Efecto del pH sobre el crecimiento de bacterias celulolíticas aisladas de residuos vegetales en cultivo líquido

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(1)AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. IC. FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. G. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL. CI. AS. BI. O. LO. MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA. DE. CI EN. Efecto del pH sobre el crecimiento de bacterias celulolíticas aisladas de residuos vegetales en cultivo líquido. CA. TESIS PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE. TE. BIÓLOGO - MICROBIOLOGO. IO. AUTORA: Br. MILAGROS ELIZABET RODRÍGUEZ IBAÑEZ TRUJILLO – PERÚ 2016. BI. BL. ASESOR: Dr. LUIS ALBERTO LLENQUE DÍAZ. 2014 i. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE. G. IC. AS. TRUJILLO. LO. DR. ORLANDO GONZÁLES NIEVES. O. RECTOR. BI. DR. RUBÉN VERA VÉLIZ. CI. AS. VICE-RECTORA ACADÉMICO. CI EN. DR. WEYDER PORTOCARRERO CARDENAS VICE-RECTOR ADMINISTRATIVO. DE. DR. ESTEBAN ILICH ZERPA. BI. BL. IO. TE. CA. PROFESOR SECRETARIO GENERAL. ii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC. AS. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. DR. FREDDY ROGGER MEGIA COICO. BI. O. LO. G. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. DR. WILLIAM ZELADA ESTRAVER. CI EN. CI. AS. PROFESOR SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. DRA. BERTHA SORIANO BERNILLA. DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE. BI. BL. IO. TE. CA. DE. MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. iii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. CERTIFICACIÓN DEL ASESOR El que suscribe, Dr. Luis Alberto Llenque Díaz, en calidad de profesor asesor de la. IC. tesis: Efecto del pH sobre el crecimiento de bacterias celulolíticas aisladas de. LO. G. residuos vegetales en cultivo líquido.. O. CERTIFICA:. BI. Que la investigación ha sido desarrollada de conformidad con los objetivos propuestos en su perfil académico y que el informe ha sido revisado y acoge las. AS. observaciones y sugerencias alcanzadas.. CI. Por ello, autorizo al Br. Milagros Elizabet Rodríguez Ibañez para continuar con. CA. DE. CI EN. los procedimientos según sus fines.. ASESOR. BI. BL. IO. TE. Dr. Luis Alberto Llenque Díaz. iv. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Señores miembros del jurado dictaminador:. LO. En cumplimiento con las disposiciones reglamentarias vigentes para la obtención. G. IC. PRESENTACIÓN. de grados y títulos de las Escuela Académica Profesional de Microbiología y. BI. someto a vuestra consideración y criterio el presente informe de tesis titulado:. O. Parasitología, Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo,. AS. “Efecto del pH sobre el crecimiento de bacterias celulolíticas aisladas de residuos vegetales en cultivo líquido”, con la cual pretendo cumplir con los requisitos para. CI EN. CI. optar el título de Biólogo-Microbiólogo.. CA. DE. Trujillo, Octubre del 2016. BI. BL. IO. TE. Br. Milagros Elizabet Rodríguez Ibañez.. v. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC. AS. MIEMBROS DEL JURADO. G. Dr. Marco Salazar Castillo. DE. CI EN. SECRETARIO. CI. Dr. Luis Alberto Llenque Díaz. AS. BI. O. LO. PRESIDENTE. CA. Ms. C. Anibal Quintana Díaz. BI. BL. IO. TE. VOCAL. vi. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. APROBACIÓN. IC. Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran que el. G. presente informe de tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales,. O. LO. siendo APROBADO por UNANIMIDAD.. BI. Dra. Marco Salazar Castillo. CI EN. CI. AS. PRESIDENTE. Dr. Luis Alberto Llenque Díaz. CA. DE. SECRETARIO. VOCAL. BI. BL. IO. TE. Ms. C. Anibal Quintana Díaz. vii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. DEDICATORIA. IC. A Dios. G. Quien supo guiarme por un buen camino, por darme la fortaleza de. LO. seguir adelante día tras día, enseñándome a encarar las adversidades sin perder nunca la dignidad ni desfallecer en el intento, por su infinita bondad y. O. amor.. BI. A mis padres, José y Carmen. AS. Por su apoyo incondicional, por sus sabios consejos para conseguir. todas mis metas y objetivos, por el amor que me brindan en cada momento y. CI EN. CI. por ser el pilar fundamental en mi vida.. A mi esposo Darwin. Por su amor y comprensión, por brindarme la fuerza y la alegría para. CA. estos años a su lado.. DE. seguir adelante, por su confianza puesta en mí y por permitirme compartir. A mi hija Valeria. TE. Por ser la raíz de todo sacrificio, quien con su llegada ha iluminado mi. BI. BL. IO. vida y hace de mis días los más felices.. viii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. AGRADECIMIENTO. G. dedicación, dando las sugerencias constructivas durante el desarrollo del. IC. A mi asesor, Dr. Luis Alberto Llenque Díaz, por su apoyo, comprensión y. LO. presente trabajo de investigación.. O. A los miembros del jurado, quienes aportaron con su amplia experiencia. AS. BI. en esta investigación.. Al profesor Carlos Quijano jara quien con su apoyo incondicional y. CI EN. CI. desinteresado ayudo en la parte estadística de este trabajo.. Al departamento técnico de Microbiología y Parasitología por facilitarme los equipos y materiales para culminar la parte experimental de. BI. BL. IO. TE. CA. DE. mi tesis.. ix. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. RESUMEN. Trujillo, hasta las 24 h de incubación a 37°C; para lo cual se obtuvo residuos vegetales. LO. (hojas de coliflor, rabanito, cebolla y lechuga) del mercado la Hermelinda- Trujillo; se. G. celulolíticas aisladas a partir de residuos vegetales del mercado La Hermelinda –. IC. El objetivo fue evaluar el efecto del pH sobre el crecimiento de las bacterias. utilizó 10g como muestra, el cual fue triturado en un mortero de porcelana, se añadió. O. 90ml de SSFE y se dejó en reposo por 5min. A partir del sobrenadante se hizo. BI. diluciones seriadas desde 10-1 hasta 10-3, en cada dilución se realizó la siembra por. AS. superficie en agar CMC 0.5% suplementado. Las colonias fueron resembradas por puntura en las mismas condiciones; y después de la incubación se adicionó 2ml de. CI. solución rojo de Congo sobre la superficie del medio, luego de quince minutos se retiró. CI EN. el exceso. Se midieron los halos de hidrólisis alrededor de cada colonia, y se seleccionó 18 cultivos, siendo el cultivo C-3 que presentó mayor halo de hidrólisis, éste fue reactivado y se preparó una suspensión equivalente al tubo N° 1 del nefelómetro de Mac. DE. Farland. En frascos de vidrio se colocó 9ml de CMC a pH 5, 6,7 y 8 se agregó 1 ml de inóculo estandarizado a cada sistema y se incubó a 37ºC por 24h. A las 0, 4, 8, 12, 14,. CA. 16 y 24h de incubación, se hicieron diluciones seriadas con SSFE y se realizó la siembra por superficie en agar CMC 0.5% suplementado, luego se realizó la bioquímica. TE. respectiva a dicho cultivo. Finalmente se concluye que el cultivo C-3 aislado a partir de residuos vegetales del mercado La Hermelinda –Trujillo tuvo un mayor crecimiento a. IO. pH 6 en caldo CMC 0.5% hasta las 14 horas de incubación a 37°C, en cambio a pH 7 su. BL. máximo crecimiento fue hasta las 8 horas, mientras que a pH 5 y pH 8 la población. BI. decreció.. x. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CERTIFICACIÓN DEL ASESOR. iv. PRESENTACIÓN. v. MIEMBROS DEL JURADO. vi. APROBACIÓN. vii. IC. iii. G. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. LO. ii. BI. O. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. AS. CONTENIDO. viii. AS. DEDICATORIA AGRADECIMIENTO. ix x. CI. RESUMEN. CI EN. CONTENIDO INTRODUCCIÓN OBJETIVO. DE. MATERIAL Y MÉTODOS RESULTADOS. CONCLUSIÓN. 7 8 12 17. 26. TE. RECOMENDACIONES. 1. 25. CA. DISCUSIÓN. xi. 27. ANEXOS. 34. BI. BL. IO. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. xi. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. INTRODUCCIÓN. lignocelulósicos pueden ser variados e insolubles, conformado por biomasa. LO. lignocelulósica pre-tratada, muchos de ellos son residuos agroindustriales y el. G. incluyen a la celulosa, hemicelulosa y lignina1; los sustratos carbonados. IC. Los principales polímeros vegetales que se encuentran en los hábitats del suelo. papel filtro2. Entre los compuestos sintéticos tenemos, la celulosa microcristalina3,. BI. O. carboximetilcelulosa, entre otros4,5.. La celulosa es el polisacárido más abundante disponible en la biomasa vegetal,. AS. correspondiendo al menos a un tercio de toda la materia vegetal de la tierra y del. CI. 40 al 60% de la madera y plantas herbáceas. En estado natural, la celulosa se encuentra en forma paracristalina o heterogénea, es decir tiene regiones cristalinas. CI EN. alternadas con zonas amorfas6. En las paredes celulares de las plantas, se encuentran formando las fibrillas de celulosa muy densamente empaquetadas y dispuestas en haces paralelos que rodean a la célula, frecuentemente formando. DE. capas cruzadas; estas fibrillas se hallan aglutinadas por una matriz de otros tres. CA. materiales polímeros: hemicelulosa, pectina y extensina1. La celulosa (C6H10O5)n es un carbohidrato compuesto exclusivamente por. Comentado [J1]:. TE. unidades de β-glucosa; es decir, es un homopolisacárido. Estructuralmente, es rígido e insoluble en agua, que al arreglarse en estructuras más grandes, las. IO. microfibrillas, están suficientemente empaquetadas para prevenir la penetración. BL. no sólo de enzimas sino de pequeñas moléculas semejantes al agua para su degradación o solubilización4; mientras que las regiones amorfas son poco. BI. ordenadas y más sensibles a la degradación7. Guzmán Cedeño8, considera que químicamente es un polímero natural, de peso molecular variable, comprendido 1. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. entre 163,000 y 810,000 g/mol pero puede variar por debajo de estas cifras o estar. LO. maquinaria enzimática necesaria para dicho propósito, por tal razón, su. IC. termofílicas pueden degradar por hidrólisis la celulosa8,10 ya que cuentan con la. G. Las bacterias, hongos y actinomycetes, aerobios, anaerobios, mesofílicos y. AS. bastante por encima de ellas9.. aislamiento e identificación representa un importante recurso para lograr la. O. disminución del impacto ambiental y la generación de un sustrato fermentable. BI. cuya utilidad podría estar en la producción de etanol, ácidos orgánicos,. pertenecen. al. género. Clostridium12,. y. a. los. AS. edulcorantes, productos farmacéuticos y alimentos, entre otros11. La mayor parte actinomicetos. como. CI. Thermomonospora curvata13 y Microbispora bispora14 pero ninguno de éstos son. CI EN. acidófilos, teniendo un pH óptimo para el crecimiento y producción de celulasas igual o mayor a 7.0, por lo que no pueden crecer bajo condiciones ácidas (pH 3.05.0), prevalecientes en determinadas fermentaciones15.. DE. La metodología de aislamiento puede ser de manera directa mediante la técnica de dilución sobre agar, utilizando una muestra fresca que contiene los. CA. microorganismos, pero también se aplican enriquecimientos ex situ con sustratos específicos tal como el carboxi-metil-celulosa5, celulosa microcristalina3, residuos. TE. agroindustriales2,16,17 y papel filtro2. La selección cualitativa o semi-cualitativa de. IO. la actividad hidrolítica de los microorganismos, evalúa la capacidad celulolítica por lo general sobre placas de cultivo que contienen el polisacárido de interés,. BL. luego se tiñe con soluciones coloreadas que detectan el polisacárido residual. BI. formándose un halo de hidrólisis alrededor de las cepas con actividad hidrolítica18. De acuerdo a esta metodología, para la selección de microorganismos celulolíticos generalmente se utiliza placas de cultivo suplementado con carboximetilcelulosa. 2. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Los hábitats donde se encuentran los microorganismos celulolíticos por lo general. AS. son ambientes con alta cantidad de lignocelulosa, donde han desarrollado. investigaciones son el rumen de los animales, el compost, suelos de cultivo,. LO. estiércol, heno, plantas, frutos frescos y contaminados, etc19.. G. degradadores y no degradadores4. En ese sentido, los hábitats con mayores. IC. estrategias para su utilización mediante la interacción entre microorganismos. O. El mecanismo ampliamente aceptado para explicar la hidrólisis enzimática de la. BI. celulosa involucra tres enzimas: la endo β-1,4 glucanasa (β-1,4 glucano. AS. glucanohidrolasa), la exo β-1,4 celobiohidrolasa y la β-1,4 glucosidasa. La endo. β-1,4 glucanasa hidroliza aleatoriamente los enlaces β-1,4 glucosídicos. CI. intramoleculares accesibles de cadenas de celulosa para producir oligosacáridos. CI EN. de varias longitudes. La exo β-1,4 celobiohidrolasa cliva los extremos no reductores del sustrato generando unidades de celobiosa o glucosa y por último la β-1,4 glucosidasa, completa el proceso hidrolítico convirtiendo los fragmentos de. pequeños celoligosacáridos11.. DE. celobiosa a glucosa o removiendo glucosa desde los extremos no reductores de. CA. Algunas especies microbianas pueden producir elevados niveles de enzimas extracelulares y al mismo tiempo ser afectadas por factores físicos (temperatura,. TE. viscosidad, etc.) y químicos (pH, potencial redox, concentración de nutrientes,. IO. etc.) durante el proceso de hidrólisis8, incluyendo la inhibición del complejo celulasas por el producto final, inactivación térmica, sinergismo e irreversible. BL. adsorción de las enzimas, teniendo estos últimos la mayor influencia en la tasa de. BI. degradación del polisacárido20. La hidrólisis microbiana de la celulosa puede. llevarse a cabo desde temperaturas cercanas a la congelación hasta alrededor de los 65°C. Cada uno de los organismos celulolíticos es afectado de diferente forma 3. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. por la temperatura. Por ejemplo, los mesófilos dominan temperaturas moderadas. AS. mientras que la microflora termofílicas puede degradarla por arriba de los 45°C.. microflora, aumentando la velocidad de trasformación del sustrato a causa del. LO. G. efecto directo de éstas sobra la acción enzimática21.. IC. Por consiguiente, la temperatura induce cambios en la composición de la. En ambientes naturales con pH entre neutro y alcalino, muchos microorganismos. O. son capaces de crecer y liberar las enzimas apropiadas para la hidrólisis del. BI. polisacárido; bajo condiciones ácidas la desaparición de la celulosa se debe. AS. principalmente a los hongos filamentosos; aunque el proceso es rápido a pH. menor de 5 y ocasionalmente por debajo de 4, en suelos con bajas concentraciones. CI. del ion hidrógeno degradan la celulosa más fácilmente21. En cambio, el pH óptimo. CI EN. para la actividad de las celulasas producidas por bacterias abarca un amplio rango, el cual incluye condiciones ácidas y alcalinas. Así tenemos que Bacillus subtilis tiene un pH óptimo entre 5-7, Clostridium thermocellum 7, Streptomyces murinus. DE. 6, Bacillus macerans 6, Bacillus sp 9 22.. La celulosa es utilizada como fuente de carbono por los microbios para la. CA. producción de sustancias químicas valiosas3; como la degradación a monómeros de glucosa que es un paso importante para los procesos fermentativos23. Por lo. TE. tanto, el aislamiento, tamizaje y cultivo de los microorganismos celulolíticos son. IO. pasos para la obtención de nuevas enzimas y requieren el uso de medios de cultivo selectivos con la incorporación sustrato carbonado limitante6, como el. BL. carboximetilcelulosa. La fermentación en estado sólido (Solid state fermentation -. BI. SSF) con participación microbiana es una alternativa actualmente utilizada para la producción de enzimas y otros metabolitos secundarios a partir de residuos agroindustriales en biorreactores que resulta poco costosa y requiere mínimas 4. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. actividades de laboreo. Varias investigaciones con este sistema han obtenido. AS. buenos resultados en un amplio rango de aplicaciones tanto en escala de. fermentación. en. estado. sólido. la. degradación. de. residuos. lignocelulósicos bajo estrés de plomo con la cepa fúngica Phanerochaete. LO. chrysosporium obteniéndose buenos resultados26.. G. mediante. IC. laboratorio, piloto e industrial24. En la investigación de Huang25 se estudió. O. Las celulasas tienen un amplio rango de aplicaciones potenciales en biotecnología. BI. y muchas endoglucanasas termoestables tienen un gran potencial para usos. AS. industriales, en la mayoría de los casos son usadas junto con hemicelulasas, pectinasas, ligninasas y otras enzimas relacionadas27. Otras aplicaciones, en la. CI. agricultura, industria papelera, textiles, especialmente en la mejora de la calidad. CI EN. de telas así como en detergentes que proporcionan mejor limpieza sin degradar las fibras; en la industria de alimentos mejorando texturas, sabores y aromas; en la mejora de las fermentaciones de cervezas, vinos y otras bebidas alcohólicas; pero. DE. principalmente en la industria de la bioconversión de materiales celulósicos en alimentos, altos en energía, para ganado con mejores tasas de digestión y. CA. absorción de nutrientes, en la producción de proteína unicelular, lípidos, ácidos orgánicos, etanol solventes y otros productos químicos con un alto valor agregado. TE. como biocombustibles28.. IO. Muchas especies del género Bacillus están normalmente presentes en el suelo y en la materia orgánica en degradación, por lo que se considera que juegan un papel. BL. importante en la biodegradación y bioconversión de componentes de alto peso. BI. molecular. Se ha aislado Bacillus licheniformis a partir de residuos vegetales de flores en compostaje29, Bacillus subtilis en muestras de suelo y agua en la región. 5. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. amazónica30, en residuos de banano31, y en fibras de palma32, dicho género. AS. bacteriano ha demostrado un alto potencial celulolítico29-32.. LO. del algodón, el reciclaje de papel, industria de los detergentes, entre otros10, su. G. mundial debido a sus aplicaciones biotecnológicas variadas33, en el procesamiento. IC. La producción de celulasas constituye la tercera industria más grande a nivel. aplicación en la bioconversión de biomasa a etanol es una alternativa sustentable. O. en la producción de combustibles renovables33. En este sentido, las bacterias. BI. celulolíticas aerobias que se encuentran en los residuos vegetales orgánicos son capaces de degradar y/o transformar moléculas complejas (lignocelulosas,. AS. celulosas y otros) en moléculas más sencillas para su propio metabolismo; pero. CI. que, desde el punto de vista del impacto ambiental pueden contribuir a generar un. CI EN. ambiente más higienizado al degradar dichos residuos orgánicos que generan olores desagradables, o producir productos de interés comercial como enzimas extracelulares y jarabes glucosados. En el presente trabajo se planteó evaluar el efecto del pH del caldo carboximetilcelulosa sobre el crecimiento de bacterias. DE. celulolíticos aisladas de residuos vegetales, para disponer de nuevos cultivos nativos con potencial enzimático, y proponerlos a la comunidad industrial y. CA. empresarial su aplicación en la producción de celulasas a escala de planta piloto e. BI. BL. IO. TE. industrial.. 6. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. OBJETIVOS. LO. aisladas a partir de residuos vegetales del mercado La Hermelinda –Trujillo,. O. hasta las 24 h de incubación a 37°C.. BI. Específicos: 1.. Aislar y seleccionar bacterias celulolíticas a partir de residuos vegetales del. AS. mercado La Hermelinda –Trujillo.. Determinar el valor de pH del caldo carboximetilcelulosa que permite un mejor. CI. 2.. G. 1. Evaluar el efecto del pH sobre el crecimiento de las bacterias celulolíticas. IC. General:. CI EN. crecimiento de las bacterias celulolíticas aisladas, hasta las 24 h de incubación a 37°C.. Identificar el género de la bacteria celulolítica aislada con mejor crecimiento.. BI. BL. IO. TE. CA. DE. 3.. 7. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. MATERIAL Y MÉTODOS. Muestras de residuos de hojas de coliflor, rabanito, cebolla, lechuga procedentes. LO. G. del mercado La Hermelinda –Trujillo.. IC. 1. MATERIAL BIOLÓGICO. O. 2. PROCEDIMIENTO. BI. A. Recolección y transporte de la muestra. Las muestras de residuos vegetales (hojas de coliflor, rabanito, cebolla,. AS. lechuga) procedentes del mercado La Hermelinda –Trujillo, fueron. CI. recolectadas y depositadas en bolsas de polietileno de primer uso, y posteriormente llevadas al Laboratorio de Fisiología Microbiana del. CI EN. Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo.. DE. B. Aislamiento de bacterias celulolíticas. Se pesó 10g de muestra (ANEXO 1), que fue triturado en un mortero de. CA. porcelana (ANEXO 2) luego se agregó 90mL de Solución Salina Fisiológica Estéril (SSFE), se homogeneizó, y luego se dejó en reposo por 5min (ANEXO. TE. 3). A partir del sobrenadante, se hicieron diluciones seriadas al décimo, desde. IO. 10-1 hasta 10-3 (ANEXO 4). Se sembró, 0.1mL de dilución en placas con agar carboximetilcelulosa (CMC) al 0.5% suplementadas con (g/L: (NH4)2SO4,. BL. 0.50; CaCl2, 0.50; K2HPO4, 0.10; KH2PO4, 0.10; Agar, 15.0; pH 6.0±0.2)34,. BI. por el método en superficie35. Estas fueron incubadas a 37°C por 24 a 48 horas.. 8. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. A partir de las colonias bacterianas sospechosas se sembró por puntura, en. AS. placas con agar CMC al 0.5% suplementadas y se incubó en las mismas. G. IC. condiciones anteriores.. LO. C. Selección de bacterias celulolíticas A la placa, con crecimiento bacteriano (colonias aisladas), se le adicionó 2mL. O. de solución rojo de Congo al 1% (P/V) sobre la superficie del medio, y luego. BI. de quince minutos se retiró el exceso36. La selección de cultivos se realizó en base a la presencia de halos de hidrólisis alrededor de cada colonia37 (ANEXO. AS. 5).. CI. Este procedimiento se realizó tres veces para cada muestra recolectada.. CI EN. Los cultivos aislados y seleccionados se sembraron en agar CMC al 0.5%. DE. suplementado para obtener cultivos puros y se conservaron en refrigeración.. D. Reactivación y estandarización del inóculo. CA. El cultivo C-3 fue sembrado por estría en agar CMC 0.5 % suplementado y se. TE. incubó a 37ºC por 12 a 15 horas (ANEXO 6). A partir del cultivo C-3 reactivado, se preparó una suspensión bacteriana con. IO. SSFE; equivalente al tubo N° 1 del nefelómetro de Mac Farland (3.0 x 108. BI. BL. UFC/ml) 11.. 9. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. E. Determinación del crecimiento bacteriano a diferentes pH. bufferado a pH 5; 6; 7; y 8, ajustados con solución de HCl 0.1M e NaOH. G. 0.1M, luego se agregó 1 mL de inóculo estandarizado a cada sistema, y se. IC. En frascos de vidrio, se colocó 9 mL de caldo CMC al 0.5% suplementado y. LO. incubó a 37ºC por 24h.. O. A las 0, 4, 8, 12, 14, 16 y 24h de incubación, se realizaron diluciones seriadas. BI. con SSFE, y se extrajo 0.1 mL de muestra para la siembra por superficie35 en. agar CMC al 0.5% suplementado y bufferado, incubándose a 37ºC por 24 a. AS. 48h.. CI. Después de la incubación se realizó el recuento bacteriano expresado en. CI EN. UFC/mL. Estos procedimientos se realizaron por triplicado.. DE. F. Identificación preliminar y bioquímica. La identificación bioquímica de las bacterias seleccionadas se realizó mediante. CA. la evaluación del comportamiento metabólico de acuerdo al manual de Bergey´s de bacteriología sistemática38, y en base a observaciones macro y. IO. TE. microscópicas, en fresco y mediante coloraciones Gram y Wirtz39.. BL. G. Análisis de resultados Los recuentos obtenidos en cada tiempo de incubación de los sistemas de. BI. ensayo, fueron analizados simultáneamente mediante la Prueba de Análisis de Varianza (ANOVA) con un nivel de significancia de 0.05% y un 95% de. 10. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. intervalo de confianza mediante el software Statgraphics versión centurión. AS. XV.II, para determinar si existe o no diferencia significativa entre dichos. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. resultados.. 11. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. RESULTADOS. G. celulolíticas aisladas a partir de los residuos vegetales, incubado a 37ºC por 48h, donde. IC. En la Fig. 1, se presenta el tamaño promedio de halos de hidrólisis (mm) de las bacterias. LO. se puede observar que el mayor halo (20.7mm) corresponde al cultivo C-3.. O. En la Fig. 2, se presenta las curvas de crecimiento del cultivo C-3 en caldo. BI. carboximetilcelulosa al 0.5% suplementado a pH 5, 6, 7 y 8 a 37ºC, en relación al. AS. tiempo de incubación, donde se puede observar que el mejor crecimiento es a pH6 ya. que alcanza un mejor crecimiento a las 14h de incubación, seguido de pH7, mientras. CI EN. CI. que a pH5 y pH8 decrece.. En la TABLA. 1, se presenta las características macroscópicas y microscópicas del cultivo C-3, formando colonias blanquecinas y secas, con forma bacilar y espora. DE. central.. En la TABLA. 2, se presenta el comportamiento bioquímico del cultivo C-3, el cual. BI. BL. IO. TE. CA. pone de manifiesto que éste pertenece al género Bacillus.. 12. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DE. Fuente: ANEXO 7. Fig. 1. Tamaño promedio de halos de hidrólisis (mm) de las bacterias celulolíticas. BI. BL. IO. TE. CA. aisladas a partir de los residuos vegetales, incubado a 37ºC por 48h.. 13. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Fuente: ANEXO 10, 13, 16,19. CA. Fig. 2. Curvas de crecimiento del cultivo C-3 en caldo carboximetilcelulosa al 0.5%. BI. BL. IO. TE. suplementado a pH 5, 6, 7 y 8 a 37ºC, en relación al tiempo de incubación.. 14. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. O. LO. TABLA. 1. Características macroscópicas y microscópicas del cultivo C-3.. Características microscópicas. Características macroscópicas. BI. Cultivo Reacción. Forma. AS. Gram. color. secas,. planas, opacas, forma irregular. Bacilos pequeños con. Positivo. extremos ovalados,. CI EN. C-3. blanquecino,. CI. Colonias pequeñas a grandes,. con una protuberancia en el. BI. BL. IO. TE. CA. DE. centro de las colonias.. espora central.. 15. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Resultado. Reacción a tinción de Gram. +. Género. +. Hidrólisis de la Gelatina. +. Utilización del citrato. -. Vosges - Proskauer. +. Bacillus sp. CI EN. Prueba de hidrolisis de los tres azucares (TSI). K/A. Fermentación de la glucosa. +. Producción de gas. sulfhídrico. -. +. CA. Catalasa. -. DE. Producción de ácido. LO. Hidrólisis del almidón. BI. -. CI. Crecimiento anaeróbico. O. Central. AS. Posición de la espora. G. IC. Prueba Bioquímicas. AS. TABLA. 2. Pruebas bioquímicas y resultados del cultivo C-3.. -. TE. Crecimiento en NaCI al 7%. +. BI. BL. IO. Crecimiento a pH 5.7. 16. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. DISCUSIÓN. LO. los componentes del medio de cultivo, cabe resaltar al CMC que se comportó como. G. observación del crecimiento bacteriano sobre el agar CMC al 0.5% suplementado. Entre. IC. El aislamiento de bacterias celulolíticas a partir de residuos vegetales se basó en la. fuente de carbono, químicamente es un derivado de celulosa, principal polisacárido. O. constituyente de la madera y de todas las estructuras vegetales, que a diferencia de ella,. BI. es muy soluble en agua40 y que la bacteria debió lograr hidrolizar mediante la secreción. AS. de las enzimas celulasas para obtener metabolitos necesarios para su desarrollo y crecimiento (ANEXO 11-12).. CI. El procesamiento de los diferentes residuos vegetales utilizados como muestra biológica. CI EN. permitió aislar diferentes cultivos bacterianos con capacidad celulolítica ya que se observó diferente tamaños de colonias, y que mediante la adición del colorante rojo de Congo, se verificó que se forman diferentes tamaños de halo neto de hidrólisis. Es decir, las bacterias aisladas presentan diferente capacidad degradadora del CMC en placa. DE. (ANEXO 5). Al respecto, Teather y Wood41, observaron que el rojo de Congo podía ser usado en los ensayos para evidenciar la hidrólisis de polisacáridos debido a que el. CA. colorante forma complejos con las moléculas aún no hidrolizadas, facilitando así la diferenciación entre microorganismos celulolíticos y no celulolíticos por la formación. TE. de zonas de aclaramiento alrededor de las colonias42. De tal manera que en este trabajo. IO. la actividad celulolítica se evidenció mediante la evaluación cualitativa con el revelado. BL. de zonas de aclaramiento utilizando rojo de Congo al 1% (p/v) como ha sido reportado por diferentes autores29, 42,43. Se lograron aislar 18 cultivos en total con tamaños de halos. BI. de hidrolisis alrededor de cada colonia, desde 5mm hasta 20.7mm de diámetro. 17. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. promedio, seleccionándose al cultivo C-3 por presentar el mayor halo neto promedio. AS. para la evaluación posterior a diferentes pH.. LO. cinético en relación al tiempo de incubación, los resultados muestran que el mejor. G. suplementado a diferentes pH se observó que la bacteria tiene diferente comportamiento. IC. Según la evaluación de las curvas de crecimiento de cultivo C-3 en caldo CMC al 0.5 %. crecimiento se obtuvo a pH 6 seguido del pH 7. En cambio a pH 5 y pH 8, no hubo. O. crecimiento sino disminución de las colonias a partir de las 4 h hasta las 24 h de. BI. incubación (Fig. 2). El pH es uno de los agentes fisicoquímico del medio ambiente que. afectan la velocidad con que ocurre el crecimiento celular; sin embargo, las bacterias. AS. disponen de mecanismos homeostáticos que les permite mantener constante el pH. CI. citoplasmico independiente de las fluctuaciones que se presentan en el exterior; esta. CI EN. capacidad de regular su pH interno es diferente para cada organismo ya que en muchos de ellos el pH interno varia solo 0.1 unidad por cada unidad de pH que cambie afuera, mientras que en otros se han observado cambios más grandes44.. Estudios realizados con un rango amplio de organismos han reconocido que no hay un. DE. valor de pH interno óptimo en el citoplasma para todas las bacterias; tal es así que, los organismos acidofílicos exhiben valores de pH interno en el rango de 6.5 a 7.0, los. CA. neutrofílicos de 7.5 a 8.0 y los acidofílicos de 8.4 a 9.0. Esta capacidad regulatoria del pH citoplásmico permite a la mayoría de las bacterias mantener las condiciones. TE. intracelulares apropiadas para el funcionamiento de las enzimas involucradas en su. IO. metabolismo y por consiguiente sobrevivir ante las alteraciones del pH exterior. No se ha esclarecido el mecanismo mediante el cual el pH ejerce su efecto sobre la velocidad. BL. de crecimiento y la viabilidad celular, se ha postulado que quizá ejerza un bloqueo en el. BI. transporte de nutrientes a través de la membrana45.. 18. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Al comparar el crecimiento o no de la bacteria en cada uno de los tiempos de incubación. AS. se verificó que a las 0 horas de incubación hubo un inóculo similar de bacterias en cada. LO. demuestra estadísticamente, cuyo valor-P es 0.7772, (p>0.05), por ende no existe una. G. 4.1x107 UFC/mL; pH7, 5.1x107 UFC/mL; y pH8, 4.8x107 UFC/mL) tal como se. IC. uno de los sistemas de pH como se observa en la Fig. 2 (pH5, 7.05x107 UFC/mL; pH6,. diferencia significativa entre la media de UFC/mL del cultivo C-3 entre un pH y otro,. O. con un nivel del 95.0% de confianza (ANEXO 20).. BI. A las 4 horas de incubación hubo un mejor crecimiento a pH7 (2x108 UFC/mL) seguido. de pH6 (5x107 UFC/mL), mientras que a pH5 (2x106 UFC/mL) y pH8 (1.85x107. AS. UFC/mL) decrece como se observa en la Fig. 2, tal como se demuestra estadísticamente,. CI. cuyo valor-P es 0.3473, (p>0.05), por ende no existe una diferencia significativa entre la. CI EN. media de UFC/mL del cultivo C-3 entre un pH y otro, con un nivel del 95.0% de confianza (ANEXO 21).. A las 8 horas de incubación hubo un mejor crecimiento a pH6 (3.85x109 UFC/mL) seguido de pH7 (4x108 UFC/mL) donde alcanza su máximo crecimiento; mientras que a. DE. pH5 (1x106 UFC/mL) decrece, sin embargo a pH8 (1.95x107 UFC/mL) se mantiene ligeramente constante en comparación con las 4 horas de incubación como se observa. CA. en la Fig. 2, tal como se demuestra estadísticamente, cuyo valor-P es 0.0102, (p<0.05), por ende si existe una diferencia significativa entre la media de UFC/mL del cultivo C-3. TE. entre un pH y otro, con un nivel del 95.0% de confianza (ANEXO 22).. IO. A las 12 horas de incubación hubo un mejor crecimiento a pH6 (4x109 UFC/mL), seguido de pH7 (1x108 UFC/mL) que empieza a decrecer, a pH8 (2x107 UFC/mL) se. BL. mantiene ligeramente constante en comparación con las 8 horas de incubación, mientras. BI. que a pH5 (9x105 UFC/mL) decrece ligeramente como se observa en la Fig. 2, tal como se demuestra estadísticamente, cuyo valor-P es 0.0760, (p>0.05), por ende no existe una. 19. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. diferencia significativa entre la media de UFC/mL del cultivo C-3 entre un pH y otro,. AS. con un nivel del 95.0% de confianza (ANEXO 23).. LO. UFC/mL) decrecen como se observa en la Fig. 2, tal como se demuestra. G. crecimiento, mientras que a pH5 (6x105 UFC/mL), pH7 (2x106 UFC/mL) y pH8 (8x105. IC. A las 14 horas de incubación a pH6 (1.05x1010 UFC/mL) llega a su máximo. estadísticamente, cuyo valor-P es 0.0000, (p<0.05), por ende si existe una diferencia. O. significativa entre la media de UFC/mL del cultivo C-3 entre un pH y otro, con un nivel. BI. del 95.0% de confianza (ANEXO 24).. A las 16 horas de incubación a pH7 (1.75x106 UFC/mL) se mantiene ligeramente. AS. constante en comparación con las 14 horas de incubación, mientras que a pH5 (3x105. CI. UFC/mL), pH6 (2x109 UFC/mL) y pH8 (4x105 UFC/mL) decrecen como se observa en. CI EN. la Fig. 2, tal como se demuestra estadísticamente, cuyo valor-P es 0.3443, (p>0.05), por ende no existe una diferencia significativa entre la media de UFC/mL del cultivo C-3 entre un pH y otro, con un nivel del 95.0% de confianza (ANEXO 25). A las 24 horas de incubación todas las curvas de crecimiento decrecen como se observa. DE. en la Fig. 2 (pH5, 3x104 UFC/mL; pH6, 2.1x108 UFC/mL; pH7, 8x105 UFC/mL y pH8, 2.8x105 UFC/mL) tal como se demuestra estadísticamente, cuyo valor-P es 0.2148,. CA. (p>0.05), por ende no existe una diferencia significativa entre la media de UFC/mL del cultivo C-3 entre un pH y otro, con un nivel del 95.0% de confianza (ANEXO 26).. TE. De acuerdo a los resultados obtenidos para el cultivo C-3, este presentó un mayor. IO. crecimiento a pH 6, que se evidencia con una gran diferencia significancia al ser comparada con los demás tratamientos, mientras que en un estudio realizados por. BL. Torres y Honrubia46, con seis especies de hongos ectomicorrícicos recolectados de. BI. bosques de Pinus sp., mostraron que R. luteolus y R. roseolus presentaron sus máximos de crecimiento en valores de pH mayores a 7.2. Por otra parte, se observó que a pH 6 y. 20. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. pH 7 en tiempo cero, las colonias fueron grandes (ANEXO 11, 12, 14,15) en. AS. comparación con las colonias a pH 5 y pH 8 que fueron colonias pequeñas (ANEXO 8,. LO. dan la apariencia de estar secas, también se observó una protuberancia en el centro de. G. a grandes, de color blanquecino como cera, de forma irregular de bordes lobulados que. IC. 9, 17,18). Macroscópicamente, el cultivo se caracterizó por formar colonias de pequeñas. las colonias lo cual les da una apariencia de huevo estrellado (ANEXO 12); mientras. O. que, al realizar la coloración Gram (ANEXO 27) y Wirtz (ANEXO 28). BI. microscópicamente se observó bacilos Gram positivos de extremos ovalados, con espora central39.. AS. Existen diferentes procedimientos que se utilizan en la identificación y enumeración de. CI. los microorganismos capaces de utilizar la celulosa; siendo la base de estos la hidrólisis. CI EN. de sustratos celulósicos. La utilización de medios líquidos que contienen celulosa permiten estimar cualitativa y cuantitativamente los microorganismos degradadores, los medios sólidos son generalmente más usados pero en estos las colonias de microorganismos que utilizan el sustrato son con frecuencia difíciles de diferenciar de. DE. otros microorganismos que no lo hacen11. De tal manera para la identificación bioquímica del cultivo C-3 se realizó las siguientes pruebas bioquímicas: Crecimiento. CA. anaeróbico, hidrólisis del almidón , hidrólisis de la gelatina, utilización del citrato, Vosges – Proskauer , prueba de hidrolisis de los tres azucares (TSI), fermentación de la. TE. glucosa, producción de gas y producción de ácido sulfhídrico, catalasa, crecimiento en. IO. NaCl al 7%, crecimiento a pH 5.7; según la literatura expuesta con base a criterios fisiológicos y bioquímicos47.. BL. El cultivo C-3 no creció en agar CMC al 0.5% suplementado ni en caldo tioglicolato. BI. cuando fue sometido a condiciones de anaerobiosis (ANEXO 29), lo cual indica que es una bacteria aerobia estricta. En tanto que, en la prueba de hidrólisis del almidón (agar. 21. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. almidón), se observó un halo alrededor de la colonia (aparición de zonas claras), esto. AS. indicó que es amilasa positivo (ANEXO 30). En este caso, el almidón es un polímero. gobernada genéticamente por la síntesis o no de amilasas que son enzimas producidas. LO. por ésta bacteria cuando crece en presencia de almidón48.. G. capacidad de hidrolizarlo en sustancias simples y asimilables. Ésta capacidad está. IC. de glucosa y es usado como única fuente de carbono para el cultivo C-3, ya que tiene la. O. Por otro lado, en la prueba de hidrolisis de la gelatina, permitió determinar la capacidad. 49. BI. del cultivo C-3 para producir enzimas proteolíticas que licúan la gelatina (gelatinasas). . La gelatina es una proteína de estructura sencilla, con colágeno desnaturalizado que. AS. tiene un valor nutritivo para la bacteria. Muchas veces, las proteínas que se producen. CI. naturalmente son demasiado grande para entrar en la célula bacteriana, por lo que primero deben ser degradadas a polipéptidos y finalmente hasta aminoácidos, que. CI EN. entrarán en la célula50, dando una reacción positiva para esta prueba. (ANEXO 31). Mientras que, la siembra en Agar Citrato de Simmons, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno, mientras que, el citrato de sodio es la única fuente de. DE. carbono, éstos componentes son esenciales para el crecimiento de bacterias poseedoras de citrato permeasa, ésta enzima permite realizar el metabolismo del citrato a través del. CA. ciclo del ácido tricarboxílico, consiguiendo la producción de alcalinidad en el medio (color azul). Al someter al cultivo C-3 a ésta prueba no hubo desarrollo bacteriano ni. TE. viraje de color, lo cual indicó que carece de la enzima citrato permeasa al no virar de. IO. color el medio de cultivo, dando una reacción negativa para esta prueba40 (ANEXO 32). La prueba de Voges-Proskauer se basó en la detección de acetoína formada por la. BL. bacteria a partir de la fermentación butanodiólica de la glucosa. El cultivo C-3 tuvo la. BI. capacidad de formar acetoina a partir del ácido pirúvico derivado de la glucosa, siguiendo muchas vías según su sistema enzimático, una de éstas es la fermentación. 22. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. butanodiólica, cuyo producto final es el 2,3 butanodiol, en que la acetoína es el. AS. precursor. La acetoína que se produce cuando reacciona con el hidróxido de potasio. LO. dando una coloración rojiza50, que evidencia una reacción positiva para esta prueba. G. guanídicos de la arginina, que está presente en las peptonas que constituyen el medio,. IC. (KOH al 40% p/v) es oxidada a diacetilo, el que a su vez reacciona con los grupos. (ANEXO 33).. O. La prueba de hidrólisis de los tres azúcares (agar TSI) permitió determinar que el. BI. cultivo C-3 degradó sólo glucosa, ya que la producción de ácido fue débil y en la superficie se evaporó el dióxido de carbono producido por la oxidación de la glucosa,. AS. ésta bacteria utiliza las peptonas, quedando el medio de color rojo violeta, y el color del. CI. medio en el fondo del tubo permaneció de color amarillo. La reacción ocurrida en la. CI EN. superficie del medio corresponde al numerador (parte aerobia) y la reacción ocurrida en la profundidad del medio corresponde al denominador (parte anaerobia). La acidez del medio se denomina con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K (color rojo) 49, de tal manera se evidenció una reacción positiva (K/A) para esta prueba. No se. DE. evidenció presencia de burbujas ni ruptura del medio de cultivo, lo cual indicó que el microorganismo no produce gas. Tampoco se observó ennegrecimiento del medio de. CA. cultivo, lo cual indicó que el microorganismo no produce ácido sulfhídrico (ANEXO 34).. TE. Otras prueba realizadas para lograr identificar al cultivo C-3 fueron la prueba de la. IO. catalasa, que se puso de manifiesto mediante la presencia de la enzima catalasa en el cultivo, ésta enzima la poseen la mayoría de las bacterias aerobias y es capaz de. BL. descomponer el peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) en agua y oxígeno, con el. BI. desprendimiento de burbujas procedentes del oxígeno indicando que la prueba es positiva (ANEXO 35). Otra prueba fue la siembra del cultivo en caldo CMC 0.5% y. 23. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. caldo BHI con 7 % de NaCl cada uno, y éste componente actuó como agente selectivo y. AS. alteró la permeabilidad de la membrana y el equilibrio osmótico de la bacteria,. LO. perfil bioquímico según Bergey´s38, el cultivo C-3 se determinó que corresponde al. G. después de su siembra e incubación, (ANEXO 36). Finalmente, teniendo en cuenta el. IC. evidenciándose que la bacteria no toleró la cantidad de sal y no fue capaz de crecer. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. género Bacillus.. 24. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. CONCLUSIÓN. LO. incubación a 37°C, en cambio a pH 7 su máximo crecimiento fue hasta las 8 horas,. G. Trujillo tuvo un mayor crecimiento a pH 6 en caldo CMC 0.5% hasta las 14 horas de. IC. El cultivo C-3 aislado a partir de residuos vegetales del mercado La Hermelinda –. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. mientras que a pH 5 y pH 8 la población decreció.. 25. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. RECOMENDACIONES. IC. 1. Procesar residuos de frutas para verificar la existencia de microorganismos. LO. G. celulolíticos.. 2. Evaluar y monitorear las curvas de crecimiento de Bacillus sp en otras. O. condiciones fisicoquímicas; como la temperatura y humedad, ya que también. AS. BI. son factores externos que favorecen o dificultan su crecimiento de las bacterias.. 3. Evaluar el crecimiento bacteriano en caldo CMC suplementado con rango de pH. CI EN. CI. más reducido.. 4. Evaluar el crecimiento de estas bacterias en biorreactores con caldo CMC 0.5%. DE. suplementado a diferentes pH.. 5. Tener en cuenta el tiempo de vida media de la preparación de la solución que se. CA. utiliza en el nefelómetro de Mac Farland,. BI. BL. IO. TE. 6. Verificar la producción de celulasas durante la evaluación del crecimiento.. 26. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Vilchez Paz L. Determinación de la Actividad de Exoglucanasas de Cepas. G. Fungicas Nativas de las Provincias de Huaylas y Huaraz. [Tesis]. Lima.2002.. IC. 1.. AS. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. LO. Disponible en: http://sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/tesis/basic/vilches_p_l/t_completo.. O. pdf Consultado el 23/07/2015. BI. 2. Wang CM, Shyu CL, Ho SP, Chiou SH. Characterization of a novel. AS. thermophilic, cellulose-degrading bacterium Paenibacillus sp. strain B39. Lett Appl Microbiol 2008; 47(1):46-53.. CI. 3. Assareh R, Zahiri H, Noghabi K, Aminzadeh S, Khaniki G. Characterization. CI EN. of the newly isolated Geobacillus sp. T1, the efficient 68 cellulase-producer on untreated barley and wheat straws. Bioresource Technology 2012; 120: 99– 105.. 4. Lynd L, Weimer P, Zyl H, Pretorius I. Microbial cellulose utilization:. DE. Fundamentals and Biotechnology. Microbiology and Molecular Biology Reviews 2002; 16: 577-583.. CA. 5. Acharya S, Chaudhary A. Optimization of fermentation conditions for. TE. cellulases production by Bacillus licheniformis MVS1 and Bacillus sp. MVS3 isolated from Indian hot springs. Braz Arch Biol Technol 2012; 55(4):497-. IO. 503.. BL. 6. Juturu V, Wu JC. Celulasas microbianas: ingeniería, producción y aplicaciones. Renovar. Sustain. Energía Rev 2014; 33:188-2013.. BI. 7. Voutilainen S, Puranen T, Siika-aho M, Lappalainen A, Alapuranen M, Kallio J et. al. Cloning, expression and characterization of novel thermostable family. 27. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 7 cellobiohydrolases. Biotechnology and Bioengineering 2008; 101 (3): 515-. AS. 528.. LO. Aguilar Rolando et. al. Aislamiento, selección y caracterización de hongos. G. Rondón Ana Julia, Laurencio Silva Marta, Pérez Quintana Manuel, León. IC. 8. Guzmán Cedeño Ángel Monserrate, Zambrano Pazmiño Diego Efrén,. celulolíticos a partir de muestras de suelo en Manabí-Ecuador. Rev. 2014; 46. O. (2): 1853-8665. Disponible en:. BI. http://www.scielo.org.ar/scielo.php?pid=S1853-. AS. 86652014000200013&script=sci_arttext Consultado el 20/07/2015. 9. Canché-Escamilla1 G, De los Santos-Hernández J.M, Andrade-Canto S,. CI EN. banano. La Serena 2005; 16 (1): 0718-0764.. CI. Gómez-Cruz R. Obtención de celulosa a partir de los desechos agrícolas del. 10. Yan Sh, Wu G. Secretory pathway of cellulase: a mini-review. Biotechnology for Biofuels 2013; 6: 177.. 11. Gaitán Bohorquez Diana María, Pérez Pérez Liliana Ibeth. Aislamiento y. DE. Evaluación de microorganismos celuloliticos aislados a partir de residuos vegetales frescos y en compost generados en un cultivo de crisantemo. TE. Disponible en:. CA. (Dendranthema grandiflora). [Tesis]. Bogotá. 2007.. http://repository.javeriana.edu.co/bitstream/10554/8296/1/tesis274.pdf. IO. Consultado el 01/08/2015. BL. 12. Sirisena DM, Maamendra TP. Isolation and characterization of cellulolytic. BI. bacteria from decomposing rice straw. J Natn Sci Coun Sri Lanka 1995; 23(1):25-30.. 28. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 13. Rastogi G, Bhalla A, Adhikari A, Bischoff KM, Hughes SR, Christopher LP. AS. et.al. Characterization of thermostable cellulases produced by Bacillus and. LO. E18 bifunctional xylanase-glucanase with a single catalytic domain. Appl. G. 14. Shi P, Tian J, Yuan T, Liu X, Huang H, Bai Y et. al. Paenibacillus sp. strain. IC. Geobacillus strains. Bioresour Technol 2010; 101(22):8798–806.. Environ Microbiol 2010; 76(11):3620-4.. O. 15. Nogi Y, Takami H, Horikoshi K. Characterization of alkaliphilic Bacillus. BI. strains used in industry: Proposal of five novel species. Int J Syst Evol Microbiol 2005; 55(6):2309–15.. AS. 16. Adsul M, Ghule J, Shaikh H, Singh R, Bastwde K, Gokhale D et. al.. CI. Enzymatic hydrolysis of delignified bagasse polisaccharides. Carbohydrates. CI EN. Polymer 2005; 62 (1): 6-10.. 17. Camassola M, Dillon A. Production of cellulases and hemicellulases by Penicillium echinulatum grown on pretreated sugar cane bagasse and wheat bran in solid-state fermentation. J Appl Microbiol 2007; 103(6):2196-204.. DE. 18. Percival Zhang YH, Himmel ME and Mielenz J.R. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. Biotechnology Advances. CA. 2006; 24 (5): 452-481.. 19. Uyaguari C. Elmer. F. “Manejo de Residuos Vegetales de los Mercados de. TE. Cuenca para la Elaboración de Abonos Orgánicos”. 2012. (Sitio en internet).. IO. Disponible en:. BL. http://dspace.ucuenca.edu.ec/jspui/bitstream/123456789/3345/1/TESIS.pdf Consultado el 11/08/2015.. BI. 20. Mansfield S, Mooney Cy, Saddler J. Substrate and Enzime Characteristics that Limit Cellulose Hydrolysis. Biotechnol. Prog 1999; 15:804-816. 29. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 21. Alexander M. Introducción a la Microbiología del suelo. México AGT 1980;. AS. 135.. G. issues of bioconversion and enzyme production. African Journal of. IC. 22. Howard R, Abotsi E, Rensburg J, Howard S. Lignocellulose Biotechnology:. LO. Biotechnology 2003; 2: 602-619. 23. Van Dyk JS, Pletschke BI. A review of lignocellulose bioconversion.. O. Biotechnology Advances 2012; 30:1458–1480. BI. 24. Lee C, Darah I, Ibrahim C. Production and Optimization of cellulase enzyme. using Aspergillus niger USM AI 1 and comparison with Trichoderma reesei. AS. via solid state fermentation system. Biotechnology Research International.. CI. 2010.. CI EN. 25. Huang D, Zeng G, Feng C, Hu S, Zhao M, Lai C et. al. Mycelial growth and solid-state fermentation of lignocellulosic waste by white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium under lead stress. Chemosphere 2010; 81: 1091 – 1097.. DE. 26. Grijalva Vallejos N. Degradación de residuos vegetales mediante inoculación con cepas microbianas. Enfoque UTE 2013; 4(1):1-13.. CA. 27. Karmakar M., Ray R. “Current trends in research and application of microbial cellulases”. Research Journal of Microbiology 2011; 6 (1) 41-53.. TE. 28. Chander R. K., Gupta R., Singh A. “Microbial cellulases and their Industrial. IO. Applications” Enzyme Research 2011; 1:1-10. 29. Lu W, Wang H, Yang S, Wang Z, Nie Y. Isolation and characterization of. BL. mesophilic cellulose-degrading bacteria from flower stalks-vegetables waste. BI. co-composting system. J.Gen. Appl. Microbiol 2005; 51: 353-360.. 30. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(43) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 30. Heck J, Hertz P, Ayub M. Cellulase and Xylanase production by isolated. AS. amazon Bacillus strains using soybean industrial residue based solid-state. G. 31. Krishna C. Production of bacterial cellulases by solid state bioprocessing of. IC. cultivation. Brazilian journal of microbiology 2002; 33: 213-218.. LO. banana wastes. Bioresource Technology 1999; 69:231-239. 32. Apun K, Jong B, Salleh M. Screening and isolation of a cellulolytic and. O. amylolytic Bacillus from sago pith waste. J. Gen. Appl. Microbiol 2000;. BI. 4:263-267.. 33. Singhania R R, Sukumaran R K, Patel A K, Larroche C, Pandey A.. AS. Advancement and comparative profiles in the production technologies using. CI EN. Microbial Technology 2010; 46: 541–549.. CI. solid-state and submerged fermentation for microbial cellulases Enzyme and. 34. Moreno A. Aislamiento de hongos y bacterias celulolíticos a partir de bagazo de caña de azúcar. [Tesis]. Trujillo: Universidad Nacional de Trujillo. Facultad de Ciencias Biológicas; 2013.. DE. 35. Allaert C, Escola M. Métodos de análisis microbiológicos de los alimentos. Madrid, España: Editorial Díaz de Santos. S.A.; 2002.. CA. 36. Sazci A, Radford A, Erenler K. Detection of cellulotic fungi by using congo red as an indicator: a comparative study with dinitrosalicylic acid reagent. TE. method. Journal of Apllied Bacteriology 1986; 61:559-562.. IO. 37. Ferrer Y, León M, Michelena G, Dustet J C, Duque A, Ibáñez M et.al. Selección de hongos aislados de bagazo de caña con actividad celulasa sobre. BI. BL. celulosa cristalina para posibles aplicaciones industriales 2011; 45(1):3-12.. 31. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(44) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 38. Bergey D. Noel R. Krieg James T. Staley Daniel R. Brown Brian P. Hedlund. AS. Bruce J et. al. Editores. Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática. 2aed.. LO. del género Bacillus: morfología macroscópica y microscópica. Rev 2002; 22. G. 39. Realpe María Elena, Hernández Carlos Arturo, Agudelo Clara Inés. Especies. IC. Pensilvania – EE.UU: Ardcover; 2010.. (2):106-109.. O. 40. Reinoso Pozo Yaritza, Casadesús Romero Luis, García Suárez Armando,. BI. Gutiérrez Pérez Jorge y Álvarez Rivera Victoria. Aislamiento, selección e identificación de bacterias del género Bacillus antagonistas de Pectobacterium. AS. carotovorum 2006; 10(3):187-191.. CI. 41. Teather R, Wood P. Use of congo red – polysaccharide interaction in. CI EN. enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl Environ. Microbiol 1982; 43: 777-780.. 42. Hendricks C, Doyle J and Hugley B. A New Solid Medium for Enumerating Cellulose-Utilizing Bacteria in Soil. Appl. Environ. Microbiol 1995; 61:2016-. DE. 2019.. 43. Zhang Y, Himmel M, Mielenz J. Outlook for cellulase improvement:. CA. Screening and selection strategies. Biotechnology Advances 2006; 24: 452481.. TE. 44. Vereecken K.M, E.J. Dens y J.F. Van Impe. Predictive modeling of mixed. IO. microbial populations in food products: evaluation of two-species models. J. Theoret. Biol. 2000; 205 (1): 53-72.. BL. 45. Doona C. J, F.E. Feeherry y E.W. Ross. A quasi-chemical model for the. BI. growth and death of microorganisms in foods by non thermal and high pressure processing, Int. J. Microbiol. 2004; 10 (1-3): 21-32.. 32. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(45) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 46. Torres P, M Honrubia. Dinámica de crecimiento y caracterización de algunos. AS. hongos ectomicorrícicos en cultivo. Cryptogamie Mycologie 1991; 12:183-. G. 47. Koneman.E.W. Diagnostico microbiológico: Texto y atlas de color. 5aed.. IC. 192.. LO. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires. 2001. 48. Tapia Fiorela, Moreno Patricia. Formulación de medios de cultivo y. O. producción de Bacillus thuringiensis var. kurstaki a nivel de laboratorio 2012;. BI. 1:1-37.. 49. Calvo Pamela, Zúñiga Doris. Caracterización fisiológica de cepas de Bacillus. AS. spp aisladas de la rizósfera de papa (Solanum tuberosum) 2010; 9(1):31-39.. CI. 50. Cuervo Lozada Jeanny Paola. Aislamiento y caracterización de Bacillus spp. CI EN. como fijadores biológicos de nitrógeno y solubilizadores de fosfatos en dos. BI. BL. IO. TE. CA. DE. muestras de biofertilizantes comerciales. [Tesis]. Bogotá D.C.2010.. 33. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(46) AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. ANEXOS. 34. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(47) AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. ANEXO. 1. Pesaje de la muestra de residuos vegetales.. BI. ANEXO. 2. Trituración de la muestra en un mortero de porcelana.. 35. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(48) AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CI EN. CI. ANEXO. 3. Disolución de la muestra triturada con 90mL de SSFE.. 10-1. 10-3. TE. CA. DE. 10-2. BI. BL. IO. ANEXO. 4. Diluciones seriadas desde 10-1 hasta 10-3.. 36. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(49) AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. ANEXO. 5. Selección de la bacteria con mayor producción de celulosa al formar un halo más grande de hidrolisis, al agregar rojo de congo a la placa.. BI. BL. ANEXO. 6. Reactivación de cultivos microbianos.. 37. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..