost de residuos orgánicos

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. AC IÓ. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE. N. FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. Aislamiento y selección de bacterias celulolíticas a partir de compost de residuos orgánicos TESIS. N. DE. PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL. CC. IO. Autor:. BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO. Br. Luis Arturo Rodríguez Silva. DI. RE. Asesor: Dr. Luis Alberto Llenque Díaz TRUJILLO --PERU. 2015. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE. IC. A. Y. CO. M. RECTOR. UN IC. Dr. Orlando Gonzáles Nieves. AC IÓ. N. TRUJILLO. RM. ÁT. Dr. Rubén Vera Véliz. Dr.Weyder Portocarrero Cárdenas. VICERECTOR DE INVESTIGACIÓN. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. VICERECTOR ACADÉMICO. Dr. Esteban Ilich Zerpa. SECRETARIO GENERAL. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. BIOLÓGICAS. IC. A. Dr. José Mostacero León. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. DECANO. SECRETARIO. Dra. Bertha Soriano Bernilla. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. Dr. William Zelada Estraver. DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA.. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN. UN IC. AC IÓ. N. Señores Miembros del Jurado:. En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de Grados y Títulos. CO. M. de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología de la Facultad de. Y. Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra consideración. A. y criterio el presente trabajo de tesis titulado:. ÁT. IC. “Aislamiento y selección de bacterias celulolíticas a partir de compost de residuos. DE. IN FO. RM. orgánicos” con el cual pretendo obtener el Título Profesional de Biólogo Microbiólogo.. DE. SI ST. EM. AS. Trujillo, Abril del 2015. DI. RE. CC. IO. N. Br. Luis Arturo Rodríguez Silva. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MIEMBROS DEL JURADO. Los suscritos, miembros del jurado, declaran que la presente tesis ha sido ejecutada en. AC IÓ. N. concordancia con las normas de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y. Y. CO. M. UN IC. Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo.. IC. A. _________________________________. ÁT. Ms. C. Juan Wilson Krugg. AS. DE. IN FO. RM. PRESIDENTE. Dr. Luis Alberto Llenque Díaz SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. _________________________________. _________________________________ Ms. C. Jaime Agreda Gaitán VOCAL. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN. Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Examinador, declaran que el presente. AC IÓ. N. Informe de Tesis titulado: “Aislamiento y selección de bacterias celulolíticas a partir. UN IC. de compost de residuos orgánicos”, ha cumplido con los requisitos formales y. Y. CO. M. fundamentales, siendo APROBADO por UNANIMIDAD.. IC. A. _________________________________. ÁT. Ms. C. Juan Wilson Krugg. AS. DE. IN FO. RM. PRESIDENTE. Dr. Luis Alberto Llenque Díaz SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. _________________________________. _________________________________ Ms. C. Jaime Agreda Gaitán VOCAL. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CERTIFICACION DEL ASESOR. AC IÓ. N. El que suscribe, profesor asesor de la tesis titulada:. UN IC. “Aislamiento y selección de bacterias celulolíticas a partir de compost de residuos. Y. CO. M. orgánicos”. IC. A. Que ha sido desarrollada, de acuerdo al reglamento establecido por la Facultad de Ciencias. ÁT. Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en conformidad con su. RM. correspondiente proyecto, y que el informe ha sido redactado acogiendo las observaciones. DE. IN FO. y sugerencias alcanzadas.. AS. Por lo tanto, autorizo a Luis Arturo Rodríguez Silva continuar con el trámite del. SI ST. EM. reglamento correspondiente.. CC. IO. N. DE. Trujillo, Abril del 2015. RE. _________________________________. DI. Dr. Luis Alberto Llenque Díaz ASESOR. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIAS A Dios. AC IÓ. N. Por estar conmigo en cada paso que doy, cuidándome y dándome fuerzas para seguir adelante y no desalentarme en el intento, por haberme dado salud para lograr. CO. M. UN IC. mis objetivos y permitido llegar a este momento tan importante de mi vida profesional.. A. Y. A mi madre Margarita. ÁT. IC. Por ser el pilar más fundamental en mi vida, por sus consejos, comprensión,. RM. amor, valores, y apoyo incondicional en todo momento, por inculcar en mí el sabio. DE. IN FO. don de la responsabilidad ¡Gracias por estar siempre conmigo!. AS. A mi padre Enrique. SI ST. EM. A quien admiro porque es un ejemplo de esfuerzo y sacrificio, a no darse por vencido ante cualquier dificultad, a pesar de la distancia siempre te tengo presente,. DI. RE. CC. IO. N. DE. gracias por tus consejos y apoyo incondicional para ser un hombre de bien.. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTO. AC IÓ. N. A mi asesor, Dr. Luis Alberto Llenque Díaz, por brindarme su tiempo, apoyo y dedicación, así como las sugerencias constructivas durante el desarrollo de la presente. UN IC. investigación, además por brindarme su amistad y conocimientos académicos durante mi. CO. M. formación profesional.. A. Y. A mis compañeros y amigos Jimmy, Omar, Miguel, Héctor, Gisela y Ana por. RM. ÁT. IC. brindarme su apoyo en parte del desarrollo de mi tesis.. IN FO. Al laboratorio Referencial de Trujillo por facilitarme los equipos y materiales para. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. culminar la parte experimental de mi tesis.. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONTENIDO Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo………………………….……….ii. AC IÓ. N. Autoridades de la Facultad de Ciencias Biológicas……………………….…………. iii. UN IC. Presentación…………………………………………………….………….………....iv. M. Miembros del jurado………………………………………………………..…………v. Y. CO. Aprobación………………………………………………...……………….…………vi. IC. A. Certificación del Asesor…………………………………...…….………….………..vii. RM. ÁT. Dedicatoria………………………………………………………...……….………..viii. IN FO. Agradecimiento………………..………………………….….……………………….ix. DE. Contenido…………………………………………………….………………………..x. EM. AS. Resumen…………………………………………………………………………..... xii. SI ST. INTRODUCCION…………………….……………………………………………....1. DE. Objetivos…………………………………………………………………………...….7 MATERIAL Y MÉTODOS……………………………………………………….…..8. IO. N. 1. Material biológico……………………………………………………..………8. DI. RE. CC. 2. Procedimiento……………………………………………….……….……......8 2.1. Obtención y transporte de la muestra…………………………..…….……...8 2.2. Descripción de la composición de los residuos para la formación del compost………………………………………………………...………….....8 2.3. Aislamiento y selección primaria…….…………………..……..……...…….9. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.4. Selección secundaria.……………………………….…….…...…….…...…..9. N. 2.5. Análisis de resultados …………………...………………..……………...…10. AC IÓ. 2.6 Identificación Bioquímica……………………………………..……….........10. UN IC. 2.7 Determinación de la curva de crecimiento de las bacterias celulolíticas. M. seleccionadas……………………………………………….….…………….10. CO. RESULTADOS……………………………………………………………………...11. A. Y. DISCUSIÓN…………………………………………………………………..……..21. ÁT. IC. ENUNCIADO RESUMEN……………………………………………………...…..28. RM. RECOMENDACIONES……………………………………………………….…....29. IN FO. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………….....….30. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. ANEXOS………………………………………………………………………...…..38. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN. El presente trabajo de investigación tuvo como objetivo aislar y seleccionar. AC IÓ. N. bacterias celulolíticas a partir de compost de residuos orgánicos. Las muestras fueron obtenidas de la Estación Experimental de Bioquímica Aplicada de la Universidad Nacional. UN IC. de Trujillo. Se pesó 10 g de muestra y se colocó en 90 mL de agua peptonada 0.1%.. M. Posteriormente se realizaron diluciones seriadas y fueron sembradas en agar CMC 1% e. CO. incubadas a 35ºC por 48 h. Luego se resembró en agar CMC 1% y se seleccionaron. A. Y. colonias que presentaban mayores halos de hidrólisis mediante la prueba con Rojo de. ÁT. IC. Congo. Luego se hicieron siembras por puntura en agar CMC 1% de los cultivos. RM. seleccionados Col 1, C4 y C5, en tres repeticiones y se obtuvo el promedio de los halos. IN FO. netos de hidrólisis; los mismos que fueron analizados mediante las Pruebas de Tukey y. DE. Duncan. Posteriormente, se realizó la bioquímica respectiva de los cultivos celulolíticos. AS. seleccionados; así como la determinación de la fase logarítmica media de crecimiento de. EM. cada cultivo bacteriano en 10 mL de caldo CMC 0.7% pH 6.5, a 37°C, con un ml de. SI ST. inoculo de 3x108 UFC/mL; mediante recuentos bacterianos en placa cada 4 h desde las 0 h hasta las 24 h. En relación a los promedios de los halos netos de hidrólisis, no hay. DE. diferencia significativa entre los halos de las bacterias C4 y C5, pero sí entre el cultivo Col. IO. N. 1 y los demás. Los cultivos fueron identificados como Paenibacillus sp (Col 1), Bacillus. CC. firmus (C4) y Bacillus sp (C5) que alcanzaron su fase logarítmica media de crecimiento a. DI. RE. las 6 h en las condiciones ensayadas.. xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCIÓN. En la actualidad, gran cantidad de residuos sólidos hace necesario un. AC IÓ. N. tratamiento. El compostaje es un método eficiente en la eliminación de estos residuos ya que permite además el aprovechamiento del producto final1. El compostaje es la. UN IC. transformación biológica de los residuos sólidos orgánicos en productos finales. M. utilizables como fertilizantes, sustratos para la producción de hongos y biogás. Además,. CO. su alto contenido de materia orgánica y la actividad biológica hacen que el compost sea. IC. RM. ÁT. revegetación, biofiltración y biorremediación2. A. Y. efectiva en una variedad de aplicaciones, incluyendo el control de la erosión,. IN FO. Una gran variedad de microorganismos aerobios, termotolerantes y termófilos. DE. (incluyendo bacterias, actinomicetos, levaduras, mohos y otros hongos) se han. AS. reportado ampliamente en el compostaje y otros materiales orgánicos que experimentan. EM. calentamiento espontaneo, a temperaturas entre 20-60C3. Durante la fase inicial del. SI ST. proceso del compostaje los sustratos están a temperatura ambiente y el pH es ligeramente acido. Hongos y bacterias mesófilas y/o termotolerantes son los. En el proceso de compostaje los microorganismos participan por medio de. RE. CC. IO. N. DE. degradadores activos dominantes de los materiales de desecho orgánicos frescos4.. DI. secreciones de enzimas hidrolíticas que tienen un papel fundamental en la depolimerización de los componentes orgánicos de los diferentes residuos. Entre estas enzimas las más importantes son las celulasas, hemicelulasas, proteasas, lipasas fosfatasas y arilsulfatasas5. Cuando las enzimas que producen los microorganismos son extracelulares pueden ser potencialmente útiles, en la degradación de diferentes. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. sustratos. Estas enzimas extracelulares tienen ventajas con respecto a las intracelulares porque no necesitan técnicas de ruptura, para ser extraídas, presentan una estructura más compacta y son menos susceptibles a la degradación. Las enzimas extracelulares. AC IÓ. N. hidrolizan moléculas grandes como almidón, celulosa, hemicelulosa, pectina, proteínas,. UN IC. lípidos y ácidos nucleicos, que son asimilados por los microorganismos como fuente de carbono y energía. Moléculas como hemicelulosa y celulosa están presentes en gran. CO. M. cantidad en el compost proveniente de residuos agrícolas6. Los microorganismos. Y. celulíticos y en particular las bacterias aeróbicas generalmente convierten la celulosa en. IC. A. dos productos principales: CO2 y biomasa; no existen acumulaciones significativas de. ÁT. intermediarios carbonados y la concentración de ácidos orgánicos raramente alcanza un. IN FO. RM. nivel apreciable7.. DE. La celulosa es el carbohidrato más abundante en la biomasa vegetal8, forma el. AS. 40-60 % de la pared celular de las plantas9. Las microfibrillas de celulosa están. EM. estabilizadas por enlaces de hidrogeno intra e intermoleculares y rodeadas por. SI ST. polisacáridos hemicelulosicos (manano y xilano) que se unen a la celulosa por puentes de hidrogeno y enlaces covalentes, los cuales la hacen extremadamente resistente a la. DE. hidrolisis química y biológica. Así mismo las regiones amorfas de la estructura. IO. N. cristalina de la celulosa tienen una composición heterogénea caracterizada por una. CC. variedad de enlaces. Finalmente este arreglo asimétrico que caracteriza las regiones. DI. RE. amorfas es crucial para la biodegradación de la celulosa10. La celulosa en su forma. nativa consiste en una cadena lineal de unidades de glucosa con enlaces glicosídicos β1,411. Por lo que constituye una abundante fuente de carbono limitada a los microorganismos capaces de hidrolizar este enlace, a expensas de un complejo sistema de enzimas denominadas celulasas o celulolíticas12. Los organismos no pueden obtener 2. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. energía directamente del polisacárido celulosa, solo pueden usar los monómeros (azucares reductores) para metabolizarlos vía glucolisis; así que para que los organismos hagan uso de los azucares reductores necesitan desprenderlos de la celulosa. AC IÓ. N. por medio de una reacción de hidrólisis13. Esta reacción de hidrólisis es llevada a cabo por un complejo enzimático con diferentes formas de acción llamado complejo. CO. M. UN IC. celulasas, pertenecientes al grupo de enzimas de la glicosil hidrolasas14.. Y. El complejo celulasa está compuesto por una variedad de enzimas con diferentes. IC. A. especificidades y modos de acción, que actúan en sinergismo para degradar la celulosa;. ÁT. Las enzimas del complejo celulasa han sido agrupadas en tres componentes. RM. principales15. Las endo-β-glucanasa o 1,4-β-D-glucan glucanohidrolasas que hidrolizan. IN FO. aleatoriamente los enlaces β-glucosídicos en el interior de las moléculas de celulosa,. como. complemento,. las. exo-β-glucanasas. o. 1,4-β-D-glucan. AS. reductores;. DE. con una rápida disminución del largo de las cadenas y un lento incremento en los grupos. EM. celobiohidrolasas atacan los extremos terminales no reductores de la celulosa. SI ST. previamente fragmentada, liberando subunidades de celobiosa, esta es escindida por las. N. DE. β-glucosidasas o celobiasas en dos moléculas de glucosa libre16.. CC. IO. Las enzimas celulasas son producidas por una variedad de bacterias y hongos. DI. RE. aeróbicos o anaeróbicos, mesófilos o termófilos17. Entre los hongos celulolíticos destacan: Trichoderma reesei, Fusarium solani, Alternaria sp., Sporotrix sp.,. Penicilium funiculosum; las bacterias celulolíticas más abundantes y conocidas son las aerobias entre las cuales destacan: Cellulomonas sp., Vibrio sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp., Cytophaga sp.18. Además se encuentran algunos anaerobios como:. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Acetivibrio cellulolyticus, Clostridiun cellulovorans, Ruminococcus albus, Butirivibrio sp. Clostridium thermocellum; entre los actinomicetes se destacan Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces cellulolitycus, Themomonospora curvata, thermomonospora. UN IC. AC IÓ. N. chromogena, Thermomonospora alba, Thermomobifida fusca19.. Para la degradación de celulosa han sido estudiados muchos géneros de hongos. CO. M. por sus enzimas celulolíticas y entre las bacterias los actinomicetos se destacan por su. Y. capacidad degradadora de este sustrato20.Entre los actinomicetos celuloliticos, las. IC. A. especies termófilas del genero Thermonospora ha recibido mucha atención, sin. RM. ÁT. embargo, las especies mesófilas del genero Streptomices también han sido muy. IN FO. estudiadas debido a su mayor abundancia en el suelo y a la importancia que tienen por ser las principales productores de antibióticos21.. DE. Bacillus es reconocido industrialmente atractivo por sus altas tasas de. AS. crecimiento, gran capacidad para la secreción de enzimas extracelulares, así como su. SI ST. EM. desarrollo bajo condiciones ambientales extremas22, Además, por su capacidad para secretar grandes cantidades de enzimas extracelulares directamente al medio de cultivo. DE. en condiciones aeróbicas23. Se sabe que naturalmente metaboliza una amplia variedad. IO. N. de azúcares incluyendo xilosa, arabinosa, celulosa, sacarosa, celobiosa y glucosa24. Sin. CC. embargo, a pesar del extenso conocimiento genético y bioquímico del género25,. DI. RE. sorprendentemente existe poca información de aspectos bioenergéticos, metabólicos, de crecimiento y de formación de productos en condiciones aeróbicas para la utilización de carboximetildelulosa26. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Diferentes procedimientos utilizados en la identificación y enumeración de los microorganismos capaces de utilizar la celulosa son ampliamente usados; siendo la base de estos la hidrólisis de los sustratos celulósicos; la utilización de medios líquidos que permiten. estimar. cuantitativa. y. cualitativamente. N. celulosa. los. AC IÓ. contienen. UN IC. microorganismos degradadores, los medios sólidos son generalmente más usados pero en estos las colonias de microorganismos que utilizan el sustrato son con frecuencia. CO. M. difíciles de diferenciar de otros microorganismos que no lo hacen27. El Rojo de Congo. Y. puede ser utilizado en los ensayos para evidenciar la hidrólisis de polisacáridos, debido. IC. A. a que el colorante forma complejos con las moléculas no hidrolizadas; facilitando así la. RM. IN FO. aclaramiento alrededor de la colonia28.. ÁT. diferenciación entre microorganismos celuloliticos y no celuloliticos, mediante zonas de. La actividad del sistema enzimático en el complejo celuloliticos puede medirse. DE. determinando la cantidad de glucosa liberada mediante DNS; esta técnica demuestra la. AS. presencia del grupo carbonilo libre (C=O) de los azucares reductores que implica la. EM. oxidación del grupo funcional aldehído de la glucosa29. En este método el ácido 3,5-. SI ST. dinitrosalicilico es reducido a acido 3-amino-5-nitrosalicilico, mientras que los grupos. DE. aldehídos son oxidados a grupos carboxilos; la reducción del ácido genera un color. N. amarillo el cual es proporcional a la concentración del azúcar reductor presente y se. CC. IO. evidencia por medio de la lectura de absorbancia en el espectrofotómetro lo que implica. DI. RE. la aplicación de la ley de Lambert Beer30.. Los azúcares liberados del proceso pueden ser usados en varios propósitos, como el incremento de azúcares asimilables en los forrajes y la producción de etanol31, 32. . Además por ser un producto que posee diferentes características, entre ellas ser 5. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. edulcorante, preservante humedad, inhibidor frente a levaduras y mohos, estabilizador de la viscosidad; tiene gran aplicación en la industria farmacéutica y alimentaria33. Por otro lado, el material lignocelulósico es atractivo por su bajo costo y alta disponibilidad. AC IÓ. N. en diversos climas y localidades, sin embargo, el principal impedimento para su utilización es la falta de una tecnología de bajo costo para degradar la fracción. UN IC. recalcitrante de la biomasa34.. CO. M. El compostaje es un proceso biológico aerobio en la que se transforman los. Y. residuos orgánicos degradables en un producto estable e higienizado, que es aplicable. IC. A. como mejorador de suelos y sustratos y es método eficiente en la eliminación de. RM. ÁT. residuos orgánicos. En el presente trabajo se plantea el aislamiento, selección de. IN FO. microorganismos celulolíticos a partir de esta fuente de microbios y posteriormente su identificación hasta género, que permitirá proponer y ofrecer a la comunidad industrial. DE. y empresarial especies nativas de microorganismos celulolíticos, cuyas enzimas puedan. AS. ser utilizados como alternativa a las enzimas comerciales, de alto costo, para ser. EM. utilizados en la hidrolisis de los compuestos orgánicos de los diferentes residuos en. SI ST. procesos a escala de interés comercial e industrial. En este sentido, se buscará nuevos. DE. microorganismos productores activos de celulasas, o utilizarlos para mejorar la. N. producción de enzimas mediante la optimización de las condiciones de cultivo y/o. DI. RE. CC. IO. mejoramiento genético.. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. OBJETIVO(S) General:. AC IÓ. N. 1. Aislar, seleccionar e identificar bacterias celulolíticas a partir de compost de. UN IC. residuos orgánicos.. M. Específicos:. CO. 1. Aislar bacterias celulolíticas a partir de compost de residuos orgánicos en agar. A. Y. carboximetilcelulosa al 1.0 %.. ÁT. IC. 2. Seleccionar bacterias con capacidad celulolítica a partir de compost de residuos. RM. orgánicos mediante la técnica de Rojo de Congo. IN FO. 3. Determinar si hay significancia entre los promedios de los halos netos de hidrólisis de. DE. las bacterias celulolíticas aislados del compost de residuos orgánicos mediante las. AS. pruebas de Tukey y Duncan.. SI ST. orgánicos.. EM. 4. Identificar las bacterias con capacidad celulolítica a partir de compost de residuos. DE. 5. Determinar la fase logarítmica media de crecimiento de las bacterias celulolíticas. DI. RE. CC. IO. N. aisladas del compost de residuos orgánicos en caldo carboximetilcelulosa al 0.7%.. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MATERIAL Y MÉTODOS. AC IÓ. N. 1. MATERIAL BIOLÓGICO Compost de residuos orgánicos procedente de la Estación Experimental de. UN IC. Bioquímica Aplicada de la Universidad Nacional de Trujillo (ANEXO 1).. Y. CO. M. 2. PROCEDIMIENTO. IC. A. 2.1 OBTENCIÓN Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA. RM. ÁT. Se obtuvieron 09 muestras de compost de la Estación Experimental de. IN FO. Bioquímica Aplicada de la Universidad Nacional de Trujillo, en una cantidad de 200 g cada una y depositadas en recipientes plásticos (ANEXO 2), debidamente. DE. rotulados y posteriormente llevados al Laboratorio de Fisiología y Genética. AS. Bacteriana del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad. DE. SI ST. EM. Nacional de Trujillo.. 2.2 DESCRIPCIÓN DE LA COMPOSICIÓN DE LOS RESIDUOS PARA. DI. RE. CC. IO. N. LA FORMACION DEL COMPOST. El compost obtenido de la Estación Experimental de Bioquímica Aplicada presentó un alto contenido de residuos orgánicos vegetales tales como tallos y hojas de plantas herbáceas (Papaya, Fresa, Maracuyá, Alfalfa, Uva, etc.) y estiércol de ganado vacuno.. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.3 AISLAMIENTO Y SELECCIÓN PRIMARIA. Se pesó 10 g de la muestra homogeneizada y se colocó en 90 mL de agua peptonada. N. 0.1%(P/V). Posteriormente se realizaron diluciones seriadas de 10 -1 a 10-3 con el mismo. AC IÓ. diluyente; a partir de estas, se sembró 0.1 mL en placas con agar carboximetilcelulosa. UN IC. 1%35 (ANEXO 3) por la técnica de siembra en superficie. Las placas fueron incubadas a 37ºC por 48 horas36.. CO. M. Transcurrido el tiempo de incubación se hizo un subcultivo por puntura de los. Y. microbios que crecieron en las placas (ANEXO 4), por duplicado, y se incubó en las. A. mismas condiciones.. ÁT. IC. A una de las placas se adicionó la solución de Rojo de Congo al 1% (P/V), y luego de. RM. 15 minutos se retiró el exceso y se adicionó NaCl 1.0 M, dejándolo reposar por 15. IN FO. minutos más y se retiró el exceso37.. La selección de los cultivos celulolíticos se hizo en base a la presencia de halos netos de. AS. (ANEXO 5).. DE. hidrólisis38 alrededor de cada colonia a partir de la segunda placa sembrada (TABLA 1). SI ST. EM. Este procedimiento se hizo por triplicado para cada muestra.. 2.4 SELECCIÓN SECUNDARIA. DE. Cada cultivo que presentó halo de hidrólisis fue reactivado en Agar CMC 1%, pH. DI. RE. CC. IO. N. 6.5, a 37 °C por 24 horas. Posteriormente se sembró por puntura en placas por duplicado e incubado en las mismas condiciones.. A una de las placas se adicionó la solución de Rojo de Congo al 1% (P/V), y luego de 15 minutos se retiró el exceso y se adicionó NaCl 1.0 M, dejándolo reposar por 15 minutos más y se retiró el exceso.. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La selección secundaria de los cultivos celulolíticos se hizo en base al tamaño de los halos netos de hidrólisis alrededor de cada colonia a partir de la. N. segunda placa sembrada. (TABLA 2) (ANEXO 6).. AC IÓ. Este procedimiento se repitió tres veces.. UN IC. 2.5 ANÁLISIS DE RESULTADOS. CO. M. Las mediciones promedio de los halos netos de hidrolisis de los cultivos. Y. celulolíticos fueron sometidos al análisis estadístico Prueba de Tukey y Duncan para. ÁT. IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA. RM. 2.6. IC. A. evaluar la diferencia significativa de los resultados (TABLA 3).. IN FO. A los cultivos bacterianos celulolíticos obtenidos de la selección secundaria se les hizo observaciones macro y microscópicas, en fresco y mediante coloración Gram.. DE. La identificación bioquímica de las bacterias seleccionadas se hizo mediante la. AS. evaluación de comportamiento metabólico (ANEXO 9-15) de acuerdo a los. SI ST. EM. manuales de Bergey´s de bacteriología sistemática39 y Mac Faddin40.. 2.7 DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE LAS. DI. RE. CC. IO. N. DE. BACTERIAS CELULOLÍTICAS SELECCIONADAS Cada bacteria fue reactivada en Agar CMC 1 % y se preparó una suspensión bacteriana en solución salina fisiológica estéril (SSFE), equivalente al tubo n°1 del nefelómetro de MacFarland y se inoculó 1 mL a un tubo conteniendo 10 mL de caldo CMC al 0.7%, pH 6.5 a 37°C (ANEXO 16) y se hizo recuentos bacterianos en placa cada 4 h desde las 0 h hasta las 24 h por la técnica de siembra en superficie mediante diluciones seriadas crecientes en cada muestreo y se sembró en agar CMC 1% de 24 a 48 horas.. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS En la TABLA 1, se muestran el Comportamiento cualitativo de los 12 cultivos aislados a. N. partir de compost como Celulolítico (+) y No celulolítico mediante la prueba de Rojo de. UN IC. AC IÓ. Congo.. CO. M. En la TABLA 2, se muestra el promedio de los halos netos de hidrolisis de. Y. carboximetilcelulosa de las bacterias celulolíticas seleccionadas mediante la prueba de rojo. RM. ÁT. IC. A. de Congo.. IN FO. En la fig. 1, se muestra el promedio de los halos netos de hidrólisis de las tres bacterias. AS. DE. celulolíticas seleccionadas por la técnica del Rojo de Congo.. EM. En la TABLA 3, se muestra el análisis de la significancia de las medias de los promedios. SI ST. de los halos netos de hidrólisis de las tres bacterias celulolíticas mediante las Pruebas de. CC. IO. N. DE. Tukey y Duncan.. RE. En la TABLA 4, se muestran las características macroscópicas y microscópicas de los. DI. cultivos bacterianos aislados de compost de residuos orgánicos.. En la TABLA 5, se muestran las características bioquímicas de los cultivos bacterianos celulíticos aislados de compost de residuos orgánicos. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En la TABLA 6, se muestran la identificación de los cultivos bacterianos aislados y seleccionados a partir del compost de residuos orgánicos, entre los que se encuentran. AC IÓ. N. Paenibacillus sp, Bacillus firmus y Bacillus sp.. UN IC. En la fig. 2, se muestran las curvas de crecimiento de crecimiento de las tres bacterias. M. seleccionadas en caldo carboximetilcelulosa 0.7%, pH 6.5 a 37°C, en relación al tiempo de. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. incubación.. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. TABLA 1. Comportamiento cualitativo de los 12 cultivos bacterianos aislados a partir de compost como Celulolítico (+) y No celulolítico (-) mediante la prueba de. Col 1. +. CO. —. +. RM. C4. +. IN FO. C5. +. C9. +. C10. +. C11. —. C12. —. EM SI ST. —. Leyenda: (—) No celulolítico, (+) Celulolítico. DI. RE. CC. IO. N. DE. —. AS. C8. DE. C6 C7. IC. +. ÁT. Col 3. A. Y. Col 2. UN IC. Prueba del rojo de Congo. M. Cultivo. AC IÓ. N. Rojo de Congo.. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. TABLA 2.. Mediciones de los halos netos de hidrólisis de carboximetilcelulosa de las. halo neto (mm). Col 1. 12. Col 3. 8. M. CO 15. A. Y. C4. ÁT. IC. C5. RM. C8. 17 8 7 9. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. C9 C10. UN IC. Cultivo. AC IÓ. N. bacterias celulolíticas seleccionadas mediante la prueba de Rojo de Congo.. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 18. 17 15. N. Promedio de halo de hidrolisis, mm. 16. 12. AC IÓ. 14. UN IC. 11. 10. M. 8. CO. 6. A. Y. 4. IC. 2. ÁT. 0. C4. C5. RM. Col 1. IN FO. Bacterias seleccionadas C4. C5. DE. Col 1. EM. AS. Fig. 1. Promedio de los halos netos de hidrólisis de las tres bacterias celulolíticas. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. seleccionadas por la técnica del Rojo de Congo.. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. TABLA 3 Análisis de la significancia de las medias del promedio de los halos netos de hidrólisis de las tres bacterias celulolíticas mediante las Pruebas de Tukey y. Duncan. M. UN IC. Subconjuntos 1 2 11.3333 15.3333 16.6667 1.000 .143 11.3333 15.3333 16.6667 11.3333. A 3 3. 1.000. 15.3333 16.6667 .070. DE. IN FO. C4 C5 Sig.. 3 3 3 3. CO. 3 3 3. Y. Col 1 C4 C5 Sig. Col 1 C4 C5 Col 1. IC. Tukey B. N. ÁT. DHS de Tukey. Cultivo. RM. Análisis estadístico. AC IÓ. N. Duncan.. AS. Se muestran las medias de los grupos de subconjuntos homogéneos.. EM. Basadas en las medias observadas.. SI ST. El término de error es la media cuadrática (Error) = .444.. DE. a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 3.000. DI. RE. CC. IO. N. b. Alfa = 0.05.. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. TABLA 4. Características macroscópicas y microscópicas de los cultivos bacterianos. AC IÓ. N. celulíticos aislados y seleccionados.. Características microscópicas. Características macroscópicas. UN IC. Cultivo Reacción. Forma. planas,. opacas,. CO. pequeñas,. secas,. Bacilos. pequeños,. Y. Colonias. M. Gram. Positivo. A. bordes. IC. Col 1. IN FO. RM. ÁT. irregulares y en forma rizoide. espora. central,. extremos ovalados Bacilos. pequeños,. extremos. ovalados,. Colonias pequeñas, cremosas, C4. Positivo. DE. planas, bordes irregulares. EM. AS. espora central Bacilos. medianos,. extremos. ovalados,. Colonias pequeñas, cremosas, Positivo. SI ST. C5. planas, bordes irregulares. DI. RE. CC. IO. N. DE. espora central. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. TABLA 5.. Características bioquímicas de los cultivos bacterianos celulolíticos. aislados de compost de residuos orgánicos.. AC IÓ. C4. C5. +. +. Glucosa. +. +. Hidrolisis del almidón. +. Citrato. -. Ureasa. +. Voges Proskauer. -. AS. Movilidad. EM. ÁT. IC. A. Y. +. -. -. -. -. -. +. ++. +. +. +. +. +. +. -. -. -. ++. +. +. DE. SI ST. Crecimiento en Na Cl 7.5%. +. -. RM DE. Manitol. Indol. +. +. -. IN FO. Licuación de la Gelatina a 22°C. M. Catalasa. CO. Col 1. UN IC. Prueba. N. Cultivos. N. Leyenda:. IO. (+) Reacción positiva. DI. RE. CC. (-) Reacción negativa. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. TABLA 6. Identificación. de. los. cultivos. bacterianos. celulolíticos. aislados. y. Bacteria. Paenibacillus sp.. CO. M. Col 1. UN IC. Cultivo. AC IÓ. N. seleccionados a partir del compost de residuos orgánicos.. Bacillus firmus. C5. Bacillus sp.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. C4. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DE. Fig. 2. Curvas de crecimiento de los tres bacterias celulolíticas seleccionadas en. N. caldo carboximetilcelulosa 0.7%, pH 6.5 a 37ºC, en relación al tiempo de. DI. RE. CC. IO. incubación.. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DISCUSION. La selección de los microorganismos celulolíticos se logró determinar por los halos. AC IÓ. N. de hidrólisis (ANEXO 18) en el medio Agar Carboximetilcelulosa alrededor de la colonia. El método se basó en la capacidad del colorante Rojo de Congo de adherirse a la. UN IC. carboximetilcelulosa tornándose la placa de color rojo, al ser degradado este sustrato por el. M. complejo enzimático celulasa; el área hidrolizada toma un color amarillo lo cual indica que. CO. el colorante no se pudo adherir al polímero que se ha disgregado41, lo cual permitió. A. Y. conocer de manera cualitativa la utilización del sustrato carbonado; además fue posible. ÁT. IC. observar el crecimiento de microorganismos que no generan halos alrededor de su colonia,. RM. debido posiblemente a que ha utilizado, para su crecimiento, algunos otros componentes. IN FO. como son el extracto de levadura, peptona, o bien los azucares formados por los microorganismos celulolíticos, en un proceso denominado sinergismo el cual es muy. SI ST. EM. AS. DE. común en los consorcios microbianos42, 43.. El tamaño de los halos netos de hidrólisis de carboximetilcelulosa 1 % fue diferente. DE. para cada cultivo seleccionado. El cultivo C5 fue quien presento el mayor halo de. IO. N. hidrolisis de 17 mm mientras que el cultivo C9 presento el menor halo de hidrolisis de 9. CC. mm (TABLA 2). Esto es porque hay microorganismos que producen más enzimas. RE. celulasas que otras , esto puede deberse al complejo enzimático o al mecanismo de. DI. hidrólisis que poseen para degradar este sustrato como es el caso de las bacterias del genero Bacillus que aparte de producir enzimas termoestables debido a su capacidad de crecer en temperaturas muy elevadas presentan actividad endo β- 1,4 glucanasa y exo β-. 1,4 glucanasa , pero tienen una característica en particular y es la resistencia a ser inhibida. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. por la propia glucosa o celobiosa que producen44 lo que la convierte en una excelente bacteria. productora. de. enzimas. celulasas.. Asimismo. actividades. elevadas. de. endoglucanasas se correlacionan con la formación de mayores halos de hidrólisis como lo. AC IÓ. N. reportado por Ceroni45 que hizo un estudio de correlación entre la actividad enzimática y. M. UN IC. el halo de hidrólisis obtenido en la selección primaria semicuantitativa en placas.. CO. Los cultivos seleccionados fueron Col 1, C4 y C5 quienes mostraron los mayores. A. Y. halos netos de hidrólisis de 11, 15 y 17 mm respectivamente (TABLA 2). En tanto que. ÁT. IC. Acharya y colaboradores46 obtuvieron bacterias termófilas y termotolerantes de una pila. RM. de compost, donde Bacillus subtilis fue quien mostró la más alta zona de hidrolisis en. IN FO. medio CMC 1% que fue de 21 mm al octavo día de incubación. En un estudio realizado por Ling47 demostró la actividad celulolítica de cepas de Bacillus thuringiensis mediante. DE. la detección de su capacidad para forman halos en placas de CMC, y como resultado se. EM. AS. obtuvo un valor de H / C mayor que 2 (H: halo de hidrólisis diámetro; C: diámetro de la. SI ST. colonia) lo que sugiere que las cepas de Bacillus podrían producir celulasas con alta. N. DE. actividades, al tener la capacidad potencial para liberar glucosa a partir de celulosa.. CC. IO. Mediante la prueba de Tukey y Duncan (TABLA 3) se analizaron las diferencias. RE. entre las medias de los halos de netos de hidrólisis de las bacterias sobre el sustrato. DI. carboximetilcelulosa al 1.0% en placa, donde se obtuvo que los halos netos de hidrólisis de 15,3 y 16,7 mm de los cultivos C4 y C5 respectivamente no se diferencian significativamente por lo cual presentan el mismo poder degradativo sobre este sustrato. Ambos cultivos fueron los que presentaron los mayores halos netos de hidrólisis pero. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. obtienen el mismo efecto sobre este sustrato; mientras que, el cultivo Col 1 si muestra una diferencia significativa sobre los otros 2 cultivos pero este fue quien presentó el menor. AC IÓ. N. halo de hidrólisis entre las tres bacterias seleccionadas.. UN IC. Los microorganismos aislados y seleccionados Col 1, C4 y C5 en el presente. M. estudio fueron identificados en el laboratorio mediante características morfológicas y. CO. pruebas bioquímicas. Así tenemos que se logró describir las características macroscópicas. A. Y. de los cultivos (TABLA 4), coloración Gram (ANEXO 17-19), y además se realizaron. ÁT. IC. pruebas bioquímicas necesarias (TABLA 5) de acuerdo al manual de Beryey´s48 y Mac. RM. Faddin40 (ANEXO 9-15), determinado así su género y especie (TABLA 6), los cuales. IN FO. fueron identificados como Paenibacillus sp, Bacillus firmus y Bacillus sp. ,. AS. DE. respectivamente.. EM. Paenibacillus sp. (Col 1) presentó tinción de Gram positiva, glucosa y manitol. SI ST. positivo, hidrolizó el almidón, no licuó la gelatina, tuvo un crecimiento rápido en NaCl al. DE. 7.5%, sin reducción del citrato y la prueba de urea fue positiva, en condiciones de. N. aerobiosis. Similares resultados fue encontrado en pruebas bioquímicas realizado por. CC. IO. Rodriguez49 para la identificación de Paenibacillus aisladas de los nódulos de Lupinus. RE. angustifolius (altramuz azul) para estudios de colonización junto con la bacteria. DI. Micromonospora. Paenibacillus presenta gran versatilidad en cuanto a su adaptación a diferentes medios; debido a su variabilidad genética ya que presenta segmentos de ADN de distintos microorganismos50.. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Con respecto al género Paenibacillus son pocos los estudios sobre su actividad celulolítica como el trabajo realizado por Moreno35 que aisló Paenibacillus sp de bagazo de caña de azúcar en agar CMC 1% y evaluó su actividad catalítica de enzimas celulasas.. y. mostró un alto potencial de. UN IC. constituyentes puros de consorcios microbianos. AC IÓ. N. Silvina y colaboradores51 aislaron de suelos nativos forestales Paenibacillus sp. como. endoglucanasa en medio sólido y líquido. Este consorcio tuvo un completo potencial de. M. degradación de celulosa ya que mostró altas actividades de endocelulasas, xilanasas y. Y. CO. degradación de papel de filtro. Mientras que trabajos realizados por Valenzuela52 utilizó a. IC. A. Paenibacillus barcinonensis para la purificación, caracterización y clonación de tres. IN FO. RM. ÁT. enzimas degradadoras de xilano para el empleo industrial.. Por otra parte , se ha descrito que algunas especies del genero Paenibacillus actúan. DE. como promotoras del crecimiento vegetal, ya que influyen de manera directa en el. EM. AS. crecimiento de las plantas al producir fitohormonas, nutrientes, fijar nitrógeno y actuar. SI ST. contra microorganismos patógenos. Un ejemplo lo constituye el empleo de Paenibacillus polymyxa, el cual se ha encontrado en la rizófera de diferentes cultivos y en la que tienen la. DE. habilidad de secretar sustancias que mejoran el crecimiento de la planta, de fijar nitrógeno. Con respecto a su curva de crecimiento Paenibacillus sp, (Fig. 2) muestra que la. DI. RE. CC. IO. N. y solubilizar los fosfatos53.. bacteria desde las 0 hasta las 4 horas tuvo una fase de latencia, en esta fase no hay variaciones en el número de microorganismos; sin embargo, las células no están inactivas ya que se están adaptando al medio, para lo cual sintetizan enzimas. Si bien el número de. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. células no varió, puede ser que éstas aumenten algo de tamaño debido a que se va a producir la división54 .Un hallazgo similar se obtuvo en un trabajo realizado por Tapia55. N. donde evaluó la cinética de crecimiento de Bacillus thuringiensis en agar nutritivo donde. UN IC. AC IÓ. observó que la fase de latencia se mantenía constante hasta las ocho horas de crecimiento.. M. Después de las 4 horas ocurrió un crecimiento exponencial de Paenibacillus sp.. CO. que finalizó a las 8 horas, alcanzando su fase logarítmica media a las 6 horas . A partir del. A. Y. cual se observa un declive en su crecimiento. Una posible causa por la que este. ÁT. IC. microorganismo dejó de crecer en este medio de cultivo fue la inhibición que se presenta. RM. como consecuencia de la acumulación de productos ácidos del metabolismo que cambian. IN FO. el pH del medio de cultivo. Se sabe que los iones H+ en numerosas reacciones enzimáticas pueden actuar como inhibidores no competitivos56, pero en el presente trabajo no se tuvo. DE. en cuenta la influencia del pH, por lo que se recomienda monitorear el valor de pH durante. SI ST. EM. AS. el crecimiento de esta bacteria.. DE. Un estudio realizado por Fernández y colaboradores57 que procedió a estimar la. N. curva de crecimiento de la bacteria Paenibacillus lentimorbus observó un crecimiento. CC. IO. exponencial en donde la concentración de bacilos permanece constante las primeras 24. RE. horas de incubación, después de las cuales se inicia la reproducción exponencial de la. DI. bacteria, alcanzando su máxima concentración aproximadamente 62 horas después de inoculado el medio. Se necesitan más estudios sobre esta bacteria ya que son pocos los trabajos realizados para la producción de celulasas y crecimiento en agar CMC.. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Bacillus firmus (C4) presentó tinción de Gram positiva, glucosa y manitol positivo, hidrolizó el almidón, tuvo un crecimiento lento en NaCl al 7.5%, produce una lenta licuación de la gelatina (+), no reduce el citrato y la prueba urea fue negativa, en. AC IÓ. N. condiciones de aerobiosis. Resultado similar se obtuvo en un trabajo realizado por. UN IC. Cuervo58 para el aislamiento de microorganismos solubilizadores de fosfato orgánico y evaluar su capacidad como fijadora biológica de nitrógeno. Esta especie se ha utilizado. CO. M. para la decoloración del poliéster y otras telas, además produce sustancias antimicrobianas. Y. activas contra diferentes cepas de Bacillus y son capaces de inhibir bacterias. A. sulforeductoras. Esta especie tiene una capacidad de absorción de metales y algunas cepas. ÁT. IC. forman carotenoide59. No se han reportado trabajos de Bacillus firmus como degradadora. RM. de celulosa pero si se ha reportado como subilizador de fosfatos en el suelo mediante la. DE. IN FO. producción de ácidos como 2–cetoglucónico lo cual promueve el crecimiento vegetal60.. EM. AS. Con respeto a Bacillus sp. (C5) seleccionado este presentó una bioquímica muy. SI ST. similar a Bacillus firmus con la única diferencia que tuvo una rápida licuación de la gelatina (++), y no se pudo identificar la especie según el manual de Beryey´s48 por las. DE. limitaciones de algunas pruebas bioquímicas adicionales. El género Bacillus se caracteriza. IO. N. por ser un bacilo Gram positivo, reconocido industrialmente por sus altas tasas de. CC. crecimiento y producción de enzimas hidrolíticas; este género ha sido reclasificado muchas. RE. veces y algunas de sus especies han sido transferidas al género Paenibacillus61.Estudios. DI. realizados con cepas nativas, aisladas de un bosque pantanoso, muestran que Bacillus, en. condiciones de agitación a 50, 100 y 200 rpm, no presenta actividad sobre su sustrato; es decir no secreta una cantidad considerable de celulasas para ser detectadas por los métodos analíticos62. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Con respecto a las curvas de crecimiento, en la (fig. 2) se observa que la fase finaliza a las 12 horas. N. logarítmica de crecimiento de Bacillus sp. y Bacillus firmus. su. crecimiento. debido. probablemente. al. consumo. total. del. sustrato. carboximetilcelulosa. En esta fase logarítmica la proporción carbono: nitrógeno. (C: N). UN IC. en. AC IÓ. alcanzando su fase logarítmica media a las 6 horas a partir del cual se produce un declive. CO. M. probablemente haya sido la más adecuada, puesto que este es un factor decisivo en la tasa. Y. de aprovechamiento del sustrato63. Resultado similar se obtuvo de Ramirez64 que evaluó la. IC. A. fase logarítmica de crecimiento de Bacillus sp la cual fue mayor a las 12 horas de. RM. ÁT. crecimiento usando diferentes concentraciones de carboximetilcelulosa en un birreactor. IN FO. agitado. Asimismo la estimulación o inhibición del crecimiento y metabolismo de un microorganismo depende de la disponibilidad y concentración de nutrientes (carbono y. DE. nitrógeno principalmente) y de las condiciones ambientales adecuadas; sin embargo, con. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. frecuencia la concentración de fuente de carbono actúa de forma limitante65.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ENUNCIADO RESUMEN. AC IÓ. N.  Se aislaron y seleccionaron 3 bacterias celulolíticas (Col 1, C4 y C5) a partir compost de residuos orgánicos en agar carboximetilcelulosa 1.0%. y mediante la prueba de. CO. M. UN IC. Rojo de Congo. Y.  No hubo diferencia significativa entre los cultivos bacterianos C4 y C5 pero si entre. Los cultivos bacterianos, productores de celulasas, seleccionados a partir de compost. IN FO. . RM. ÁT. IC. A. los cultivos Col 1 y los demás, mediante la prueba estadística de Tukey y Duncan. SI ST. EM. AS. DE. de residuos orgánicos fueron Paenibacillus sp., Bacillus firmus y Bacillus sp..  Los géneros bacterianos celulolíticos seleccionados e identificados alcanzaron su fase. DE. logarítmica media de crecimiento a las 6 horas en caldo carboximetilcelulosa 0.7 %,. DI. RE. CC. IO. N. pH 6.5 a 37°C.. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RECOMENDACIONES. AC IÓ. N.  Estandarizar el inoculo de los cultivos celuloliticos para evaluar el halo neto de hidrólisis sobre agar carboximetilcelulosa.. UN IC.  Determinar los halos de hidrólisis de las bacterias en carboximetilcelulosa a. M. diferentes temperaturas de incubación.. CO.  Filtrar la solución de rojo de Congo 1% y mantenerlo en frasco ámbar.. A. Y.  Monitorear y controlar el pH del medio de cultivo durante el crecimiento de las. ÁT. IC. bacterias celulolíticas.. RM.  Relacionar el crecimiento de las bacterias con la producción de celulasas en escala. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. de laboratorio.. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1. Cariello M, Castañeda L, Riobo I, Gonzales J. Inoculante de microorganimos. AC IÓ. N. endógenos para acelerar el proceso de compostaje de resíduos sólidos urbanos.. UN IC. Facultad de Ingeneria- Universidad Nacional de Entre Rios. Journal of Soil Science and Plant Nutricion. 2007; 7(3): 26-37.. CO. M. 2. Nivedita S, Preeti B, Divya T, Richa K. Comparative study of potencial cellulolitic and xylanolytic bactéria isolated from compost and their optimizacion for industrial. IC. Beffa T, Blanc M, Marilley L, Lot Fischer J, Lyon P, Aragno M. Taxonomic. ÁT. 3.. A. Y. use. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies. 2013; 19(3):284-297.. RM. and metabolic microbial diversity during composting. Blackis Academic and. IN FO. Professional, Glasgow, Scotland. 1995; 1:149-161.. DE. 4. Ryckeboer J, Mergaert J, Vaes K, Klammer S, De Clercq D, Coosemans J,. AS. Insam H, Swings J. A survey of bacteria and fungi occuring during composting. EM. and self-heating processes. Ann. Microbiol. 2003; 53(4):349-410.. SI ST. 5. Cruz N, Castellanos D, Argüello H. Degradación de celulosa y xilano por microorganismos aislados de dos tipos de compost de residuos agrícolas en la. DE. sabana de Bogotá. Rev. Colomb. Cienc. Hortíc. 2009; 3(2):237-249.. IO. N. 6. Sztern D, Pravia M. Manual para la elaboración de compost, bases conceptuales y. CC. procedimientos. Organización Panamericana de la Salud, Montevideo, 2006.. DI. RE. 7. Hummel M, Ruth M, Wyman C. Cellulase for commodity products from cellulosic biomass. Curr Opin Biotechnol.1999;10:358-364 8. Fan L, Lee Y. Mechanism of the enzymatic hydrolysis of cellulose: effects of major structural features of cellulose in enzymatic hydrolisis. Biotech. And Bioeng. 1980; 22:177-199. 30. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(43) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 9. Dongowski G, Sembries S, Bauckhage K, Will F, Dietrich H. Degradation of apple cell wall material by commercial enzyme preparations. Nahrung/Food. 2002; 46: 105-111.. AC IÓ. N. 10. Melherbe S, Cloete T. Lignocellulose biodegradation: Fundamentals and. UN IC. applications. Re/Views in Environmental Science y Bio/Technology. 2002; 1:105114.. CO. M. 11. Castellanos J, Sandoval A, Urtiz N. Obtención de variantes hiperactivas e inactivas. Y. de la endocelulasas cel9 de Myxobacter sp. Acta universitaria ed. Guanajuato,. IC. A. México; Universidad de Guanajuato. 2006:22-26.. ÁT. 12. Ovando S, Waliszewski K. Preparativos de celulasas comerciales y aplicaciones en. RM. procesos extractivos. Universidad y Ciencia ed. Veracruz, México; Instituto. IN FO. Tecnológico de Veracruz. 2005: 111-120.. DE. 13. Sener B. Potenciales y viabilidad del uso de bioetanol y biodiésel para el. AS. Transporte en México. 2006.. EM. 14. Ljungdahl L, Eriksson K. Ecology of microbial cellulose degradation. Advances in. SI ST. Microbiology and Ecology. 1985; 8: 237-299. 15. Marsden W, Gray P. Enzymatic hydrolysis of cellulose in lignocellulosic materials.. DE. CRC Critical Reviews in Biotechnology. 1986; 3: 235-274.. IO. N. 16. Pandey A, Soccol C, Nigam P, Brand D, Mohan R, Roussos S. Biotechnological. DI. RE. CC. potential of coffee pulp and coffee husk for bioprocesses. Biochemical Engineering Journal. 2000; 6: 153-162.. 17. Lynd L,Van Zyl W, MacBride J. Consolidated bioprocessing of cellulosic on biomass: an update. Curr Opin Biotechnol. 2005; 66:506-577.. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(44) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 18. Ramirez P, Coha J. Degradación de celulosa por actinomicetos termófilos: Aislamiento, caracterización y determinación de la actividad celulolitica. Rev. Perú. Biol. 2003; 10:67-77.. UN IC. applications. Biotechnology Advances. 1997; 15: 583-601.. AC IÓ. N. 19. Bhat M, Bhat S. Cellulose degrading enzymes and their potential industrial. 20. Lynd L, Wemier W, Van Zyl W, Pretorius I. Mirobial cellulose utilization:. CO. M. fundamentals and biotechnology Microb. Mol. Biol. Rev. 2002; 66(3):506-577.. Y. 21. Bonilla J, Rivas N. Aislamiento y caracterización de una cepa de actinomiceto. IC. A. celulolitico, termófilo moderado y acidófilo. Revista Científica FCV-LUZ. 2004;. ÁT. 14(5):412-418. RM. 22. Fan L, Lee Y. Mechanism of the enzymatic hydrolysis of cellulose: effects of major. IN FO. structural features of cellulose in enzymatic hydrolisis. Biotech. And Bioeng. 1980; 22:177-199. DE. 23. Dueñas R, Tengerdy R, Gutierrez- Correa M. Cellulase production by mixed fungi in solid-. AS. state fermentation of bagasse. World J. Microbiol. And Biotech. 1995; 11:133-137. EM. 24. Ali S, Sayed A, Sarker R, Alam R. Factors affecting cellulose production by Aspergillus. SI ST. terreus using water hyacinth. World J. Microbiol. and Biotech. 1991; 7: 62- 66. DE. 25. Gutiérrez-Correa M. Producción de etanol y proteína. En Primer Simposium Nacional de. N. Biotecnología. CONCYTEC. Lima, julio 1986. IO. 26. Prasertsan P, Oi S. Production of cellulolitic enzymes from fungi and use in. DI. RE. CC. saccharification of palm cake and palm fibre. World J. Microbiol. and Biotech. 1992; 8: 536-538. 27. Teather R, Wood P. Use of Congo red-polysaccharide interaction in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl Environ. Microbiol. 1982; 43:777-780.. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..