Efecto de glifosato sobre el crecimiento de Trichoderma viride en condiciones de laboratorio

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ESCUELA PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y. AS. BI O. LO. G. IC AS. PARASITOLOGÍA. CI. EN CI. “Efecto de glifosato sobre el crecimiento de Trichoderma viride en condiciones de laboratorio”. DE. TESIS. TE. CA. PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO – MICROBIÓLOGO. IO. AUTOR:. BL. Br. ORELLANO ROJAS, Diego Alonso. BI. ASESOR:. Ms.C. WILSON KRUGG, Juan Héctor Trujillo – Perú 2019 1. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Dr. Orlando Moisés Gonzáles Nieves. BI O. LO. G. RECTOR. IC AS. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. Dr. Rubén César Vera Véliz. CI. EN CI. AS. VICERRECTOR ACADÉMICO. Dr. Weyder Portocarrero Cárdenas. Dr. Steban Alejandro Ilich Zerpa PROFESOR SECRETARIO GENERAL. BI. BL. IO. TE. CA. DE. VICERRECTOR DE INVESTIGACIÓN. II Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. LO. Dr. Freddy Rogger Mejía Coico. G. IC AS. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. EN CI. AS. BI O. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. CI. William Elmer Zelada Estraver. Dra. Manuela Natividad Luján Velásquez. BL. IO. TE. CA. DE. SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. BI. DIRECTORA DE LA E.A.P. DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. III Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN. IC AS. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:. Cumpliendo con las disposiciones establecidas por el Reglamento de Grados y Títulos. LO. G. de la Universidad Nacional de Trujillo, presento a su consideración y elevado criterio la presente Tesis titulada: “Efecto del glifosato sobre el crecimiento de Trichoderma viride en condiciones de. BI O. laboratorio”, con el objetivo de obtener el Título Profesional de Biólogo-Microbiólogo.. Trujillo, Junio del 2019. TE. CA. DE. CI. EN CI. AS. Espero que este trabajo sea de su aprobación.. IO. ____________________________________. BI. BL. Br. DIEGO ALONSO ORELLANO ROJAS. IV Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. LO. G. IC AS. MIEMBROS DEL JURADO. EN CI. AS. BI O. ______________________________________ DRA. MANUELA NATIVIDAD LUJAN VELÁSQUEZ PRESIDENTA. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI. ______________________________________ Ms.C. JUAN HECTOR WILSON KRUGG SECRETARIO. ______________________________________ Ms.C. JAIME AGREDA GAITAN VOCAL. V Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEL ASESOR. El que suscribe: Ms.C. Juan Héctor Wilson Krugg asesor de la presente tesis titulada:. LO. G. IC AS. “Efecto del glifosato sobre el crecimiento de Trichoderma viride en condiciones de laboratorio.”. BI O. CERTIFICA:. Que la investigación ha sido desarrollada de conformidad con su correspondiente proyecto. AS. de Tesis y teniendo en cuenta las orientaciones pertinentes.. EN CI. Que, el informe ha sido redactado bajo mi asesoramiento, acogiendo las observaciones y sugerencias alcanzadas. Por ello, autorizo al Bachiller Diego Alonso Orellano Rojas, para. DE. CI. continuar con los procedimientos correspondientes según sus fines.. _______________________________________ Ms.C. JUAN HÉCTOR WILSON KRUGG. BI. BL. IO. TE. CA. Trujillo, Junio del 2019. ASESOR. VI Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN Los profesores que suscriben, miembros del jurado, declaran que el presente informe de tesis ha. LO. G. IC AS. cumplido con los requisitos formales y fundamentales, siendo aprobado por unanimidad.. ______________________________________. CI. EN CI. AS. BI O. DRA. MANUELA NATIVIDAD LUJAN VELÁSQUEZ PRESIDENTA. DE. ______________________________________. BI. BL. IO. TE. CA. Ms.C. JUAN HÉCTOR WILSON KRUGG SECRETARIO. ______________________________________ Ms.C. JAIME AGREDA GAITAN VOCAL. VII Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIA. BI O. LO. G. IC AS. A Dios, quién ha sido mi guía y mi fortaleza en los momentos de dificultad y también por ser quién me ha dado paciencia y perseverancia para lograr todas mis metas profesionales y personales.. CI. EN CI. AS. A mis padres, por su cariño, apoyo y confianza incondicional a pesar de las adversidades. Por haber estado conmigo en todo momento y ser testigos de mis logros.. BL. IO. TE. CA. DE. A mi familia, en especial a mi abuelita, tíos y primos, quienes me brindaron su confianza, cariño y estuvieron siempre pendientes de mi bienestar.. BI. A las personas que ya no están conmigo, que marcaron mi vida y que extraño, que esperaron mucho de mí. Todo lo que logre en la vida será siempre dedicado a ellos.. VIII Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC AS. AGRADECIMIENTOS. G. A mi asesor Ms.C. Juan Héctor Wilson Krugg por su apoyo, tiempo y sus buenos consejos que me. EN CI. AS. BI O. LO. ayudaron en la realización de la presente tesis.. A mis queridos amigos y colegas, con quienes he pasado muchos momentos agradables en la vida. TE. CA. DE. CI. universitaria, y me han brindado su apoyo para la ejecución de la presente tesis.. IO. Al laboratorio de farmacognosia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad. BI. BL. Nacional de Trujillo, que ayudó con la realización del análisis de cromatografía en capa fina.. IX Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN Se determinó el efecto de glifosato sobre el crecimiento de Trichoderma viride en condiciones de laboratorio. Para esto se realizó la propagación del cultivo de Trichoderma viride en agar papa. IC AS. sacarosa (APS), posteriormente se evaluó el efecto del glifosato a las concentraciones de 1440, 4320 y 7200 ppm sobre el crecimiento del hongo en medio sólido y en medio líquido empleando medio mínimo de sales. En los resultados se encontró que el crecimiento radial de Trichoderma. LO. G. viride en la concentración de 1440 ppm fue 68.87 % respecto al control, mientras que en las concentraciones de 4320 y 7200 ppm el crecimiento fue 53.36 y 45.34 % respectivamente; esto. BI O. demostró que el crecimiento radial de Trichoderma viride fue inversamente proporcional a las. AS. concentraciones del herbicida. Con respecto al peso seco el porcentaje obtenido en la concentración de 1440 ppm fue 15.310%, mientras que en las concentraciones de 4320 y 7200. EN CI. ppm fueron 29.388 y 37.551% respectivamente, con relación al control, las dos últimas concentraciones fueron estadísticamente iguales por lo que su efecto sobre el peso seco resultó ser. CI. el mismo. Por su parte, la prueba analítica de cromatografía en capa fina (CCF) determinó que. DE. hubo presencia de compuestos aminados diferentes al herbicida en las tres concentraciones. Se concluye que Trichoderma viride es capaz de degradar glifosato a las concentraciones de 1440,. TE. CA. 4320 y 7200 ppm en condiciones de laboratorio.. BI. BL. IO. Palabras clave: Trichoderma viride, glifosato, peso seco / biomasa, Cromatografía en Capa Fina (CCF).. X Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ABSTRACT The effect of glyphosate on the growth of Trichoderma viride was determinated under laboratory conditions. For this, the propagation of the Trichoderma viride culture in potato dextrose agar. IC AS. (PDA) was carried out, afterwards the effect of glyphosate at the concentrations of 1440, 4320 and 7200 ppm on the growth of fungus was evaluated in solid and liquid medium using Minimal Salt Medium. In the results it was found that the radial growth of Trichoderma viride in the. LO. G. concentration of 1440 ppm was 68.87% with respect to the control, whereas in the concentrations of 4320 and 7200 ppm the growth was 53.36 and 45.34% respectively; this showed that the radial. BI O. growth of Trichoderma viride was inversely proportional to the herbicide concentrations.. AS. Regarding dry weight, the percentage obtained in the concentration of 1440 ppm was 15,310%, whereas in the concentrations of 4320 and 7200 ppm were 29,388 and 37,551% respectively, with. EN CI. relation to the control, the last two concentrations were statistically equal so that its effect on dry weight turned out to be the same. For its part, the analytical test of Thin Layer Chromatography. CI. (TLC) determined that there was presence of amino compounds different from the herbicide in the. DE. three concentrations. It concludes that Trichoderma viride is able to degrade glyphosate at. TE. CA. concentrations of 1440, 4320 and 7200 ppm under laboratory conditions.. BI. BL. IO. Key Words: Trichoderma viride, glyphosate, dry weight / biomass, thin layer chromatography (TLC).. XI Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. TABLA DE CONTENIDOS Página AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO…………...………..II AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS……………………....III. IC AS. PRESENTACIÓN……………………………………………………….………….………...... IV MIEMBROS DEL JURADO ……………………………………………………………...........V. G. DEL ASESOR……………………………………………………………………..………….....VI. LO. APROBACIÓN……………………………………………………...…………………………..VII. BI O. DEDICATORIAS……………..…………………………………………………………….......VIII AGRADECIMIENTOS..…………………………………………………………………...…... IX. AS. RESUMEN.………………………………………………………………………………...…... X. EN CI. ABSTRACT……………………………………………………………………………………..XI I. INTRODUCCIÓN...…………………………………………………………………....01 II. MATERIAL Y MÉTODOS………………………………………………………….....08. CI. 1. MATERIAL DE ESTUDIO …………………………………………………......08 2. PROCEDIMIENTO……………………………………….…………………..…08. DE. 2.1. Reactivación del cultivo de Trichoderma viride …………………………….08 2.2. Evaluación del crecimiento de Trichoderma viride empleando como sustrato. CA. glifosato………………………………………………………….………….. 08. 2.2.1. Evaluación en medio sólido.………………………………………….08. BI. BL. IO. TE. 2.2.1.1.Preparación del medio control positivo en Agar Mínimo de Sales (AMS) suplementado con fuente de carbono conocida ……….... 08. 2.2.1.2.Preparación del medio control negativo en AMS ………………...08 2.2.1.3.Preparación de AMS con glifosato……….....................................09 2.2.1.4.Siembra e incubación………….…………………………………09 2.2.1.5.Lectura……………………………………………………….…..09 2.2.2. Evaluación en medio líquido………………………………………...10 2.2.2.1.Preparación del medio control positivo en Caldo Mínimo de Sales (CMS) suplementado con fuente de carbono conocida ……..........10 2.2.2.2.Preparación de CMS con glifosato …………..…………………...10 2.2.2.3.Propagación de Trichoderma viride……….………………….….10 XII. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.2.2.4.Estandarización de la suspensión de conidias de Trichoderma viride…………………………………………………..…………10 2.2.2.5.Evaluación de crecimiento de Trichoderma viride en CMS ….…..11 2.2.2.5.1. Construcción del sistema aireado de agitación ….……….11 2.2.2.5.2. Producción de biomasa……………………………….......11. IC AS. 2.2.2.5.3. Filtración y secado……………………………………..... 11 2.2.2.5.4. Obtención de resultados……………………………….....12 2.2.2.6.Evaluación de la degradación de glifosato por cromatografía en capa. G. fina………………………………………………..……………...12. LO. 2.2.2.6.1. Preparación de la muestra………………………………..12 2.2.2.6.2. Lectura...…………………………………………………12. BI O. 2.2.2.7.Análisis de datos……..…………………………………………..12 III. RESULTADOS………………………………………………………………………...13 IV. DISCUSIÓN……………………………………………………………………………18. AS. V. CONCLUSIÓN ………………………………………………………………….……..24. EN CI. VI. RECOMENDACIONES………………………………………………….…………… 25 VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………….………………….26. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI. ANEXOS…………………………………………………………………………………...34. XIII Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. I.. INTRODUCCIÓN. La disminución de la productividad de los cultivos principalmente debido a plagas y agentes patógenos desempeña un papel crucial en todo el mundo 1. Estos factores ocasionan pérdidas de varios miles de millones de dólares, directa o indirectamente 2. Se conoce que,. IC AS. de las pérdidas ocasionadas, aquellas causadas por malezas exceden ampliamente a las causadas por cualquier otra categoría de plagas; de esta manera se ha informado que, las. G. malezas representan el 45% de la pérdida anual total de productos agrícolas, los insectos. BI O. LO. el 30%, las enfermedades (causadas por patógenos) el 20% y otras plagas el 5%3,4.. Es difícil precisar una definición de lo que se entiende por malezas, ya que una planta. AS. puede resultar buena para unos e indeseable para otros. Sin embargo, de las muchas definiciones que se le han dado al término maleza casi todas apuntan a la relación que el. EN CI. hombre establece con las plantas. Se dice entonces que las malezas son plantas que obstaculizan el normal desarrollo de los cultivos, que afectan de manera negativa el. CI. bienestar del hombre5. La terminología más sencilla define a las malezas como plantas. DE. fuera de lugar, es decir, que crecen donde no se desean, sin introducción voluntaria y que. CA. poseen una serie de características que no tienen la mayoría de las plantas cultivadas 6. Las malezas son especies vegetales indeseables que tienen vigorosa producción de. TE. semillas, rusticidad y alta capacidad de reproducción y diseminación (sobre todo en. IO. ambientes inhóspitos); son versátiles y responden con relativa facilidad a las alteraciones. BL. ecológicas6,7. Contrariamente a los otros tipos de plagas, las malezas comparten un nivel. BI. trófico similar con las plantas de cultivo, por ello, al competir por los recursos escasos causan enormes pérdidas en el rendimiento de los cultivos 8. La dinámica de esta competencia se ve influenciada por factores climáticos, pues cambios abruptos permiten que los cultivos sean más vulnerables a ataques de insectos y patógenos y sean menos competitivos frente a las malezas8,9.. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. De las casi 300.000 especies de plantas ubicadas en la Clase Angiospermae (división Tracheophyta, subdivisión Spermopsida), descritas mundialmente, alrededor de unas 30.000 se catalogan como malezas y están comprendidas en su mayoría en las familias: Amaranthaceae, Compositae (Asteraceae), Convolvulaceae, Cruciferaceae, Cyperaceae,. IC AS. Chenopodiaceae, Euphorbiaceae, Gramineae (Poaceae), Leguminoseae (Fabaceae), Malvaceae, Maranthaceae, Poligonaceae, Sterculiaceae y Solanaceae. 10,11. .. G. Actualmente, implementar estrategias de gestión eficaces y eficientes para controlar los. LO. brotes de plagas es un desafío que necesita un conocimiento exhaustivo de la biología y. BI O. ecología de las plagas, así como anticipar sus cambios evolutivos que pueden agravar sus problemas de manejo12. Como en las otras plagas, el control de malezas busca regular o. AS. mantener las poblaciones de estas a un nivel tal que se minimicen las grandes pérdidas de. EN CI. la producción de cultivos y además se aumente y mejore la calidad del rendimiento; utilizando todas las técnicas y métodos adecuados de forma compatible, en concordancia. CI. con el desarrollo de una agricultura sostenible y con los principios del manejo integrado de. DE. plagas3,7.. Existen varios métodos para el control de las malezas o para reducir su infestación a un. CA. determinado nivel. Entre estos tenemos: Métodos preventivos, físicos (arranque manual,. TE. escarda con azada, corte con machete u otras herramientas y labores de cultivo), culturales. IO. (rotación de cultivos, preparación del terreno, uso de variedades competitivas, distancia de. BL. siembra o plantación, cultivos intercalados o policultivo, cobertura viva de cultivos, acolchado y manejo de agua), biológicos (usando enemigos naturales específicos para el. BI. control de especies de malezas), no convencionales (como la solarización del suelo) y métodos químicos a través del uso de herbicidas3,13. Usados, dentro de un sistema integrado de manejo de malezas, los herbicidas son de uso seguro para el agricultor y de riesgo mínimo para el medio ambiente 13. Sin embargo, los. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. herbicidas deben ser aplicados en las dosis y tiempos establecidos para que tengan el efecto esperado y no generen problemas secundarios indeseables 14. Los posibles problemas asociados con el uso de herbicidas son: daños a la vegetación no objetivo y cultivos, reducción de la calidad del suelo y el agua, toxicidad para otros organismos objetivo,. IC AS. preocupaciones por la salud y seguridad humana y poblaciones de malezas resistentes a los herbicidas 3,15.. G. Así mismo, muchos de los productos químicos empleados en la agricultura posiblemente. LO. también destruyan los microbios beneficiosos del suelo, como los hongos endofíticos y las. BI O. bacterias16. Algunos herbicidas químicos como triclopyr y glifosato pueden causar cambios en las comunidades microbianas del suelo local al facilitar el aumento de hongos. AS. fitopatógenos17 y al reducir o inhibir el crecimiento y la actividad de bacterias beneficiosas. EN CI. que ayudan en procesos como la oxidación del amoniaco y la fijación de nitrógeno 18,19. A pesar de los efectos no deseados de los productos químicos en general, los herbicidas. CI. siguen siendo la clase más utilizada y el grupo más importante en la agricultura 20 debido a. DE. que su consumo mundial representa el 47.5% de los 2 millones de toneladas de plaguicidas que se consumen cada año3,21. De todos los herbicidas, el glifosato es uno de los más. CA. ampliamente utilizados20,22 por su amplio espectro contra malezas anuales y perennes en. TE. agricultura, silvicultura, áreas urbanas y jardines domésticos 23,24. El uso masivo de. IO. glifosato se debe a la eliminación eficiente de malezas y al desarrollo de variedades de soja,. BL. algodón, canola y maíz genéticamente modificadas resistentes a glifosato 25.. BI. El glifosato [N- (fosfonometil) glicina], es un compuesto perteneciente al grupo de los amino fosfonatos sintéticos que tiene enlaces carbono-fósforo estables (C-P)22. Se conoce que el glifosato inhibe la enzima 5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), responsable de la síntesis de ácido shikímico que participa en la síntesis de aminoácidos aromáticos. La inhibición de EPSPS por acción del glifosato suprime la síntesis de. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. proteínas necesarias y metabolitos secundarios, y dificulta las vías de energía vitales en plantas y microorganismos del suelo22,26. Aunque se considera más seguro en comparación con otros herbicidas, el uso extensivo de glifosato plantea peligros crónicos y remotos para los seres humanos y el medio ambiente. IC AS. ecológico27,28. Las prácticas de aplicación inadecuadas y el exceso de pulverización resultan en su presencia generalizada en entornos acuáticos y terrestres29. El glifosato se. G. une a las partículas del suelo y se acumula en la capa superior. Por lo tanto, a menudo se. BI O. superficial, que la transportan en el suelo26,30.. LO. detecta en aguas subterráneas, aguas superficiales y sedimentos de agua de la escorrentía. AS. Para eliminar los riesgos del glifosato en el medio ambiente el desarrollo de una biorremediación efectiva y ecológica es una estrategia inevitable. Es necesario estudiar. EN CI. microorganismos degradantes de glifosato debido a que la degradación microbiana se considera la vía más importante para la descomposición de este herbicida 31,32. Diferentes. CI. estudios han reportado microorganismos efectivos y potenciales para una biorremediación. DE. eficiente y rápida de ambientes contaminados con glifosato 33,34. Existen varios microorganismos degradantes de glifosato, sin embargo, los que cumplen. CA. un papel fundamental son las bacterias y algunos hongos como Aspergillus niger,. TE. Aspergillus oryzae A-F02, Penicillium notatum y Scopulariopsis sp. que utilizan el. IO. glifosato como su única fuente de fósforo33. Sin embargo, algunas otras cepas pueden usar,. BL. muy raramente, glifosato como fuente de carbono y nitrógeno32, 34. Para evaluar el potencial. BI. de los microorganismos degradadores de glifosato para la biorremediación, es necesario optimizar sus condiciones de degradación, que incluyen el pH inicial, la temperatura de incubación, la concentración de glifosato, la biomasa de inoculación y el tiempo de incubación22.. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La biodegradación de glifosato por microorganismos nativos o introducidos puede ser, entonces, un medio eficaz para su eliminación de suelos y aguas 35. Una buena alternativa para la biodegradación del glifosato, que a su vez proteja a los cultivos de hongos patógenos que incrementan su población en proporción a las concentraciones de. IC AS. glifosato36, sería el empleo de especies del género Trichoderma, ya que se conoce que este hongo puede transformar contaminantes ambientales además de ser un excelente. G. antagonista empleado en el control biológico.. LO. Trichoderma es un género de hongos filamentosos perteneciente a la división Ascomycota. BI O. que consta de más de 100 especies37. Es uno de los géneros de hongos saprófitos más comúnmente aislado, conocido por sus diversas características fisiológicas, aplicaciones. AS. biotecnológicas y por ser colonizador exitosos de sus hábitats al poseer potentes. EN CI. mecanismos enzimáticos (celulasas, quitinasas, glucanasas, proteasas, etc.) que le permite descomponer y utilizar innumerables sustratos38 como las superficies de raíces de plantas,. CI. cortezas en descomposición y otros hongos, lo que demuestra su alto potencial oportunista. DE. y su adaptabilidad a diversas condiciones ecológicas37,39. Se sabe también que Trichoderma interactúa con las plantas, produciendo cambios en su. CA. metabolismo y por lo tanto mejora el crecimiento y la resistencia al estrés biótico y. TE. abiótico38. Las especies de Trichoderma se usan comúnmente, como biocontroladores y en. IO. la industria alimentaria, para la producción comercial de enzimas líticas, mientras que en. BL. biorremediación su uso es limitado. A pesar de ello, diversos estudios han mostrado que Trichoderma tiene capacidad para biotransformar contaminantes ambientales 40, como. BI. diferentes tipos de hidrocarburos, incluso de algunos aromáticos en presencia de metales pesados como cadmio y niquel41,42,43.. Dentro del género Trichoderma, Trichoderma asperellum destaca por tener un gran rango de utilización de sustratos, una alta producción de metabolitos secundarios como. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. compuestos antimicrobianos44 y gran capacidad para el oportunismo ambiental 45. Por su parte, Trichoderma harzianum tiene la capacidad de degradar pesticidas organoclorados como DDT, dieldrin, endosulfan, pentacloronitrobenceno, y pentaclorofenol46. Además, ambas especies han sido reportadas junto con Trichoderma hamatum, Trichoderma. IC AS. koningii, Trichoderma viride y Trichoderma virens como degradadoras de hidrocarburos aromáticos policíclicos38.. G. Se han realizado diversas investigaciones sobre el empleo de glifosato y otros pesticidas. LO. como fuentes de sustrato de hongos, en una de ellas se determinó el uso de glifosato como. BI O. la única fuente de fósforo o carbono para seleccionar cepas fúngicas capaces de degradar este herbicida, los resultados demostraron que casi todas las cepas crecieron bien cuando. AS. glifosato fue usado como única fuente de fósforo, mientras que, si era utilizado como única. EN CI. fuente de carbono solo desarrollaban un número limitado de cepas, concretamente Rhizopus, Trichoderma, Mucor y Neosartorya. De las cepas que utilizaron el glifosato. CI. como única fuente de fósforo, las más efectivas fueron cuatro: Mucor III R, Fusarium II. detallados47.. DE. R9, Penicillium II R y Trichoderma II R1, las cuales fueron elegidas para estudios más. CA. En otra investigación se evaluó in vitro el uso potencial de la cepa FRP3 de Trichoderma. TE. viride en la biodegradación del herbicida glifosato basándose en el perfil de crecimiento. IO. del hongo y en la concentración total de fósforo en un medio de cultivo que contuvo. BL. glifosato como única fuente de fósforo. Los resultados determinaron que la cepa de Trichoderma viride FRP3 mostró un crecimiento apreciable en el medio de cultivo que. BI. contuvo glifosato como única fuente de fósforo, así como una disminución en la concentración total de fósforo, lo cual indicaba un proceso de utilización del glifosato por parte de la cepa48. Posteriormente, en otro estudio, se observó que dicha cepa tuvo. capacidad para biodegradar in situ glifosato de suelos contaminados en Indonesia49.. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Los resultados de una tercera investigación demostraron que Aspergillus spp., Penicillium spp., Trichoderma spp., Cladosporium spp. y Paecilomyces spp. se aislaron como grupos prevalentes en suelo agrícola expuesto a pesticidas. También demostró la capacidad de. glifosato en diferentes condiciones de potencial hídrico (MPa)50.. IC AS. cepas de Aspergillus flavus no toxigénicas para tolerar diferentes concentraciones de. En vista de que la información acerca del empleo de compuestos químicos como sustratos. G. microbianos es variada y debido a que no es posible proporcionar resultados generales. LO. sobre el efecto que puede producir un producto químico en microorganismos como los. BI O. hongos; surge la necesidad de establecer si un herbicida como el glifosato (de uso controversial y del cual se busca una efectiva biodegradación) repercute positivamente en. AS. el crecimiento de hongos antagonistas y biocontroladores como son los hongos del género. EN CI. Trichoderma.. Debido a que se conoce que este género de hongos puede utilizar un gran número de. CI. compuestos como sustratos, el presente trabajo de investigación busca conocer si. DE. Trichoderma viride puede emplear, para su crecimiento, las concentraciones de 1440, 4320 y 7200 ppm del herbicida glifosato y ser una opción como microorganismo biorremediador. BI. BL. IO. TE. CA. de este compuesto químico.. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MATERIAL Y MÉTODOS 1. MATERIAL DE ESTUDIO . Cultivo puro de Trichoderma viride proporcionado por el Laboratorio de Fitopatología del Departamento Académico de Microbiología y Parasitología,. . IC AS. Facultad de Ciencias Biológicas de la UNT (Anexo 01).. G. Herbicida “Rondopaz®”, cuyo principio activo es el glifosato (Anexo 02).. BI O. 2.1. Reactivación del cultivo de Trichoderma viride. LO. 2. PROCEDIMIENTO. A partir del cultivo de Trichoderma viride que fue proporcionado por el Laboratorio. AS. de Fitopatología del Departamento Académico de Microbiología y Parasitología de. EN CI. la Facultad de Ciencias Biológicas de la UNT; se sembró en tubos de ensayo conteniendo Agar Papa Sacarosa (APS) con antibiótico Doxiciclina (Anexo 03) y se incubó a temperatura ambiente (25°C aproximadamente) por 10 días.. DE. herbicida glifosato. CI. 2.2. Evaluación del crecimiento de Trichoderma viride empleando como sustrato el. CA. 2.2.1. Evaluación en medio sólido 2.2.1.1. Preparación del medio control positivo en Agar Mínimo de Sales (AMS). TE. suplementado con una fuente de carbono conocida. IO. Para la evaluación del control positivo se utilizó AMS (Anexo 04), que fue. BI. BL. suplementado con una fuente de carbono (glucosa), se preparó 80 mL en un matraz. El medio de cultivo se esterilizó en autoclave y se dejó enfriar (Anexo 05). Posteriormente, se sirvió en cinco placas Petri estériles.. 2.2.1.2. Preparación del medio control negativo en AMS Para la evaluación del control negativo se utilizó AMS, se preparó 80 mL en un matraz. El medio de cultivo se esterilizó en autoclave y se dejó enfriar. No se. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. agregó el glifosato, pues se utilizó como control negativo (Anexo 05). Posteriormente el medio se sirvió en cinco placas Petri estériles. 2.2.1.3. Preparación del AMS con glifosato Se preparó el AMS en tres matraces que contenían 80 mL del medio cada uno. El. IC AS. medio de cultivo se esterilizó en autoclave y se dejó enfriar hasta una temperatura aproximada de 45°C (Anexo 05). Luego se agregó el volumen calculado de. G. glifosato en cada matraz para obtener las concentraciones de 1440, 4320 y 7200. BI O. matraces se sirvió en cinco placas Petri estériles.. LO. ppm respectivamente (Anexo 06 y 07). El medio de cultivo de cada uno de los tres. 2.2.1.4. Siembra e incubación. AS. A partir del cultivo puro de Trichoderma viride se sembró por puntura en la parte. EN CI. central de las placas Petri que tenían AMS (tres tratamientos), así como también en las placas que se usaron para los controles (Anexo 08). Se incubaron a. CI. temperatura ambiente hasta que los hongos que crecieron en los controles positivos cubran toda la superficie de las placas.. DE. 2.2.1.5. Lectura. CA. Se realizaron mediciones del crecimiento micelial radial de Trichoderma viride a partir del momento en que se observó crecimiento hasta el quinto día (Anexo 09. TE. y 10). Las mediciones de cada repetición, se hicieron en diferentes direcciones y. BI. BL. IO. se obtuvo un radio promedio de crecimiento por cada día de las tres concentraciones del herbicida, así como del control (Anexo 11). Los resultados de crecimiento por día de Trichoderma viride se expresaron en centímetros y en porcentaje de crecimiento (%C). Se asumió que el crecimiento alcanzado por el control positivo fue del 100 % (Anexo 12), mientras que para los tratamientos el %C se obtuvo según la siguiente fórmula: %C =. Radio promedio de la colonia problema 𝑥 100 Radio promedio del control positivo 9. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.2.2. Evaluación en medio líquido 2.2.2.1. Preparación del medio control caldo mínimo de Sales (CMS) suplementado con una fuente de carbono conocida Para la evaluación del control (positivo) se preparó 700 mL de CMS suplementado. IC AS. con una fuente de carbono (glucosa) en dos matraces de 500 mL; luego se trasvasaron a dos frascos de vidrio transparente que contenían 350 mL de caldo. G. cada uno, se esterilizó en autoclave y se dejó enfriar.. LO. 2.2.2.2. Preparación de CMS con glifosato. BI O. Se preparó CMS y se colocó en seis frascos de vidrio transparentes conteniendo 350 mL de medio cada uno; estos fueron esterilizados y se los dejó enfriar. Se. AS. agregó a cada frasco el glifosato en cantidad suficiente para obtener las. EN CI. concentraciones de 1440, 4320 y 7200 ppm respectivamente (dos frascos para cada concentración) (Anexo 06).. CI. 2.2.2.3. Propagación de Trichoderma viride. A partir del cultivo puro de Trichoderma viride, se realizaron siembras en frascos. DE. planos que contenían Agar Papa Sacarosa (APS) con antibiótico (Doxiciclina). Se. CA. incubaron a una temperatura de 25°C durante 10 días (Anexo 13). 2.2.2.4. Estandarización de la suspensión de conidias de Trichoderma viride. TE. Luego de transcurrido el tiempo de incubación a los cultivos en frascos planos se. BI. BL. IO. les agregó Tween 80 al 0.1% y se agitó para obtener una suspensión de esporas que fueron recepcionadas en un matraz y aforadas a 200 mL con agua destilada estéril, a partir de esta suspensión se realizaron dos diluciones (al décimo) y de la segunda dilución se realizó el conteo de esporas utilizando una cámara de Neubauer (Anexo 14), posteriormente se estandarizó la suspensión a la concentración de 106 esporas por mL (Anexo 15).. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.2.2.5. Evaluación de crecimiento de Trichoderma viride en CMS 2.2.2.5.1. Construcción del sistema aireado de agitación El sistema de aireación utilizó una bomba de pecera que suministró aire, el cual pasó por un proceso de esterilización con sulfato de cobre al 5% y posteriormente. IC AS. con cloruro de sodio al 20%. La bomba de aireación estuvo conectada a una bureta graduada de equipo de venoclisis de 100 mL, que fue perforada por los lados. G. laterales en línea recta y a las cuales se unieron mangueras de plástico con. LO. reguladores de aire (Anexo 16). Las perforaciones hechas en la bureta se sellaron. BI O. para evitar las fugas de aire. A partir de la bureta del equipo de venoclisis se distribuyó el aire a los frascos de vidrio de 500 mL de capacidad cada uno en los. AS. cuales estaban los controles y los tratamientos. En los tratamientos se agregó a los. EN CI. frascos el CMS más el herbicida con las concentraciones a evaluar. 2.2.2.5.2. Producción de biomasa. Para la producción de biomasa se agregó 6,83 mL de la suspensión estándar de. CI. Trichoderma viride para obtener la concentración final de 106 esporas por mL. DE. (Anexo 15), en cada uno de los frascos con los medios que se prepararon. CA. anteriormente. Se pusieron en funcionamiento a temperatura ambiente (25°C aproximadamente) y aireación constante. La cantidad de aire se controló mediante. TE. reguladores para evitar romper el micelio del hongo en su crecimiento. La. IO. incubación se realizó a temperatura ambiente durante diez días (Anexo 17).. BI. BL. 2.2.2.5.3. Filtración y secado Terminado el tiempo de incubación se procedió a filtrar el contenido de cada uno de los frascos (biomasa micelial) (Anexo 18), para ello se utilizó papel filtro previamente pesado; luego, cada papel filtro con el micelio fue colocado en placas Petri (previamente pesadas) y éstas se llevaron a la estufa donde se dejaron secar a 60°C durante 24 horas (Anexo 19).. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.2.2.5.4. Obtención de resultados Después de las 24 horas en la estufa se pesó en una balanza analítica cada placa Petri con su respectivo contenido y se descontó el peso de la placa y el papel filtro para obtener el peso seco del micelio en el control y en las concentraciones a. IC AS. evaluar (Anexo 20 y 21). El resultado fue expresado en gramos y en porcentaje y se tomó en cuenta que el peso seco del grupo control era 100% (Anexo 22).. G. 2.2.2.6. Evaluación de la degradación de glifosato por cromatografía en capa fina. LO. 2.2.2.6.1. Preparación de la muestra. BI O. Se realizó tres corridos cromatográficos en placas de sílica-gel, uno por cada concentración; se colocó una gota de glifosato de cada una de las concentraciones. AS. 1440, 4320 y 7200 ppm como patrón, y en línea recta tres gotas de los filtrados de. EN CI. cada una de las concentraciones, distantes entre sí. Las muestras se colocaron a una distancia de 1 cm de la base de la placa; posteriormente éstas se colocaron en. (Anexo 23).. CI. un frasco con una solución eluyente y se dejó que este ascienda por capilaridad. DE. 2.2.2.6.2. Lectura. CA. Luego de transcurrido el tiempo dentro del frasco la placa pasó por un proceso de revelado con ninhidrina, luego se procedió a realizar la lectura de la placa de sílica-. TE. gel en base al cálculo de la relación entre las distancias recorridas por el soluto y. IO. por el eluyente desde el origen de la placa (Rf) (Anexo 24).. BI. BL. 2.2.2.7. Análisis de datos Para determinar la existencia de diferencia estadística en el crecimiento de Trichoderma viride, a las diferentes concentraciones de glifosato, se analizó el crecimiento lineal, así como el peso seco (biomasa) del hongo. Se procesaron los datos en base a la prueba de Análisis de Varianza (ANAVA) y Post-ANAVA, según el programa estadístico SPSS v.22.0 (Anexo 25 y 26).. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS. IC AS. En la Fig. 01, se observa que Trichoderma viride presentó su mayor crecimiento radial a la concentración de 1440 ppm de glifosato, alcanzando un 68.87 % con respecto al control. BI O. LO. G. como se muestra en la Fig. 02.. En la Fig. 03, se observa que el porcentaje de peso seco (biomasa) más elevado de. CI. EN CI. crecimiento respecto al control.. AS. Trichoderma viride se obtuvo a la concentración de 7200 ppm, con un 37.551 % de. DE. En la Fig. 04, se visualiza en la placa de sílica gel, que la presencia de las bandas de las muestras del filtrado es diferente a la de la muestra de glifosato patrón, lo que evidencia. CA. que en los filtrados hay metabolitos diferentes al glifosato que son producto de su. BI. BL. IO. TE. degradación.. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) CI. EN CI. AS. BI O. LO. 0 ppm*. 0 ppm. G. IC AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 4320 ppm. BI. BL. IO. TE. CA. DE. 1440 ppm. 7200 ppm. Fig. 01. Crecimiento radial de Trichoderma viride en agar mínimo de sales (AMS) con diferentes concentraciones de glifosato. NOTA: 0ppm (control positivo); 0ppm* (control negativo). 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC AS. 100 %. Crecimiento radial (%) de Trichoderma viride. 100% 90% 80% 70% 53.36 %. 60%. LO. G. 68.87 %. BI O. 45.34 %. 50%. a. 40%. a. 0%. 1440 ppm. 4320 ppm. 0% 7200 ppm. CONTROL NEGATIVO. CI. CONTROL POSITIVO. EN CI. 20% 10%. a. a. AS. 30%. DE. Concentraciones de glifosato. CA. Fig. 02. Porcentaje de crecimiento radial de Trichoderma viride a las concentraciones de. TE. 0, 1440, 4320 y 7200 ppm de glifosato, evaluados en medio sólido (Agar mínimo de sales). BL. IO. a temperatura ambiente durante cinco días de incubación.. (a) = p < 0.05; existe diferencia significativa. BI. (b) = p > 0.05; no existe diferencia significativa. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC AS. 100 %. 90. G. 80. LO. 70. a. BI O. 60 50. 37.551 %. 40 30. 15.510 %. 20. AS. 29.388 %. b. a. 10 0. CONTROL POSITIVO. EN CI. Peso seco (%) de Trichoderma viride. 100. b a. 0%. a. 1440 ppm. 4320 ppm. 7200 ppm. CONTROL NEGATIVO. DE. CI. Concentraciones de glifosato. Fig. 03. Porcentaje de peso seco (biomasa) de Trichoderma viride a las concentraciones de. CA. 0, 1440, 4320 y 7200 ppm de glifosato, evaluados en medio líquido (Caldo mínimo de. TE. sales) a temperatura ambiente durante diez días de incubación.. IO. (a) = p < 0.05; existe diferencia significativa. BI. BL. (b) = p > 0.05; no existe diferencia significativa. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) IO. TE. CA. DE. CI. EN CI. AS. BI O. LO. G. IC AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BL. Fig. 04. Corrido cromatográfico en placa de sílica gel de las muestras evaluadas (Glifosato. BI. patrón a las concentraciones de 1440, 4320 y 7200 ppm y sus respectivos filtrados).. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DISCUSIÓN En esta investigación se empleó como sustrato glifosato, un herbicida no selectivo de amplio espectro, utilizado para erradicar plantas no deseadas como pastos anuales y perennes, y cultivos ilícitos en áreas rurales51. El uso masivo de este compuesto puede. IC AS. producir efectos tóxicos tanto en los ecosistemas como en la salud humana; sin embargo, dichos efectos están todavía en discusión51, 52, 53. Debido a las preocupaciones ambientales. G. asociadas a la acumulación de pesticidas, es que se están desarrollando métodos seguros,. LO. convenientes y económicamente viables para su remediación o degradación 54.. BI O. En la biodegradación de compuestos químicos las bacterias y los hongos son los microorganismos más empleados, sin embargo, los hongos filamentosos ofrecen ventajas. AS. sobre las bacterias en la diversidad de compuestos que pueden oxidar 54, en el caso de. EN CI. Trichoderma se sabe que asimila diferentes fuentes de nutrientes, siendo capaz de degradar sustratos muy complejos y emplearlos para su crecimiento debido al gran sistema. CI. enzimático que posee38. En este estudio, el herbicida glifosato ha sido asimilado como 55. , que. DE. fuente de materia orgánica, principalmente de carbono, fosforo y nitrogeno 47,. CA. favoreció el crecimiento de Trichoderma viride. De lo anteriormente mencionado se pudo demostrar que Trichoderma viride crece en medio. TE. mínimo de Sales usando glifosato como fuente de energía, esto indica que el hongo no. IO. muestra sensibilidad al herbicida cuando interactúa con él en un medio de cultivo, por el. BL. contrario, Trichoderma viride se desarrolla favorablemente y resiste la presencia de. BI. glifosato al igual que otras especies de Trichoderma y otros hongos como Fusarium, Aspergillus y Penicillium quienes crecen predominantemente en suelos tratados con este herbicida56. Al evaluar el crecimiento de Trichoderma viride en un medio como el mínimo de sales, donde el glifosato fue la única fuente de carbono y la principal fuente de nitrógeno y 18. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. fósforo, se observó que en todas las concentraciones evaluadas el hongo presentó crecimiento. En medio sólido (AMS), este crecimiento varió según la concentración del herbicida (Figura 01). Al comparar los resultados del porcentaje de crecimiento radial (Figura 02), se observó que en la concentración de 1440 ppm el crecimiento presentó un. IC AS. 68.87% respecto al control, mientras que en las concentraciones de 4320 y 7200 ppm los porcentajes de crecimiento fueron de 53.36 y 45.34% respectivamente; esto nos muestra. G. que el crecimiento radial de Trichoderma viride fue inversamente proporcional a la. LO. concentración del glifosato. Al realizar la prueba estadística (ANOVA) se encontró. BI O. diferencia significativa (p<0.05) del crecimiento radial del hongo en los tratamientos evaluados, posteriormente luego del análisis Post-ANOVA con las pruebas de t-Student y. AS. Duncan se determinó que la diferencia significativa existente era entre todas las. EN CI. concentraciones de glifosato, incluido el grupo control (Anexo 24); este análisis confirmó que las concentraciones de glifosato afectaron el crecimiento del hongo, lo que significa. CI. que mayores concentraciones de glifosato disminuye el crecimiento radial.. DE. En las condiciones en que este estudio fue realizado, se encontró que el glifosato tiene efecto sobre el crecimiento radial de Trichoderma viride en condiciones de laboratorio,. CA. estos resultados concuerdan con los obtenidos por Wardle & Parkinson, quienes. TE. encontraron que el desarrollo de Trichoderma harzianum, aislado de partículas de suelo. IO. mineral, fue estimulado por mayores concentraciones de glifosato57. A su vez, Meriles y. BL. col. encontraron que el área de la colonia de Trichoderma viride se vio afectada a mayores. BI. concentraciones de glifosato, mostrando diferencia significativa con el control 36. El otro parámetro fundamental en la caracterización del crecimiento microbiano y cuya medición es esencial para estudios cinéticos en fermentación 58 es el peso seco. Los resultados obtenidos en medio líquido (CMS) determinaron que el porcentaje de peso seco en la concentración de 1440 ppm fue de 15.510%, mientras que las concentraciones de. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 4320 y 7200 ppm los porcentajes fueron de 29.388 y 37.551% respectivamente, con relación al control (Figura 03); esto nos muestra que el peso seco de Trichoderma viride fue directamente proporcional a la concentración del glifosato. Al realizar el análisis PostANOVA con las pruebas de t-Student y Duncan se encontró que las concentraciones de. IC AS. 4320 y 7200 ppm de glifosato fueron estadísticamente iguales presentando un p>0.05 (Anexo 26); lo que significa que ambas concentraciones tienen el mismo efecto en la. G. producción de peso seco o biomasa; esto puede deberse a que la degradación de glifosato. LO. no se acelera cuando la concentración aumenta como lo afirman Fu y et. al.33.. BI O. El efecto de glifosato en los resultados de peso seco obtenidos fue similar al de Arfarita 48,. AS. quien obtuvo un bajo porcentaje de peso seco cuando usó glifosato (10mM) como única fuente de fosforo de Trichoderma viride luego de 24 días de evaluación. Del mismo modo. EN CI. Klimek et. al. demostraron que cepas de Penicillium chrysogenum pudieron crecer en medio mínimo de sales con glifosato como única fuente de nitrógeno y al menos a dosis. CI. bajas el resultado del peso seco fue directamente proporcional con la cantidad de herbicida. DE. disponible59. Afify et. al., por su parte, mostraron que el peso seco de Trichoderma harzianum y Trichoderma viride aumenta proporcionalmente con las concentraciones del. CA. pesticida oxamyl, hasta una determinada concentración, pues demostró que si se sigue. TE. aumentando la concentración del químico el peso seco empezaba a disminuir 60. Por ello,. IO. en este estudio no se puede asegurar que el peso seco siga aumentando a una concentración. BL. mayor a los 7200 ppm de glifosato.. BI. Los resultados del crecimiento en medio sólido como en medio líquido, evidencian que Trichoderma viride degradó el herbicida glifosato, utilizándolo como sustrato para obtener. energía y llevar a cabo su crecimiento; este proceso de utilización del glifosato indica que el hongo posee mecanismos para la degradación de este herbicida48, sin embargo, el proceso global de degradación de glifosato en hongos no se ha investigado en detalle,. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. debido a que los sistemas enzimáticos de biodegradación de glifosato por hongos todavía requieren identificación, a pesar de ello se plantea que estos mecanismos catabólicos pueden ser los mismos que los que se han estudiado principalmente en bacterias33, 35, 61.. IC AS. Se conocen algunas vías principales de biodegradación del glifosato, algunos microorganismos del suelo pueden metabolizar el herbicida por la vía del ácido aminometilfosfónico (AMPA) produciendo la enzima glifosato oxidoreductasa (GOX), la. LO. G. cual escinde el enlace C-N de la molécula degradándolo en AMPA y glioxilato; el AMPA producido es catalizado por una amino transferasa que lo convierte en fosfoformaldehído,. BI O. que finalmente es degradado hasta formaldehido por un metabolismo posterior. Otra ruta. AS. metabólica conocida de degradación es la vía de la C-P liasa, en esta vía la enzima C-P liasa II escinde el enlace C-P del glifosato para formar sarcosina y fosfato, la sarcosina es. EN CI. oxidada en formaldehido y glicina por una sarcosina-oxidasa, finalmente el formaldehido es oxidado en dióxido de carbono y agua33, 62 (Anexo27).. CI. Así mismo, un mecanismo diferente de degradación fue encontrado en el estudio realizado. DE. por Fu et. al.33, se encontró que la cepa fúngica Aspergilllus oryzae A-F02 tiene una vía de. CA. degradación que puede inferirse como la vía del AMPA, este hongo escindió el glifosato en AMPA mediante la GOX, sin embargo, a diferencia de las rutas explicadas. TE. anteriormente el AMPA producido fue degradado por la C-P liasa a metilamina y fósforo. IO. inorgánico63. Luego, la metilamina fue oxidada adicionalmente a formaldehído a través de. BL. la acción de la metilamina deshidrogenasa; y el formaldehído también puede ser asimilado. BI. a través del ciclo de monofosfato de ribulosa 33, 64.. De lo anteriormente mencionado, se puede afirmar que la biodegradación del glifosato implica una serie de procesos controlados y ordenados que involucran diversas enzimas, de ellas la primera reportada en la degradación del glifosato fue la GOX 33, haciendo que la vía del AMPA al parecer sea la ruta predominante para la degradación del glifosato en 21. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. muchos microorganismos. Así mismo, se ha demostrado recientemente que en bacterias del genero Bacillus una glicina oxidasa (GO) convierte el glifosato en AMPA y glioxilato, pero con un mecanismo de reacción diferente al de la GOX62, 65.. IC AS. A partir de esta investigación se puede decir que el glifosato es degradado a otros metabolitos por parte de Trichoderma viride, esto se evidenció al realizar la prueba analítica de cromatografía en capa fina (CCF), pues se observó bandas diferentes a las de. LO. G. las muestras patrón por parte de las muestras de los filtrados, lo cual indica la presencia de. BI O. compuestos diferentes al herbicida (Figura 04).. Las muestras patrón que contenían glifosato mostraron un bajo valor de Rf en el corrido. AS. cromatográfico, esto puede explicarse por la alta polaridad del glifosato, se conoce que los. EN CI. compuestos de polaridad alta quedan más retenidos con relación a los de polaridad baja o no polares puesto que se adsorben más firmemente, es decir, tienen mayor afinidad por los. CI. centros activos de la fase estacionaria, en este caso la silica gel 66.. DE. El valor del Rf obtenido (0,20) en la muestra patrón de glifosato (Anexo 24) es similar al que presentó Sprankle et. al. en 1975 cuando realizó también cromatografía en capa fina. CA. de glifosato en diferentes tipos de suelo, el estudio mostró que los valores de Rf para. TE. glifosato se encontraban entre 0,14 y 0,2067. Por su parte, Krzysko-Lupicka y Sudol encontraron valores de Rf de entre 0,21 y 0,35 en fluidos posteriores de hongos autóctonos. IO. del suelo cultivados en presencia de glifosato; estos fluidos presentaron grupos amino libres. BL. como producto de la degradación del glifosato68. El valor de Rf= 0,23 que se obtuvo en las. BI. muestras del filtrado de Trichoderma viride en CMS está dentro del rango de los obtenidos en la investigación de Krzysko-Lupicka y Sudol, sin embargo, el Rf obtenido en las muestras del filtrado no es suficiente para afirmar que los metabolitos presentes sean AMPA o glicina. La presencia de grupos amino libres en el o los metabolitos encontrados. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. en el filtrado de esta investigación se pudo comprobar por la reacción coloreada que dieron las muestras con la ninhidrina. En este estudio se usó la ninhidrina como revelador del corrido cromatográfico para. IC AS. determinar la presencia de glifosato o sus derivados. La ninhidrina es un reactivo de detección específico para buscar compuestos particulares como los aminoácidos 69, el mecanismo de la reacción de este compuesto con los grupos amino produce un cromóforo. LO. G. de color, llamado púrpura de Ruhemann (RP)70, aunque la producción de RP se forma generalmente con grupos amino primarios, se conocen varios casos en los que grupos. BI O. amino secundarios (como la N- metil glicina o sarcosina) también dan lugar a la formación. AS. del cromóforo71. Por ello, debido a que la muestra patrón contuvo glifosato y las muestras de los filtrados tuvieron metabolitos con presencia de grupos amino, es que el cromóforo. EN CI. purpura estuvo presente en todas las bandas de las muestras; este cromóforo formado es altamente estable a temperatura ambiente 70.. CI. Si bien es cierto las pruebas de degradación de glifosato tanto en medio sólido como en. DE. medio líquido se realizaron en condiciones controladas, sería necesario evaluar la respuesta. CA. de Trichoderma viride en campo, los resultados obtenidos constituyen un aporte para el posible empleo de Trichoderma viride en suelos de cultivo donde se aplica el herbicida,. TE. una biodegradación eficaz por parte del hongo en estos suelos contaminados con glifosato. IO. añadiría una característica más a este hongo, pues además de su capacidad antagónica sobre. BL. hongos fitopatógenos, y su capacidad de estimular el crecimiento radicular de vegetales,. BI. sería un microorganismo potencial ante los ojos de los productores agrícolas; ya que no solo permitiría la obtención de productos vegetales de alta calidad sino también ayudaría a disminuir los residuos tóxicos presentes en el ambiente.. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONCLUSIÓN.  Al incrementarse la concentración de glifosato se incrementa el crecimiento de. IC AS. Trichoderma viride (peso seco), no existiendo diferencia significativa en el crecimiento. G. a las concentraciones de 4320 y 7200 ppm de glifosato en condiciones de laboratorio.. LO.  Trichoderma viride es capaz de degradar al glifosato, obteniéndose como productos. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI. EN CI. AS. BI O. metabólicos compuestos aminados en condiciones de laboratorio.. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC AS. RECOMENDACIONES.  Se recomienda evaluar el crecimiento de Trichoderma sp. en medio mínimo de sales,. G. reemplazando (por separado) el K2HPO4 y el NaNO3 por glifosato, de manera que el. BI O. LO. herbicida pueda ser usado como la única fuente de fósforo y Nitrógeno..  Debido a que la prueba de cromatografía en capa fina no permitió determinar con. AS. exactitud la cantidad exacta que se degradó de glifosato se recomienda realizar una. EN CI. prueba de Cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) u otra prueba analítica cuantitativa.. CI.  Determinar con exactitud los metabolitos que fueron producidos en los filtrados del. DE. CMS utilizados para la producción de peso seco de Trichoderma viride.. CA.  Evaluar la capacidad de degradación de glifosato por parte de Trichoderma viride en. BI. BL. IO. TE. suelos contaminados con el herbicida como aplicación práctica.. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. IC AS. 1. Fang Y, Ramasamy RP. Current and Prospective Methods for Plant Disease Detection. Biosensors (Basel). 2015;5(3):537-61.. G. 2. Pimentel D, Zuniga R, Morrison D. Update on the environmental and economic costs. LO. associated with alien-invasive species in the United States. Ecol Econ. 2005; 52(3):273 –. BI O. 288. 3. Abouziena HF & Haggag WM. Weed Control in Clean Agriculture: A Review. Planta. AS. Daninha. 2016; 34(2): 377–392.. EN CI. 4. Savary S, Ficke A, Aubertot JN and Hollier C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Sec. 2012, 4(4):. CI. 519-537.. 5. Medrano C. Biología y Combate de Malezas. Universidad del Zulia. Maracaibo,. DE. Venezuela: EDILUZ; 1999, 282 p.. CA. 6. Oliveros M, Millán A. y Villaroel D. Importancia del Control de Malezas en las Sabanas Orientales. Revista Fonaiap Divulga. 1998, 60: 02 – 05.. TE. 7. Lárez Rivas A. Claves para identificar malezas asociadas con diversos cultivos en el Estado. IO. Monagas, Venezuela I. Monocotiledóneas. Revista UDO Agrícola. 2007; 7 (1): 79-90.. BL. 8. Ramesh K, Matloob A, Aslam F, Florentine SK, Chauhan BS. Weeds in a Changing. BI. Climate: Vulnerabilities, Consequences, and Implications for Future Weed Management. Front Plant Sci. 2017; 8: 95.. 9. Patterson DT. Weeds in a changing climate. Weed Sci. 1995; 43: 685–701. 10. Mazparrote S. y Delascio F. Botánica. Caracas, Venezuela. Editorial Biosfera C. A., 1998. 559 p.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..