EFECTO DEL PRE TRATAMIENTO ÁCIDO Y POR CONGELACIÓN DE FIBRA DE CORONTA DE MAÍZ (Zea mays L ) EN LA HIDRÓLISIS CON CELULASA (E C: 3 2 1 4)

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RI A. FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS. S. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE. AG RO. PE CU A. INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL. TESIS. DE. EFECTO DEL PRE-TRATAMIENTO ÁCIDO Y POR CONGELACIÓN DE FIBRA DE CORONTA DE MAÍZ (Zea mays L.) EN LA HIDRÓLISIS CON CELULASA (E.C: 3.2.1.4). Br. Carlos Eduardo Echeverria Perez. TE. AUTORES:. CA. (EFFECT OF PRETREATMENT ACID AND FREEZE OF CORNCOB FIBER (Zea mays L.) IN HYDROLYSIS WITH CELLULOSE (E.C: 3.2.1.4)). Br. Ghenghis Dwight Bazán Aliaga Dr. Guillermo Alberto Linares Lujan. CO-ASESOR:. M.Sc. Jesús Alexander Sánchez González. BI. BL. IO. ASESOR:. TRUJILLO – PERÚ. 2017 -i-. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RI A. FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS. S. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. PE CU A. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL. EFECTO DEL PRE-TRATAMIENTO ÁCIDO Y POR CONGELACIÓN DE FIBRA DE CORONTA DE MAÍZ (Zea mays L.) EN LA HIDRÓLISIS CON CELULASA (E.C: 3.2.1.4). AG RO. (EFFECT OF PRETREATMENT ACID AND FREEZE OF CORNCOB FIBER (Zea mays L.) IN HYDROLYSIS WITH CELLULOSE (E.C: 3.2.1.4)) TESIS PARA OBTENER EL TÍTULO DE:. DE. INGENIERO AGROINDUSTRIAL. PRESENTADO POR:. CA. Br. Carlos Eduardo Echeverria Perez Br. Ghenghis Dwight Bazán Aliaga. TE. SUSTENTADO Y APROBADO ANTE EL HONORABLE JURADO:. IO. PRESIDENTE. : M. Sc. Leslie Lescano Bocanegra. : M. Sc. Julio Rojas Naccha. MIEMBRO. : Dr. Guillermo Linares Lujan. BI. BL. SECRETARIO. (ASESOR). -iiEsta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. S. DEDICATORIA. RI A. A Dios, mi compañero incondicional, por estar presente en cada decisión que tomo, por ser camino y guía de mi futuro, un futuro cuyas objetivos y metas se están. PE CU A. logrando satisfactoriamente.. A mi familia, en especial a mis padres Juan Echeverria Zegarra y Luciana Perez Reyes, por su comprensión y apoyo, a lo largo de mi crecimiento personal y profesional, por los buenos valores sembrados en mí, por ser la razón de mi vida, la fuente de fuerza y motivación que me ayuda a seguir adelante.. AG RO. A mis hermanas Roxana y Gabriela, por brindarme confianza y porque mi voluntad de querer ser siempre su orgullo, me ayudaron a seguir adelante.. A mis cuñados José y Olivar, por su amistad, compañía, consejos y ejemplo de trabajo y dedicación en cada cosa que uno tiene que hacer para lograr cumplir sus. DE. objetivos.. A mis amigos los “Chacoteros”: Leo, Kevin, Rodrigo, Diego, Damper y Ghenghis (mi. CA. hermano), a quienes conocí en esta vida universitaria, porque a pesar de todas las bromas y discusiones nos hemos apoyado unos a otros, logrando superar cada. TE. obstáculo en nuestra vida personal y profesional.. BI. BL. IO. Carlos Eduardo Echeverria Perez. -iiiEsta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. S. A mis padres Sigisfredo y Elenice, por su respaldo constante, por confiar en mí, por. RI A. enseñarme a crecer y a pesar que no siempre pudieron estar a mi lado, me. enseñaron a no rendirme, que si caigo debo levantarme y volverlo a intentar, todos. PE CU A. sus consejos, me han servido para hoy poder estar aquí.. A mis hermanos menores Julio y Sigisfredo, por ser el motor de mis esfuerzos, el cariño que le tengo es inmensurable, con ustedes he logrado sentir el amor que tiene un padre, todas las metas que alcance es por ustedes.. A toda mi familia, especialmente a mi tía Elena y mis primos Edith, Dennis, Cristhian. AG RO. y Thalia; quienes estuvieron a mi lado durante toda esta etapa universitaria. Y por último a todos mis amigos “los Chacoteros” especialmente a Carlos mi hermano, con quienes formamos más que un grupo, formamos un equipo una familia, apoyándonos para poder sobrellevar estos 5 años de carrera universitaria.. BI. BL. IO. TE. CA. DE. Ghenghis Dwight Bazán Aliaga. -ivEsta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTOS. RI A. S. A Dios por darnos la fuerza y salud para poder lograr uno de nuestros objetivos en nuestra vida.. PE CU A. Al Dr. Guillermo Alberto Linares Luján y al M.Sc. Jesús Alexander Sánchez González, asesor y co-asesor de nuestra investigación, por habernos permitido acudir a su capacidad científica y guiarnos durante todo este proceso, obteniendo con éxito los resultados esperados. Al Ingeniero Jesús Mora docente de Química general por su tiempo, disponibilidad y paciencia para ayudarnos a despejar dudas formadas durante esta investigación y a lo largo de nuestros estudios universitarios.. AG RO. Al M.Sc. Segundo Manual Miranda Leyva Docente de ciencias biomédicas de la Facultad de Farmacia y Bioquímica por habernos apoyado en gran parte del desarrollo experimental de esta investigación. A la Universidad Nacional de Trujillo, por habernos dado la oportunidad de formar parte de esta gran casa de estudios, y a todos los docentes que nos brindaron sus conocimientos y apoyo a lo largo de nuestra formación académica.. CA. DE. Al Programa Nacional de Becas- Beca 18, por apoyarme económicamente en mi vida universitaria y permitirme lograr cumplir uno de mis anhelados sueños (Carlos).. TE. Carlos Eduardo Echeverria Perez. BI. BL. IO. Ghenghis Dwight Bazán Aliaga. -vEsta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE. S. RESUMEN ........................................................................................................................................ vii. RI A. ABSTRACT ..................................................................................................................................... viii 1.. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 1. 2.. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................................. 4 2.2.. Pre-tratamientos ............................................................................................................... 5. PE CU A. Materia prima .................................................................................................................... 4. 2.2.1.. Físico .......................................................................................................................... 5. 2.2.2.. Químico ...................................................................................................................... 5. 2.2.3.. Físico- Químico .......................................................... ¡Error! Marcador no definido.. Hidrólisis enzimática ........................................................................................................ 6. 2.4.. Métodos analíticos............................................................................................................ 6. AG RO. 2.3.. 2.4.1.. Análisis fisicoquímicos de la materia prima y fibra homogénea........................ 6. 2.4.2.. Análisis de microscopía óptica ............................................................................... 6. 2.4.3.. Determinación de compuestos lignocelulósicos .................................................. 7. 2.4.4.. Determinación de azúcares reductores totales ................................................... 7. Conversión de celulosa a glucosa ................................................................................. 7. 2.6.. Análisis estadístico ........................................................................................................... 8. DE. 2.5.. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................... 8 Análisis fisicoquímicos de la materia prima y fibra homogénea ............................... 8. 3.2.. Componentes lignocelulósicos después de los pre-tratamientos ............................. 9. 3.3.. Análisis de microscopía óptica ..................................................................................... 11. 3.4.. Hidrólisis enzimática ...................................................................................................... 15. 3.5.. Conversión de celulosa a glucosa ............................................................................... 20. CA. 3.1.. TE. 3.. 2.1.. CONCLUSIONES ................................................................................................................... 22. 5.. RECOMENDACIONES.......................................................................................................... 22 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................... 23. BL. 6.. IO. 4.. ANEXOS .................................................................................................................................. 30. BI. 7.. -viEsta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN. S. La coronta de maíz tiene elevado porcentaje de celulosa (40.95 ± 0.38%) y. RI A. hemicelulosa (38.94 ± 1.72%) y bajo contenido de lignina (16.54 ± 0.38%) teniendo una gran potencialidad de bioconversión a bioetanol. El objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto del pre-tratamiento ácido, congelación y la. PE CU A. combinación de estos en fibra de coronta de maíz en la hidrolisis con celulasa, en los cambios de su macroestructura y compuestos lignocelulósicos después de los pre-tratamientos. La fibra de coronta de maíz (FCH) fue sometida a pre-tratamiento por congelación a -20°C por 12 h (FCHC); con H2SO4 0.25M a 121°C por 20 minutos (FCHA) y también por combinación de ambos pre-tratamientos (FCHAC). A las muestras pre-tratadas se le realizó una hidrólisis enzimática con 150 Ucelulasa/gsustrato. AG RO. en 10 ml de acetato a 100 rpm durante 72 h, a 37 °C y pH 5.5. Los resultados mostraron que luego de los pre-tratamientos, la FCHAC contuvo mayor celulosa (64.12 ± 1.03%), menor hemicelulosa (10.16 ± 1.42%) y aumento de lignina (19.76 ± 0.42%). El contenido de glucosa del hidrolizado final de las muestras con y sin pre-tratamiento: FCH, FCHC, FCHA y FCHAC fueron 33,17 ± 2,03 g/L, 29,50 ± 1,23 g/L, 21,92 ± 1,23 g/L y 40.90 ± 2,11 g/L respectivamente. El análisis de microscopía. DE. óptica de la FCHAC a comparación de la FCH y de las otras muestras se observó más particionada, y menos aglomerada notándose una estructura en forma de red cristalina. La mayor concentración de glucosa fue obtenida por FCHAC, estos. CA. valores muestran que el pre-tratamiento combinado no solo aumenta la eficiencia de la hidrólisis enzimática, sino también. que es un método amigable con el. TE. ambiente y económicamente viable para la producción de glucosa y lignina, que podrían ser aprovechados para la conversión de productos de alto valor.. IO. Palabras Claves: Fibra de coronta de maíz; Congelación; Pre-tratamiento ácido;. BI. BL. Celulasa; Hidrólisis enzimática.. -viiEsta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT. S. Corncob has a high percentage of cellulose (40.95 ± 0.38%) and hemicellulose. RI A. (38.94 ± 1.72%) and low lignin content (16.54 ± 0.38%) which has a great potential of bioconversion to bioethanol. The objective of this research was to evaluate the effect of pre-treatment, freezing and the combination of these in corn corona fiber in. PE CU A. cellulase hydrolysis, changes in macrostructure and lignocellulosic compounds after pre-treatments. Corncob fiber (FCH) was pre-treated by freezing -20 ° C for 12 h (FCHC); With 0.25M H2SO4 at 121 ° C for 20 minutes (FCHA) and also by the combination of both pre-treatments (FCHAC). To the pre-treated samples, enzymatic hydrolysis with 150 Ucellulase / gsubstrate in 10 ml of acetate was performed at 100 rpm for 72 h, at 37 ° C and pH 5.5. The results showed that after the pre-. AG RO. treatments, the FCHAC contained higher cellulose (64.12 ± 1.03%), lower hemicellulose (10.16 ± 1.42%) and increased lignin (19.76 ± 0.42%). The glucose content of the final hydrolyzate of the samples with and without pretreatment: FCH, FCHC, FCHA and FCHAC were 33.17 ± 2.03 g / L, 29.50 ± 1.23 g / L, 21.92 ± 1.23 g / L and 40.90 ± 2.11 g / L respectively. The analysis of the optical microscopy of the FCHAC a comparison of the FCH and the other samples was observed more. DE. partition, and less added a structure in the form of red crystal. The higher concentration of glucose was obtained by FCHAC, these values show that the combined pre-treatment not only increases the efficiency of the enzyme, but also. CA. that it is an environmentally friendly and economically viable method for the production of glucose and lignin, which Was approved for the conversion of high. TE. value products.. Key words: Corncob fiber; Freezing; Acid pretreatment; Cellulase; Enzymatic. BI. BL. IO. hydrolysis.. -viiiEsta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1. INTRODUCCIÓN. S. Los recientes acontecimientos económicos en muchos países de todo el mundo han. RI A. aumentado la necesidad de fuentes alternativas de energía, debido a los problemas. generados por los combustibles fósiles: limitaciones de reservas, aumento y fluctuaciones en el precio, emisiones de gases de efecto de invernadero y. PE CU A. calentamiento global (Mood et al., 2013). Todas estas debilidades han reforzado el interés por alternativas renovables, sostenibles y económicamente viables de energías verdes o biocombustibles tales como el bioetanol.. La producción de bioetanol de primera generación, el almidón y azúcar derivados de maíz y caña de azúcar respectivamente que se emplean como materia prima,. AG RO. son caros, en cambio la utilización de materiales de segunda generación, materiales lignocelulósicos, son baratos, abundantes, renovables y no afectan negativamente a la cadena alimentaria humana mediante la eliminación de los alimentos en favor de la producción de bioetanol (Alvira et al., 2010; Kootstra et al., 2009; Almarsdottir et al., 2012). Los materiales lignocelulósicos se componen de celulosa, hemicelulosas y lignina en una estructura enredada, generando una baja. DE. accesibilidad de las enzimas debido a la rígida asociación de la celulosa con la lignina (Gupta et al., 2010; Mood et al., 2013). Por esta razón los materiales lignocelulósicos requieren de un pre-tratamiento (mecánico, químico, biológico, etc.). CA. para romper la barrera de la lignina y así recuperar la celulosa, que posteriormente puede ser sometida a la hidrólisis enzimática para convertirla en azúcares. TE. fermentables (Xiao et al., 2012; Sindhu et al., 2010; Anwar et al., 2014). Las corontas de maíz han ganado mucha atención como materia prima de alimentación viable para la producción de azúcares reductores, y algunos esfuerzos se realizan en el. IO. tratamiento previo de las corontas de maíz (Potumarthi et al., 2012; Potumarthi et. BL. al., 2013). El maíz en términos de producción es el principal cultivo de cereales en todo el mundo, y se utiliza para la producción de una gran variedad de alimentos, piensos, biocombustibles y otros usos industriales (Serna-Saldívar, 2016). Según el. BI. departamento de agricultura de Estados Unidos (USDA) proyecta la producción de maíz para el año 2016/2017 en 1025.69 millones de toneladas métricas, lo que -1-. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. contribuye aproximadamente a 307.7 millones de toneladas de coronta de maíz. S. (Potumarthi et al., 2012). Por esta razón las corontas de maíz tienen un potencial. RI A. para la producción de biocombustibles, especialmente sus composiciones químicas que hacen de las corontas de maíz una de las mejores materias primas para la. producción de una variedad de compuestos, tales como el bioetanol (Potumarthi et Estas corontas están compuestas por celulosa (35% - 45.6%),. PE CU A. al., 2012).. hemicelulosa (36.9% - 40%) y lignina (5% - 20%) (Boonchuay et al., 2014; Brar et al., 2016).. El pre-tratamiento aumenta el rendimiento directo de los azúcares fermentables, evita la degradación temprana de los azúcares generados, evita la formación de inhibidores de la hidrólisis y la fermentación; reduce el costo de procesamiento; y. AG RO. reduce la demanda de energía convencional en general (Silverstein, 2007; Gupta y Verma, 2014). Un pre-tratamiento efectivo cumple los siguientes criterios: preservación de la fracción de hemicelulosa para maximizar el rendimiento de azúcar fermentable, limitar la pérdida de carbohidratos para minimizar la formación de inhibidores debido a la degradación de estos productos, minimizar la generación. DE. de compuestos tóxicos, minimizar la inversión de energía y que el proceso sea económicamente eficiente (Asgher et al., 2013; Hamzeh et al., 2013, Rohowsky et al., 2013; Zabed et al., 2016).. CA. Diversas investigaciones se han realizado para el pre-tratamiento de corontas maíz para maximizar la producción de azúcares reductores en la etapa de hidrólisis y por. TE. ende aumentar la eficiencia de producción de bioetanol. Ji et al (2016) evaluaron el impacto de diferentes fragmentaciones mecánicas de coronta de maíz, es decir a escala de planta (>1 mm), a escala de tejido (500-100 micras) y a escala celular. IO. (50-30 micras) en las características de la microestructura y la hidrólisis enzimática.. BL. Los resultados mostraron que las características de la microestructura y la hidrólisis enzimática de las muestras de coronta de maíz a una escala de planta y de tejido vegetal, no cambiaron significativamente. Por el contrario, las muestras de coronta. BI. a escala celular exhibieron algunas propiedades especiales como un aumento en el área superficial especialmente con los mesoporos y macroporos interiores -2-. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. expuestos a la superficie; rotura de celulosa cristalina y vínculos en polisacáridos; y. S. una mayor proporción de los polisacáridos en la superficie, lo que mejoró de forma. RI A. significativa la digestibilidad enzimática resultando un rendimiento de 98.3% de conversión de celulosa en glucosa.. Un pre-tratamiento físico de la biomasa que no ha sido aplicado en corontas de maíz. PE CU A. es la congelación, pero se ha encontrado que puede aumentar significativamente la digestibilidad enzimática de paja de arroz. Chang et al. (2010) encontró que la congelación aumentó significativamente la digestibilidad enzimática de paja de arroz de 48% a 84%. Según los resultados, la hidrólisis enzimática de paja de arroz sin tratamiento con 150 U celulasa y 100 U de xilanasa durante 48 h dio 226.77 g kg-1 y 93,84 g kg-1 azúcares reductores- sustrato, respectivamente. Además, los análisis. AG RO. de hidrólisis mostraron que el rendimiento de glucosa más alto obtenido durante la etapa de hidrólisis enzimática en el presente estudio fue 371.91 g kg-1 de la paja de arroz seco, tras el pre-tratamiento. Esto indicó que el tratamiento previo de congelación fue muy eficaz para la hidrólisis enzimática. El pre-tratamiento con ácido diluido es más ventajoso respecto a tratamientos con. DE. ácidos concentrados debido a que generan menos cantidades de inhibidores de la fermentación. Baadhe et al. (2014), realizaron un estudio comparativo de dos catalizadores utilizados comúnmente en el pre-tratamiento químico, ácido sulfúrico. CA. e hidróxido de sodio, evaluando el efecto de la relación de sólido-líquido (S/L) sobre el pre-tratamiento y la hidrólisis enzimática. La relación de sólido (sustrato)-líquido. TE. (catalizador) más eficaz en la liberación de azúcares estuvo entre 0.03 g/mL y 0.2 g/mL. La digestibilidad enzimática de corontas de maíz con H2SO4 0.25 M liberó mayor cantidad de azúcares reductores (415.12 mg/g); mientras que, corontas de. IO. maíz pre-tratados con NaOH obtuvo 350.12 mg/g de azúcares reductores; ambos. BL. pre-tratamientos tuvieron una relación S/L de 0.05. Además, en comparación con NaOH las corontas de maíz pre-tratadas con ácido aumentaron sustancialmente la accesibilidad y la digestibilidad de la celulosa durante la hidrólisis enzimática en. BI. bruto (28.96 FPU) liberando 398.95 mg/g de azúcares reductores.. -3Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Los pre-tratamiento anteriores tienen algunos inconvenientes que limitan sus. S. aplicaciones. Los métodos de pre-tratamiento combinados se han considerado. RI A. recientemente como un enfoque prometedor para superar este reto, al aumentar la. eficiencia de la producción de azúcares, la disminución de la formación de inhibidores y acortando el tiempo de proceso. Estos darían como resultado un mayor. PE CU A. rendimiento en bioetanol y un proceso de obtención del mismo más económico (Mood et al., 2013).. En este estudio la fibra de coronta de maíz fue sometida a tres pre-tratamientos, es decir un pre-tratamiento con H2SO4 0.25 M, a una congelación lenta a -20°C y aplicando la combinación de ambos tratamientos, teniendo como objetivo evaluar el efecto del pre-tratamiento ácido y por congelación de fibra de coronta de maíz (Zea. AG RO. mays L.) en la hidrolisis con celulasa de Aspergillus niger, en los cambios de su macroestructura y compuestos lignocelulósicos después de los pre-tratamientos. 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Materia prima. DE. La coronta de maíz fue obtenida de mazorcas de maíz amarillo compradas de agricultores locales de la ciudad de Trujillo (La Libertad, Perú). Las corontas de maíz obtenidas tuvieron un rendimiento respecto a la mazorca de 18.16 ± 1.22%. Para. CA. obtener la fibra de coronta de maíz, la materia prima inicial se acondicionó, es decir se sumergió por 24 horas en agua fresca y posteriormente se lavó con agua destilada, seguidamente se cortaron en pequeñas rodajas con cuchillos de acero. TE. inoxidable y se secaron en una estufa a 105 °C por 3,5 h. Estas muestras se molieron en un molino manual Bach (Corona, Perú) y posteriormente se pasó en un. IO. tamiz número 40 (Tyler, EE.UU.) para obtener una fibra de coronta homogénea. BI. BL. (FCH) de 0,37 mm de tamaño de partícula.. -4Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2. Pre-tratamientos. Coronta de maíz. Secado, molienda y tamizado. Congelació n por 12 h a -20°C. FCH H2SO4 0.25 M; 121 °C por 20 minutos. RI A. FCHC. Hidrólisis enzimática. Glucosa (g/L). FCHA. AG RO. LEYENDA: FCH: Fibra de coronta homogénea FCHC: Fibra de coronta homogénea congelado FCHA: Fibra de coronta homogénea ácido FCHAC: Fibra de coronta homogénea ácido-congelado. FCH. PE CU A. Sin pretratamiento. S. La FCH fue pre-tratada según se muestra en la figura 1.. FCHAC. DE. H2SO4 0.25 M; 121 °C por 20 minutos y congelación por 12 h a 20 °C. Figura 1. Procedimiento de los diferentes pre-tratamientos. CA. 2.2.1. Físico. La FCH se mezcló con una solución tampón de acetato de sodio (50 mM) en una. TE. relación de 200 mg FCH/5 mL solución tampón durante 1 h y luego se pre-trató por congelación a -20 °C durante 12 horas en una congeladora (Coldex CH-10, Perú) realizándose una congelación lenta. Posteriormente, la FCHC se descongeló a. IO. temperatura ambiente durante 1 h, y posteriormente se secó en una estufa. BL. (Memmert, BE-400, Alemania) a 60 °C por 12 h (Chang et al., 2010). 2.2.2. Químico. BI. Se usó una relación de sólido a líquido (S/L) de 0,05 g FCH/mL de H2SO4 (J.T. BAKER, 7664-93-9, EE.UU.) 0.25 M. Todos estos experimentos se llevaron a cabo. en matraces Erlenmeyer y se mantuvieron a 121 °C durante 20 min en una autoclave -5Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. (Fravill, IP-010, Perú). Posteriormente el sólido residual de fibra de coronta pre-. S. tratada con ácido (FCHA) se separó por filtración y se secó en estufa (Memmert,. RI A. BE-400, Alemania) a 60°C por 12 h (Baadhe et al., 2014). 2.2.3. Fisicoquímico. PE CU A. Este pre-tratamiento se realizó con una combinación de los pre-tratamientos anteriores, es decir, a la FCHA se le realizó la metodología de pre-tratamiento por congelación. Finalmente la muestra pre-tratada por ambos pre-tratamiento se secó en estufa (Memmert, BE-400, Alemania) por 12 h a 60 °C (FCHAC). 2.3. Hidrólisis enzimática. AG RO. Los experimentos de hidrólisis enzimática se llevaron a cabo en matraces Erlenmeyer de 100 mL. Se utilizó Celulasa de Aspergillus niger (Sigma-Aldrich, C1184-5KU, EE.UU.) concentración de 1.3 U/mg para la hidrólisis de la FCH, FCHA, FCHC y FCHAC. La hidrólisis enzimática se llevó a cabo por incubación de las muestras con 150 U de celulasa por gramo de fibra de coronta de maíz en 10 mL de 50 mML-1 de solución tampón de acetato de sodio, pH 5,5, a 37 °C. La mezcla. DE. se incubó a 37 °C en una agitador orbital incubador (Biomaker, BS-GS-30, China) a 100 rpm por 72 horas (Chang et al., 2010 y Baadhe et al., 2014).. CA. 2.4. Métodos analíticos. TE. 2.4.1. Análisis fisicoquímicos de la materia prima y fibra homogénea Se realizaron análisis de humedad, cenizas y pH según el Método AOAC 1980; 7003, Método AOAC 2005; 923.03 y Método AOAC 2000; 981.12 respectivamente. IO. para la materia prima y las muestras de fibras de coronta de maíz.. BL. 2.4.2. Análisis de microscopía óptica Para determinar los cambios de la macroestructura de la FCH, FCHA, FCHC y. BI. FCHAC se utilizó la metodología de Chang et al (2010) modificada. Las muestras se observaron usando microscopio óptico (Motic, BA310, China ) con un objetivo de -6-. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. inmersión 10X usando el software Motic Images 2.0, que tomó fotografías de la. S. macroestructura de la fibra de coronta homogénea antes y después de los. 2.4.3. Determinación de compuestos lignocelulósicos. RI A. tratamientos.. PE CU A. A las muestras de FCH, FCHA, FCHC y FCHAC se determinaron los compuestos lignocelulósicos siguientes: holocelulosa (Browning, 1967), celulosa (American. National Standards Institute, 1977), lignina (American National Standards Institute, 1977) y hemicelulosa que se determinó por la diferencia entre la holocelulosa y celulosa.. AG RO. 2.4.4. Determinación de azúcares reductores totales. El contenido de azúcares reductores totales se determinó para cada muestra hidrolizada cada 12 horas durante las 72 horas de hidrólisis, según el método Ácido Dinitrosalicílico (DNS) descrito por Miller (1959). Se tomaron cada 12 horas 2 mL de hidrolizado de cada muestra y posteriormente se centrifugó (Hettich, EBA 20, Alemania) obteniéndose un solvente libre de muestras sólidas. De este hidrolizado. DE. se tomaron 0.1 mL y se adicionaron 0.9 mL de DNS a un tubo de ensayo. Los tubos se colocaron en un baño de agua de 100 °C por 10 minutos. Se enfrió hasta temperatura ambiente y se añadió 10 mL de agua destilada, se agitó y se realizó. CA. una lectura a 540 nm en espectrofotómetro (Hewlett Packard, 8452A, USA). Cabe resaltar que primeramente se realizó una curva patrón con soluciones de glucosa.. TE. 2.5. Conversión de celulosa a glucosa En este estudio la conversión de celulosa se refiere a la hidrólisis enzimática de. IO. celulosa a glucosa en un sustrato, pre-.tratado o no. El rendimiento de glucosa de. BL. la hidrólisis enzimática es obtenido de la concentración de glucosa en el hidrolizado enzimático. Cada unidad de glucano produce una molécula de glucosa después de ganar una molécula de agua, asimismo la tasa de peso molecular entre una. BI. molécula de glucano y glucosa es de 0.9 (C6H10O5/C6H12O6) es útil en el cálculo de conversión de la celulosa. Los β-1,4 glucano generalmente se presentan como -7-. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. celulosas en las plantas, de tal forma que se utilizará la ecuación 1 para determinar. 𝑚𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 ∗𝑓ℎ 𝑚𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙∗𝑦𝑖. ∗ 100. RI A. 𝐶𝑜𝑛𝑣𝑒𝑟𝑠𝑖ó𝑛 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑜𝑠𝑎 (%) =. S. la conversión de celulosa a glucosa (Dussán et al., 2014). (1). Donde, mglucosa es la masa de glucosa en el hidrolizado final (g), m inicial es la masa conversión (para celulosa es 0.9). 2.6. Análisis estadístico Se realizó un ANVA (Análisis de varianza). PE CU A. inicial de sustrato seco (g), yi es la celulosa en la biomasa (%) y fh es el factor de. de un factor, basado en un nivel de. confianza del 95 % con un valor-p de significancia de p<0.05 por cada 12 horas de. AG RO. hidrólisis, para evaluar las diferencias significativas entre pre-tratamientos. Si el ANVA es significativo (p<0.05) para cada caso, se realizará una prueba de homogeneidad de varianzas evaluando el estadístico de Levene, para determinar las diferencias significativas entre tratamientos, según sea el caso (Tamhane o Tukey). Estos análisis se realizaron usando SPSS (Statistical Programme for Social. DE. Sciences, SPPS Corporation, IL, USA) versión 22.0 para Windows.. 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. CA. 3.1. Análisis fisicoquímicos de la materia prima y fibra homogénea La composición química de residuos agrícolas varía de acuerdo a la localización,. TE. estación y métodos de cosechas (Silverstein, R., 2007). A la materia prima inicial se le realizó una caracterización fisicoquímica de humedad, cenizas y pH, siendo de. IO. 48.46 ± 1.65%, 1.59 ± 0.02% y 5.62 respectivamente. En este estudio se encontró que las características fisicoquímicas de la fibra homogénea obtenida después del. BL. acondicionamiento de la materia prima fueron los siguientes: pH: 5.08, % humedad: 3.53 ± 0.57% y % cenizas: 1.47 ± 0.03%. La celulosa fue el componente primario y. BI. representó el 40.9502 ± 0.3842% de la materia prima, la hemicelulosa era el otro constituyente 38.9398 ± 1.7157% y el contenido de lignina fue de 16.5356 ± 0.37622%. El contenido de estos compuestos lignocelulósicos estaba en el rango -8-. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. reportado por otros estudios realizados en corontas de maíz, como se muestra en. S. la tabla 1.. RI A. Tabla 1. Composición química de la coronta de maíz Cheng et al., 2009. Zych, 2008; Potumarthi et al., 2012. Yang et al., 2005; Boonchuay et al., 2014. Brar et al., 2016. Celulosa (%). 40.95 ± 0.38. 43-45. 32.3–45.6. 35-45. 45.6. 34.3. Hemicelulosa (%). 38.94 ± 1.72. 34-35. 38.9. 40. 36.9. 21.7. Lignina (%). 16.54 ± 0.38. 15-18. 6.7–13.9. 5-20. 15.1. 17.6. PE CU A. Este estudio. COMPOSICIÓN QUÍMICA. Cheng J et al., 2011. AG RO. 3.2. Componentes lignocelulósicos después de los pre-tratamientos Los componentes lignocelulósicos de la coronta de maíz después de los diferentes pre-tratamientos se muestran en la figura 2. Luego del pre-tratamiento con ácido, el contenido de celulosa de la mazorca aumentó, observándose una disminución de la hemicelulosa, como un aumento de la lignina. Después de la congelación, no se muestra diferencias significativas en el aumento de celulosa y contenido de lignina,. DE. debido a la baja degradación de la hemicelulosa. Los mayores cambios en los componentes lignocelulósicos se dio con el pre-tratamiento fisicoquímico, la cual se observa una mayor presencia de celulosa (64.12 ± 1.03), una mayor degradación. CA. de hemicelulosa (10.16 ± 1.42) y un ligero aumento de lignina (19.76 ± 0.42). Estadísticamente la hemicelulosa, celulosa y lignina antes y después del pre-. TE. tratamiento físico no existen diferencias significativas, de igual forma entre los pre-. BI. BL. IO. tratamientos químicos y físico-químico.. -9Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. S. B. A C. C. F. E. E. F. D. AG RO. D. PE CU A. A. RI A. B. Figura 2. Componentes lignocelulósicos de la coronta de maíz después de diferentes pre-tratamientos (Letras en mayúscula iguales no existen diferencias significativas).. Diversas investigaciones utilizan ácido sulfúrico diluido como pre-tratamiento. DE. químico con el objetivo de degradar la hemicelulosa y hacer que la celulosa sea más accesible a las enzimas, además de generar menor cantidad de inhibidores de fermentación. Sin embargo, dependiendo de la temperatura de operación, se. CA. generan algunos compuestos de degradación de azúcares tales como furfural y hemifurfurales (HMF) y aromáticos (Saha et al., 2005). Estudios muestran que el. TE. pre-tratamiento con H2SO4 diluido (2-5%) de corontas de maíz a temperaturas de121-122°C por 20-25 minutos generaron más sitios accesibles de celulosa para. IO. las enzimas de celulasa, mejorando la digestión enzimática significativamente, obteniendo rendimiento de azúcar de 80% (p/p) (Kahar et al., 2010 y Potumarthi et. BL. al., 2012).. El contenido de celulosa de FCHA se encuentra en el rango reportado por estudios. BI. realizados con coronta de maíz pre-tratados con H2SO4 diluido, como se muestra en la tabla 2.. -10Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 2. Compuestos lignocelulósicos de coronta de maíz pre-tratada con H2SO4. A. 0.38a. Este estudio Liu et al., 2010 Baadhe et al., 2014 Gupta et al., 2011. 40.95 ± 43.09 ± 2.23a 61.18 ± 1.42b 64.12 ± 1.03b 38.8 62.60 45.10 59.75 37.4 ± 4.18 52.1 ± 2.8. RI A. Componentes Lignocelulósicos. Celulosa (%). Hemicelulosa (%) 1.72c. 38.94 ± 36.70 ± 1.67c 13.05 ± 1.47d 10.16 ± 1.42d 36.4 2.40 34.00 11.63 34.2 ± 1.02 14.6 ± 1.5. Lignina (%). 16.54 ± 0.38e 16.08 ± 1.79e 20.22 ± 0.45f 19.76 ± 0.42f 13.1 17.70 17.20 25.89 19.2 ± 0.83 22.4 ± 0.5. AG RO. FCH FCHC FCHA (H2SO4 0.25 M) FCHAC FCH H2SO4 0.5 M FCH H2SO4 0.25 M FCH H2SO4 2 % (p/v). Autor. PE CU A. Tratamientos. S. diluido (Letras de superíndice iguales no existen diferencias significativas).. pesar de que un pre-tratamiento físico reduce el tamaño de las partículas,. aumenta la superficie accesible y tamaño de los poros conduciéndole a disminuir el grado de polimerización y des cristalización del material lignocelulósico (Sun y Cheng, 2002 y Harun et al., 2011)) en la tabla 2 observamos que el tratamiento por congelación genera el menor aumento de celulosa y menor degradación de. DE. hemicelulosa. Estos resultados se deben a que la compleja estructura de la biomasa lignocelulósica no se degrada fácilmente usando sólo almacenamiento en congelación (Jeong et al., 2016).. El aumento de lignina después los pre-. CA. tratamientos se pueden explicar por los cambios fisicoquímicos, como la fusión y condensación de lignina o la formación de pseudo-lignina por la combinación de. TE. carbohidratos generados por la degradación de la hemicelulosa y productos de degradación de lignina (Zheng et al., 2015).. IO. 3.3. Análisis de microscopía óptica. BL. La macroestructura de la coronta de maíz antes y después de los pre-tratamientos. BI. se observaron por microscopía óptica y se presentan en la figura 4 (A-D).. -11Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A. RI A. S. Estructura muy aglomerada e irregular. Estructura rígida en forma de red cristalina y menos aglomerada. AG RO. PE CU A. B. DE. C. Estructura particionada , rígida en forma de red cristalina y menos aglomerada. IO. TE. CA. D. Estructura rígida, y menos aglomerada. BL. Figura 3. Imágenes del microscopio óptico de la fibra de coronta de maíz homogenizada sin pre-tratamiento y después de los pre-tratamientos. (A): fibra de. BI. coronta de maíz homogéneo sin pre-tratamiento (FCH); (B): fibra de coronta congelada (FCHC); (C): fibra de coronta pre-tratada con ácido (FCHA); (D): fibra de coronta pre-tratado con ácido y sometido a congelación (FCHAC). -12-. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Los cambios morfológicos de la fibra de coronta de maíz antes y después de los. S. pre-tratamientos son eminentemente claros. En la figura 3 (A) la estructura de la. RI A. fibra de coronta de maíz se muestra aglomerada y algo irregular debido a la. presencia de hemicelulosas amorfas en su superficie (Brar et al., 2016), además indicando la presencia de células interrumpidas debido al entrecruzamiento de los. PE CU A. componentes de los materiales lignocelulósicos (celulosa, hemicelulosa y lignina) (Mood et al., 2013). Según Aachary A.A. y Prapulla, S.G. (2009) en la fibra de coronta de maíz observadas por microscopia electrónica de barrido, las partículas globulares representan el componente lignina y las fibrillas representan el componente del complejo sacárido (hemicelulosas y celulosas). En la figura 3 (B) se observa que FCHC tiene una estructura rígida en forma de red cristalina y menos. AG RO. aglomerada. En particular, el pre-tratamiento por congelación es un enfoque de pretratamiento físico que utiliza los principios del agua; es decir la densidad del agua disminuye y su volumen se expande cuando se congela (Lide DR., 2004). Esta propiedad se ha estudiado principalmente para la conservación y almacenamiento de los alimentos (Hong et al., 2013 y Noh et al., 2006). Entre tanto, sólo pocos trabajos sobre los efectos de la congelación en materiales lignocelulósicos se han. DE. estudiado. A excepción de uno que llevó a cabo el pre-tratamiento de la congelación de la paja de arroz para mejorar la conversión enzimática (Chang et al., 2010). En este estudio se informó que el proceso de congelación de la biomasa mejoró los. CA. rendimientos de hidrólisis enzimática aumentando el área superficial de respuesta y la accesibilidad enzimática en la biomasa pre-tratada.. TE. En la figura 3 (C) la FCHA se observa que el pre-tratamiento con H2SO4 0.25 M aumento la superficie específica de la fibra de coronta sin tratar, debido a que existe. IO. una mayor partición de su estructura, además de observarse menos aglomerada e irregular debido tal vez a la eliminación de hemicelulosa. Kahar. et al., 2010. BL. realizaron estudios de la morfología de fibras de coronta de maíz observadas por barrido de microscopía electrónica pre-tratadas con y sin H2SO4 0.5% (v/v) en. BI. autoclave a 122°C por 20 minutos, observándose que el pre-tratamiento con ácido y en autoclave podría romper la rigidez estructural de las matrices de lignocelulosa de la fibra de coronta de maíz y hacer muchos microporos en el interior. Esto -13-. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. significó que la superficie de la fibra de coronta de maíz se incrementó. S. significativamente por la disociación de las matrices de hemicelulosa de las. RI A. microfibrillas de celulosa. Brar et al (2016) observó a través de microscopía de. barrido electrónico que después de realizar un pre-tratamiento con H2SO4 1% (v/v) a fibra de coronta de maíz, esta mostró una estructura de fibrillas ordenadas y. PE CU A. rígidas debido a la exposición de celulosa cristalina como resultado de la eliminación de hemicelulosa. El efecto más llamativo del pre-tratamiento con H2SO4 1% (v/v) es la separación de las fibras de la médula y el aflojamiento de la red fibrosa (Martín et al., 2012). La alta temperatura y presión durante el pre-tratamiento influyen en la superficie externa dando lugar a un aumento de 16 veces en el área de superficie, así como en el. AG RO. volumen de poros en 1,69 veces (Zhao et al., 2009 y Lv et al., 2013).. Finalmente en la figura 3 (D) la FCHAC se observa muy particionada, y menos aglomerada notándose una estructura en forma de red cristalina, esto se pudo haber generado por eliminación de hemicelulosa y separación de las fibras de lo estructura lignocelulósica, debido primeramente al tratamiento con ácido y además del. DE. incremento del volumen de poros debido al tratamiento por congelación. Chang et al. (2010) muestran fotos de microscopía óptica de paja de arroz pre-tratados con H2SO4 4 % (v/v) en autoclave a 121 °C por 1h y posteriormente congelado a -20°C. CA. durante 2 h y sin pre-tratamiento, observándose que los tamaños de la fibra con y sin pre-tratamiento eran diferentes. La anchura de la paja de arroz no tratada fue. TE. aproximadamente 10 mm a 20 mm con una estructura gruesa. La anchura de la fibra de paja de arroz pre-tratada fue de aproximadamente 20 mm a 50 mm, con una longitud de 40 mm a 80 mm, indicando. que el soluto (acetato) expandió la. IO. estructura después de la congelación y liberó azúcares reductores. Por lo tanto, el. BL. pre-tratamiento por congelación aumentó la hidrólisis enzimática mediante el. BI. aumento superficie accesible y porosidad de la paja de arroz.. -14Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 3.4. Hidrólisis enzimática. S. La fibra de coronta homogénea (FCH) antes y después de los pre-tratamientos. RI A. fueron sometidas a hidrólisis enzimática utilizando enzima celulasa de Aspergillus niger (C1184-5KU) 1.3 U/mg sólido durante 72 horas a 37 °C, pH 5,5 y a 100 rpm. El desempeño de la hidrólisis enzimática se determinó calculando la concentración. PE CU A. de la glucosa, obtenidos a partir de la conversión de la celulosa y hemicelulosa de la fibra de coronta de maíz. Comparando la digestibilidad enzimática de las muestras, observamos que la FCHAC resulto ser más susceptible a la hidrólisis enzimática. En la figura 4 se puede observar la obtención de glucosa (g/L) de las diferentes muestras pre-tratadas, a través de las 72 horas de hidrólisis enzimática. La mayor concentración de glucosa fue a las 72 h de hidrólisis para la FCHAC y a. AG RO. las 24 h de hidrólisis para la FCH, los cuales fueron de 40.90 ± 2,11 y 34.11 ± 1,28 g/L de la FCHAC. En la figura 4, se puede observar también que la mayor concentración de glucosa se generó entre las 12 y 24 horas de hidrólisis para las muestras: FCH, FCHC y FCHA, los cuales fueron decreciendo gradualmente durante las siguientes horas de hidrólisis.. DE. El menor contenido de glucosa durante las 72 horas de hidrólisis fue para la FCHA, la cual obtuvo 21,92 ± 1,23 g/L (219,2 ± 12,3 mg/g sustrato), este resultado no se asemeja a estudios realizados con coronta de maíz sometidos a tratamientos con. CA. H2SO4 diluido, los cuales están en el rango de 395.15 – 453.0 mg ART/ g sustrato (Potumarthi et al., 2012; Baadhe et al., 2014; Brar et al., 2016). El factor que pudo. TE. intervenir en un bajo rendimiento de glucosa, se pudo dar básicamente al cambio de pH durante la hidrólisis, la cual pudo deberse a la generación de productos inhibidores de hidrólisis enzimática los cuales se generan por compuestos no. IO. deseados de la degradación de la hemicelulosas y lignina, es decir ácidos alifáticos,. BL. furfural, HMF y compuestos fenólicos (Van et al., 1986). Estos Compuestos pueden. BI. inhibir la hidrólisis enzimática en al menos el 50% (Cantarella et al., 2004).. -15Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 50. S. 45. 35. 2,4. Glucosa (g/L). 2, 3,4. 2 3,4. 2 2. 1, 3,4. 25. 2,4. 1, 3,4 2. 2. 15. 1 1. 2. 20. 1, 2. PE CU A. 30. 1,2 1, 3,4. 1,2. RI A. 40. 1, 2. 10 5. 4 3. 0 -5 -10. 12. 24. 36. 48. AG RO. 0. 60. 72. FCH FCHC FCHA FCHAC. TIEMPO (h). Figura 4. Concentración de glucosa producida por hidrólisis enzimática de coronta de maíz con diferentes pre-tratamientos. (Se codificó: FCH: 1; FCHC: 2; FCHA: 3; FCHAC: 4; Los números (1, 2, 3 o 4) para cada pre-tratamiento por cada 12 horas muestran que no existen diferencias significativas entre ellos). DE. En la figura 5 del hidrolizado final se observa que el pH final para el pre-tratamiento ácido y combinado fueron los menores 1.09 ± 0.01 y 3.40 ± 0.11 respectivamente, cabe resaltar que el pH al inicio de la hidrólisis fue de 5.48 ± 0,09. Este cambio se. CA. pudo haber dado principalmente a la formación de compuestos no deseados durante la degradación de la hemicelulosa y lignina, como anteriormente se. TE. mencionó, y está claro que las condiciones óptimas para una mejor actividad enzimática de la celulasa de Aspergillus niger C1184-5KU es 5.0 de pH y 37 °C temperatura. Las variaciones de pH y temperatura, son los principales factores que. IO. afectan el rendimiento de la actividad catalítica de extractos enzimáticos producidos. BI. BL. por Asperguillus ficuum (celulasas, xilasas y fitasas) (Costa et al., 2012).. -16Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) PE CU A. RI A. S. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 5. PH del hidrolizado final para los diferentes pre-tratamientos (72 H). AG RO. Las enzimas principalmente estudiadas para mejorar la etapa de hidrólisis enzimática consiguiendo verdaderos resultados en el aumento de conversión de celulosa en azúcares simples en corontas con diversos pre-tratamientos han sido las celulasas. Según la revisión de trabajos realizados con coronta de maíz, esta etapa se ha llevado en condiciones normales, es decir, presión atmosférica y temperaturas moderadas (45-55 °C), con un tiempo de retención generalmente de. DE. 48-72 horas y entre 100 -150 rpm. La temperatura depende básicamente de las condiciones óptimas para un correcto trabajo de la enzima. (Cheng. K et al., 2011; Xing et al., 2016; Zheng et al., 2014; Fan et al., 2014; Potumarthi et al., 2012;. CA. Baadhe et al., 2014; Ji et al., 2016; Brar et al., 2016; Kawee-ai et al., 2016). Se realizó un ANVA (Análisis de varianza). de un factor, basado en un nivel de. TE. confianza del 95 % con un valor-p de significancia de p<0.05 por cada 12 horas de hidrolisis, para evaluar las diferencias significativas entre pre-tratamientos,. IO. resultando un ANVA significativo en todos los casos (p<0.05), por tal motivo se realizó una prueba de homogeneidad de varianzas evaluando el estadístico de. BL. Levene, para determinar las diferencias significativas entre tratamientos, según sea el caso. Estos análisis se realizaron usando SPSS (Statistical Programme for Social. BI. Sciences, SPPS Corporation, IL, USA) versión 22.0 para Windows.. -17Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En la figura 4 se aprecia que a las 72 h de hidrolizado la concentración de glucosa. S. obtenidas de la FCH y FCHC, 33.17 ± 2,03 g/L y 29,50 ± 1,23 g/L respectivamente,. RI A. estadísticamente no son diferentes, en cambio entre los pre-tratamientos FCH, FCHC y FCHAC existen diferencias significativas (p<0.05). Cabe resaltar que entre la concentración de glucosa obtenidas de la FCH y FCHAC, 33,17 ± 2,03 y 40.90 ±. PE CU A. 2,11 g/L respectivamente, existen diferencias significativas.. Los resultados obtenidos de concentración de glucosa mediante el pre-tratamiento combinado a las 72 horas de hidrólisis, 40.90 ± 2,11 g/L (409,0 ± 21,1 mg/ g sustrato), están dentro de los rangos obtenidos por diferentes estudios realizados con diferentes pre-tratamientos en coronta de maíz y usando como enzimas celulasas, las cuales se encuentran entre 350.12 – 453.0 mg ART/ g sustrato. AG RO. (.Cheng. K et al., 2011; Xing et al., 2016; Zheng et al., 2014; Fan et al., 2014; Potumarthi et al., 2012; Baadhe et al., 2014; Ji et al., 2016; Brar et al., 2016; Kaweeai et al., 2016). Dentro de las investigaciones de pre-tratamientos de coronta de maíz, no existen estudios de pre-tratamientos combinados (ácido- congelación) con coronta de maíz, a pesar de las ventajas más importantes del método de. DE. congelación, incluyendo un impacto más respetuoso con el medio ambiente y generación de menos tóxicos químicos, la compleja estructura de la biomasa lignocelulósica no se degrada fácilmente usando sólo almacenamiento en. CA. congelación, y requiere una gran cantidad de energías de enfriamiento. Por lo tanto, en este estudio, combinamos el almacenamiento en congelación con el pretratamiento con ácido diluido, que es el método de pre-tratamiento más. TE. comúnmente utilizado para la biomasa lignocelulósica, observándose una mayor accesibilidad enzimática aumentando el rendimiento del pre-tratamiento.. IO. En los trabajos realizados la congelación mejora el rendimiento de hidrólisis. BL. enzimática luego de realizar un pre-tratamiento por congelación a biomasas lignocelulósicas (cáscara de arroz, roble de Mongolia y planta halófila Juncus. maritimus) pre-tratadas por H2SO4 a bajas concentraciones y altas temperaturas.. BI. Chang et al., 2010 determinaron que la paja de arroz almacenada en congelación a -20 °C, por 2 horas, previamente tratada con H2SO4 al 4% por autoclave en 21 °C -18-. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. por 1 hora, aumentó la digestibilidad enzimática por celulasa y xilanasa. La hidrólisis. S. de la paja de arroz sin pre-tratamiento con 150 U de celulasa y 100 U de xilanasa. RI A. produjo 226,77 gART kg-1S y 93,84 gART kg-1S (ART: Azúcares reductores Totales; S: Sustrato) respectivamente, después de 48 h. Sin embargo, los rendimientos de. azúcares reductores del pre-tratamiento por congelación a las mismas condiciones. PE CU A. fueron 417,27 gART kg-1S y 138,77 gART kg-1S para la celulasa de 150 U y la xilanasa de 100 U, respectivamente. El pre-tratamiento por congelación mejoró los rendimientos de hidrólisis enzimática con celulasa 150 U por aproximadamente de 84% en comparación con los registrados a partir de muestra sin congelar. Smichi et al., 2015 estudiaron la producción de etanol a partir de la planta halófila Juncus maritimus usando pre-tratamientos por congelación a -20 °C por 24 horas y. AG RO. ácido sulfúrico al 1%, evaluando la conversión de celulosa y hemicelulosa en azúcares reductores mediante el aumento de la eficiencia en la hidrolisis enzima tica, con enzimas comerciales, CellicCTec2, CellicHTec2 y Accelerase 15000. Los estudios demostraron que mediante congelación se obtuvo mayor digestibilidad enzimática del Juncus maritimus a comparación con ácido sulfúrico al 1%. La. DE. glucosa (g/L) obtenida luego de la hidrólisis enzimática durante 48 horas, fue de 53.78 ± 3.24 g/L, 30.96 ± 0.44 g/L y 24.54 ± 1.31 g/L con CellicC Tec2, CellicHTec2 y Accelerase 1500, respectivamente. La concentración máxima de glucosa liberada J.. maritimus. (53.78. ±. 3.24. g/L). fue. por. pre-tratamiento. de. CA. de. congelación/descongelación y Sacarificación enzimática (55 ◦ C, pH 5.0 y 48 h) usando CellicCTec2 de Novozymes y por pre-tratamiento con ácido diluido (49.14 ±. TE. 5.24 g/L). El pre-tratamiento por congelación mejoró los rendimientos de hidrólisis enzimática por aproximadamente de 9.44 % en comparación a las muestras pre-. IO. tratadas con ácido.. BL. Jeong et al., 2016 investigaron el efecto de almacenamiento de congelación sobre la degradación de la hemicelulosa de roble de Mongolia por pre-tratamiento con ácido sulfúrico al 1 %. En este estudio, el almacenamiento congelado se vio. BI. afectada por el tiempo de congelación, la relación sólida: solución de congelación, y el tipo de solución de congelación (agua destilada y ácido sulfúrico al 1%). -19-. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Finalmente, los efectos de la eliminación de hemicelulosa por expansión del. S. volumen de agua se maximizaron al tiempo de congelación de 120 minutos (-10 °C). RI A. y proporción de sólida a agua destilada de 5:3, bajo estas condiciones, se produjo más glucosa (36.20 g glucosa/100 g sustrato). El pre-tratamiento por congelación. mejoró los rendimientos de hidrólisis enzimática por aproximadamente de 10.27 %. PE CU A. en comparación a las muestras pre-tratadas con ácido.. En la investigación se determinó que el rendimiento de la hidrólisis enzimática después de una congelación a las muestras pre-tratadas con ácido diluido aumento en un 86.57 %, este rendimiento es mucho mayor a los resultados en investigaciones antes mencionadas.. AG RO. 3.5. Conversión de celulosa a glucosa. En la figura 6 se muestra la tasa de conversión de la celulosa a glucosa para cada pre-tratamiento luego de 72 h de hidrólisis enzimática. Para el mejor pre-tratamiento (FCHAC) la tasa de conversión de celulosa a glucosa fue de 57.41%, a lo contrario de las muestras sin pre-tratamiento que tuvieron una tasa de conversión de 72.90%.. DE. La baja tasa de conversión de celulosa a glucosa por el pre-tratamiento combinado y ácido (32.25%) se pudo haber dado por el mayor contenido de lignina 19.76 ± 0.42% y 20.22 ± 0.45% respectivamente, a comparación de la muestra sin pre-. CA. tratamiento que fue de 16.54 ± 0.38%. La lignina limita la velocidad de hidrólisis enzimática actuando como una barrera física y evitando que las partes digeribles del sustrato sean hidrolizadas (Chang y Holtzapple, 2000). Las celulasas son más. TE. afectadas por inhibición de lignina en comparación con las xilanasas y las glucosidasas, debido a la unión irregular entre enzimas celulolíticas y la lignina. IO. (Esteghlalian et al., 2001 y Berlin et al., 2006). La unión irregular de enzimas a la lignina también está influenciada por la naturaleza del sustrato (Esteghlalian et al.,. BI. BL. 2001).. -20Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) 450.00 400.00. 331.69. 350.00. 295.04. RI A. 300.00 250.00. 219.24. 200.00 150.00 72.90. 61.62 32.25. 57.41. 100.00 50.00 0.00. FCH. FCHC FCHA Pre-tratamientos. % Conversión celulosa. S. 409.03. Rendimiento (mg glucosa/g sustrato). 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%. PE CU A. % Conversión celulosa. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. FCHAC. Rendimiento. AG RO. Figura 6. Conversión de celulosa a glucosa después de la hidrólisis enzimática. En la figura 6 se aprecia una producción de 409.03 mgglucosa/gsustrato para el pretratamiento combinado. Otro punto importante que se puede observar en la figura 6 es que luego de realizar la congelación a la muestra sin pre-tratamiento, los resultados luego de la hidrólisis enzimática no fueron positivos debido a una baja. DE. producción de glucosa, de igual forma al realizar el pre-tratamiento con ácido diluido, en ambos pre-tratamientos se observa un efecto negativo en cuanto la producción de glucosa. En cambio al realizar la congelación a las muestras sometidas a ácido. CA. diluido se observa un efecto positivo en la hidrólisis enzimática debido a la mayor generación de glucosa, es decir 219.24 mgglucosa/gsustrato a 409.03 mgglucosa/gsustrato,. TE. la cual representó un aumento en el rendimiento de glucosa de 86.57%. La fermentación de estas fracciones de azúcar puede dar lugar a rendimientos de. IO. etanol de 90% del máximo teórico, que es 0.51 g de etanol por g de azúcar (Lawford y Rousseau, 2002). Por lo tanto teniendo en cuenta la producción de 409.03. BL. mgglucosa/gsustrato y la densidad del etanol de 0.79 kg/L se tendría un rendimiento teórico de etanol a partir de coronta de maíz de 0.238 Letanol/Kgsutrato. Estos. BI. resultados muestran claramente la potencialidad del uso de coronta de maíz para la producción de bioetanol.. -21Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 4. CONCLUSIONES. S. Se determinó que la coronta de maíz tenía un elevado porcentaje de celulosa (40.95. RI A. ± 0.38%) y hemicelulosa (38.94 ± 1.72%) y un bajo contenido de lignina (16.54 ±. 0.38%) haciéndola un material lignocelulósico potencialmente útil para la producción de azúcares fermentables.. PE CU A. Después del pre-tratamiento combinado se observó un mayor aumento en la celulosa (64.12 ± 1.03%), menor cantidad de hemicelulosa (10.16 ± 1.42%) y un aumento en el porcentaje de lignina (19.76 ± 0.42%).. Se observó que la macroestructura de la FCHAC a comparación de las otras muestras estaba muy particionada, y menos aglomerada notándose una estructura en forma de red cristalina y además un incremento del volumen de poros.. AG RO. La mayor producción de glucosa (40.90 ± 2,11 g/L) y lignina (19.76 ± 0.42%) fue obtenida por la FCHA, las cuales pueden ser aprovechados para la conversión de productos de alto valor.. Se determinó que la tasa de conversión de celulosa a glucosa para el pretratamiento combinado fue de 57.41% la cual se traduce en una producción de. DE. 409.03 mgglucosa/gsustrato en 72 horas de hidrólisis.. La congelación a muestras con ácido diluido tuvieron un efecto positivo en la hidrólisis enzimática debido a la mayor generación de glucosa, es decir 219.24. CA. mgglucosa/gsustrato a 409.03 mgglucosa/gsustrato, la cual representó un aumento en el rendimiento de glucosa de 86.57%.. TE. 5. RECOMENDACIONES. Se espera que estos resultados proporcionen nuevos enfoques de pre-tratamientos. IO. combinado; modificando el tipo de congelación, utilizando ácidos diluidos más seguros o álcalis, llevando un control de pH durante el tiempo de hidrólisis. BL. enzimática, con el objetivo de aumentar el rendimiento de generación de azúcares. BI. fermentables de diferentes materiales lignocelulósicos durante la etapa de hidrólisis.. -22Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. S. Aachary, A.A., Prapulla, S.G., 2009. Value addition to corncob: Production and. RI A. characterization of xylooligosaccharides from alkali pretreated lignin-saccharide complex using Aspergillus oryzae MTCC 5154. Bioresource Technology. 100 (2), 991-995.. PE CU A. Almarsdottir, A.R., Sigurbjornsdottir, M.A., Örlygsson, J., 2012. Effect of various factors on ethanol yields from lignocellulosic biomass by Thermo anaerobacterium AK17. Biotechnol. Bioeng. 109, 686–694.. Alvira, P., Tomás-Pejo, E., Ballesteros, M., Negro, M., 2010. Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic. AG RO. hydrolysis: A review. Bioresource Technology. 101, 4851-4861.. ANSI/ASTM. 1977. Standard test methods for alpha-cellulose in wood D 1103-60. American National Standard Institute, Washington DC.. ANSI/ASTM. 1977. Standard test methods for lignin in wood D 1106-56. American National Standard Institute, Washington DC.. DE. Anwar, Z., Gulfraz, M., Irshad, M., 2014. Agro-industrial lignocellulosic biomass a key to unlock the future bio-energy: A brief review. Journal of Radiation Research. CA. and Applied Sciences. 7, 163-173.. AOAC. 1998. Official methods of analysis. Association of Official Analytical. TE. Chemists, Washington DC.. AOAC. 2000. Official methods of analysis. Association of Official Analytical. IO. Chemists, Washington DC. AOAC. 2005. Official methods of analysis. Association of Official Analytical. BL. Chemists, Washington DC. Asgher, M., Ahmad, Z., Iqbal, H.M.N., 2013. Alkali and enzymatic delignification of. BI. sugarcane bagasse to expose cellulose polymers for saccharification and bioethanol production. Industrial Crops and Products. 44, 488-495. -23-. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

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(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. in dark- and photo-fermentation. International Journal of Hydrogen Energy. 36,. S. 2093–2101.. RI A. Cheng, K.K., Wang, W.W., Zhang, J.A., Zhao, Q., Li, J.P., Xue, J.W., 2011. Statistical optimization of sulfite pretreatment of corncob residues for high. PE CU A. concentration ethanol production. Bioresource Technology. 102, 3014–3019.. Cheng, K.K., Zhang, J.A., Ling, H.Z., Xue, J.W., Huang, W., Li, J.P., Xu, J.M., 2009. Optimization of pH and acetic acid concentration for bioconversion of hemicellulose from corncobs to xylitol by Candida tropicalis. Biochem Eng. 43, 203-207.. Costa M., Torres M., Reyes., A. Caracterización de enzimas hidrolíticas de Aspergillus ficuum producidas en fermentación sólida sobre torta de canola. Revista. AG RO. Colombiana Biotecnológica. 24 (1), 208-215.. Dussán K., Silva D., Moraes E., Arruda P., Felipe M. 2014. Dilute-acid Hydrolysis of Cellulose to Glucose from Sugarcane Bagasse. CHEMICAL ENGINEERING TRANSACTIONS. 38, 433-438.. DE. Esteghlalian, A.R., Svivastava, V., Gilkes, N., Gregg, D.J., Saddler, J.N., 2001. An overview of factors influencing the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic feedstocks. In: Himmel, M.E., Baker, W., Saddler, J.N. (Eds.), Glycosyl Hydrolases. CA. for Biomass Conversion. ACS, pp. 100–111. Fan, X., Cheng, G., Zhang, H., Li, M., Wang, S., Yuan, Q., 2014. Effects of acid. TE. impregnated steam explosion process on xylose recovery and enzymatic conversion of cellulose in corncob. Carbohydrate Polymers. 114, 21–26.. IO. Gupta, A., Verma, J.P., 2014. Sustainable bio-ethanol production from agro-. BL. residues: areview. Renew Sust Energ Rev. 2015, 550–567. Gupta, R., Khasa, Y., Kuhad, R., 2010. Evaluation of pretreatment methods in improving the enzymatic saccharification of cellulosic materials. Carbohydrate. BI. Polymer. 84, 1103- 1109.. -25Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.