Estimulacin de clulas mononucleares humanas in vitro con extracto total y pptidos liberados al medio por Candida albicans

$UWtFXORRULJLQDO

(VWLPXODFLyQGHFpOXODVPRQRQXFOHDUHVKXPDQDV

in vitro con extracto

total y péptidos liberados al medio por Candida albicans

$OHMDQGUR3DOPD5DPRV/DXUD(VWHOD&DVWULOOyQ5LYHUD'LDQD(PPD%HFHUULO3DUUD5XEpQ=DPRUD $OYDUDGR5DPyQ0LJXHO$JXLUUH+HUQiQGH]9LROHWD.DUHQ(VSLQRVD$QW~QH]-RVp5REHUWR*RQ]iOH] 3DFKHFR&DUPHQ3DGLOOD'HVJDUHQQHV

5(680(1

AntecedentesODFDQGLGLQDHVHOH[WUDFWRWRWDOREWHQLGRGHCandida albicans\HVODFRQMXQFLyQGHSURWHtQDVGHVXSHU¿FLHHLQWHUQDV

TXHVHXWLOL]DHQODUHDFFLyQLQWUDGpUPLFDSDUDHOHVWXGLRGHKLSHUVHQVLELOLGDGWDUGtD6HKDGHPRVWUDGRTXHC. albicansRVXVGLIHUHQWHV

DQWtJHQRVHVWLPXODQODUHVSXHVWDSUROLIHUDWLYDGHOLQIRFLWRVin vitro6HKDQUHDOL]DGRHVWXGLRVGHORVSULQFLSDOHVFRPSRQHQWHVPDQRSURWHLFRV

de C. albicansLPSOLFDGRVHQODLQPXQRPRGXODFLyQGHODVGHIHQVDVGHOKXpVSHG(QWUHODVSUHVHQWHVHQHOH[WUDFWRiFLGRVHHQFXHQWUD

XQDSURWHtQDGHN'D03TXHHVHOSULQFLSDOEODQFRVREUHHOTXHVHPRQWDXQDUHVSXHVWDSRUSDUWHGHODVFpOXODV7

2EMHWLYRHVWLPXODUFpOXODVPRQRQXFOHDUHVKXPDQDVin vitroFRQSpSWLGRVGHH[WUDFWRWRWDO\SpSWLGRVVHFUHWDGRVDOPHGLRGHFXOWLYRSRU Candida albicans\ODPH]FODGHDPERV

Material y métodosSDUDREWHQHUHOH[WUDFWRWRWDO(7GHCandida albicansVHFXOWLYyODFHSDGHUHIHUHQFLD$7&&GHHVWHKRQJR

HQPHGLR6DXWRQGXUDQWHFLQFRGtDVDž&/DELRPDVDVHVHSDUySRUFHQWULIXJDFLyQ\VHVROXELOL]yHQVROXFLyQVDOLQDLVRWyQLFDODURWXUD FHOXODUVHKL]RSRUVRQLFDFLyQ\GHOVREUHQDGDQWHREWHQLGRVHSUHFLSLWDURQODVSURWHtQDVFRQVROXFLyQVDWXUDGDGHVXOIDWRGHDPRQLR HOFXDOIXHUHPRYLGRSRVWHULRUPHQWHSRUGLiOLVLV(OH[WUDFWRWRWDOVHDMXVWyDXQDFRQFHQWUDFLyQGHSURWHtQDVGHPJP/3DUDREWHQHU SURWHtQDVOLEHUDGDVDOPHGLRDSDUWLUGHOPHGLRGHFUHFLPLHQWRGHCandida albicansVHSURFHGLyDSUHFLSLWDUODV\SXUL¿FDUODVFRQHOPLVPR

WUDWDPLHQWRGHVFULWRSDUDHOH[WUDFWRWRWDO/DVFpOXODVPRQRQXFOHDUHVKXPDQDV&0+VHWRPDURQGHVDQJUHSHULIpULFD\VHSXUL¿FDURQ FRQ/\PSKRSUHSVHODYDURQFRQVROXFLyQVDOLQD\VHUHVXVSHQGLHURQHQPHGLRGH530,DMXVWiQGRVHD[6_{FpOXODVP//DVFLWRFLQDV}

VHFXDQWL¿FDURQFRQODWpFQLFDGH(/,6$XWLOL]DQGRORVSDTXHWHVGH5 '6\VWHPV4XDQWLNLQH®_+XPDQ,)1

aQ~PHURGHFDWiORJR',)

\HOSDTXHWHGH5 '6\VWHPV4XDQWLNLQH®_{+XPDQ,/Q~PHURGHFDWiORJR'SDUDFXDQWL¿FDUOD,/}

5HVXOWDGRVHOHVWXGLRHOHFWURIRUpWLFRGHOH[WUDFWRWRWDOGHCandida albicansPRVWUySULQFLSDOPHQWHXQSpSWLGRGHDN'DDSUR[LPD

GDPHQWHDOFXDOVHOHDWULEX\HODHVWLPXODFLyQGHODUHVSXHVWDLQPXQLWDULDWLSR7+(VFODUDODREVHUYDFLyQGHODDOWDSURGXFFLyQGH,1)a

SRUODV&0+DFWLYDGDVSRUORVSpSWLGRVGHOH[WUDFWRWRWDOGHCandida albicansTXHHVPD\RUDODSURGXFFLyQGH,1)aSURSRUFLRQDGDSRU

ODHVWLPXODFLyQGH&0+FRQ3+$\FRQORVSpSWLGRVSXUL¿FDGRVGHOPHGLRGHFXOWLYRGHOPLVPRPLFURRUJDQLVPR(OSpSWLGRSXUL¿FDGRGH PHGLRHVWLPXODODSURGXFFLyQGH,/HQFRQFHQWUDFLRQHVUHSUHVHQWDWLYDVDXQTXHQRPX\DOWDVDODVKRUDVGHDFWLYDFLyQ\DODV KRUDVSDUDHOH[WUDFWRWRWDO

&RQFOXVLyQORVSpSWLGRVGHOH[WUDFWRWRWDOGHCandida albicansVRQPX\H¿FLHQWHVHQODDFWLYDFLyQGHFpOXODVPRQRQXFOHDUHVKXPDQDV in vitroSDUDODSURGXFFLyQGH,1)a\WDPELpQHVWLPXODODSURGXFFLyQGH,//RVSpSWLGRVGHOH[WUDFWRWRWDOGHCandida albicans son FDSDFHVGHHVWLPXODUODIRUPDFLyQ\DFWLYDFLyQGHFpOXODV7&'+.

3DODEUDVFODYHFDQGLGLQDCandida albicans.

ABSTRACT

%DFNJURXQG&DQGLGLQLVDWRWDOH[WUDFWREWDLQHGIURPCandida albicans,DQGDFRPELQDWLRQRIERWKVXUIDFHDQGLQWHUQDOSURWHLQIRUWKH

VWXG\RILQWUDGHUPDOUHDFWLRQRIODWHK\SHUVHQVLWLYLW\,WKDVEHHQVKRZQWKDWC. albicansRULWVGLIIHUHQWDQWLJHQVVWLPXODWHO\PSKRF\WH

SUROLIHUDWLYHUHVSRQVHin vitro6HYHUDOVWXGLHVDERXWWKHPDMRUPDQQRSURWHLQVFRPSRQHQWVRIC. albicansLPSOLFDWHGLQLPPXQRPRGXODWLRQ

RIKRVWGHIHQVHVZHUHFDUULHGRXW$SURWHLQRIN'D03LVSUHVHQWLQDFLGH[WUDFWZKLFKLVWKHSULPDU\WDUJHWRQZKLFKLVPRXQWHG DUHVSRQVHE\7FHOOV

2EMHFWLYH7RVWLPXODWHKXPDQPRQRQXFOHDUFHOOVin vitroZLWKSHSWLGHVRIWRWDOH[WUDFWDQGSHSWLGHVVHFUHWHGLQWRWKHFXOWXUHPHGLXPE\ Candida albicansDQGWKHPL[WXUHRIERWK

0DWHULDODQGPHWKRGV7RREWDLQWKHWRWDOH[WUDFW7(RICandida albicans,VWUDLQ$7&&ZDVJURZQLQ6DXWRQPHGLDDWž&IRU

C

andida albicans es una levadura común, co-mensal en animales y humanos y el principal patógeno oportunista de los mismos, causante de la candidiasis en huéspedes inmunodepri-midos.1

(VWHKRQJRFRORQL]DVXSHU¿FLHVPXFRFXWiQHDVGHODV

cavidades oral y vaginal, así como el aparato gastrointesti-nal. La naturaleza y la medida del deterioro de las defensas

GHOKXpVSHGLQÀX\HQHQODPDQLIHVWDFLyQ\VHYHULGDGGH

la infección.2

La candidina es un extracto total obtenido de este

mi-FURRUJDQLVPR\HVODFRQMXQFLyQGHSURWHtQDVGHVXSHU¿FLH

e internas3 _{que se utiliza en reacción intradérmica para el}

estudio de hipersensibilidad tardía.4

En diversos estudios se ha demostrado que C. albicans

o sus diferentes antígenos estimulan la respuesta prolife-rativa de linfocitos in vitro, esto depende en gran parte del grado de compatibilidad genética entre las células presen-tadoras de antígeno y los linfocitos.1 _{La estimulación de}

células mononucleares humanas con los antígenos de C.

albicans resulta en la producción de diferentes citocinas,

FRPRHOLQWHUIHUyQJDPPD,1)ȖTXHVHREVHUYDDXPHQ

-WDGRHQDKRUDV5,6 _{además de la interleucina 2 (IL-2).}

A pesar de la importancia reconocida de la inmunidad mediada por células en la respuesta ante infecciones cau-sadas por C. albicans, se han caracterizado muy pocos blancos antigénicos de esta respuesta. Éstos incluyen pro-teínas de choque térmico (heat shock proteins), enolasas y un gran número de manoproteínas, algunas con funciones de adhesinas. La estimulación de macrófagos es un paso crítico para que el sistema inmunitario detecte las leva-duras. Se ha demostrado que los glucanos presentes en la pared celular de C. albicans actúan como ligandos para diferentes receptores llevando a distintas vías de estimu-lación. Los macrófagos humanos responden a C. albicans

por medio del incremento en la producción de factores de complemento y del factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF), y estas funciones, así como la expresión de receptor de complemento tipo 3, son reguladas por el factor transformador de crecimiento

EHWD7*)ȕ/RVPDFUyIDJRVWDPELpQSURGXFHQIDFWRUGH QHFURVLVWXPRUDODOID71)ĮLQWHUOHXFLQDEHWD,/ȕ

e interleucina 6 (IL-6) después de la estimulación in vitro

con aislamientos clínicos de C. albicans muerta por calor. Se han realizado estudios de los principales compo-nentes manoproteicos de C. albicans implicados en la inmunomodulación de las defensas del huésped. Entre los presentes en el extracto ácido se encuentra una manopro-teína de 65 kDa (MP65), que es el principal blanco sobre el que se monta una respuesta por parte de las células T. La respuesta proliferativa estimulada por este componente fue de naturaleza antigénica más que mitogénica, y se dirigió principalmente a los epítopes polipeptídicos. Un constituyente similar se detectó en el material liberado al medio de cultivo por C. albicans. El MP65 tiene un punto /DERUDWRULR GH LPPXQRSRWHQFLDGRUHV 'HSDUWDPHQWR GH

6LVWHPDV%LROyJLFRV8$08QLGDG;RFKLPLOFR

/DERUDWRULRGHPLFRORJtD&HQWUR'HUPDWROyJLFR'U/DGLVODR GHOD3DVFXD6HFUHWDUtDGH6DOXGGHO')

&RUUHVSRQGHQFLD'U$OHMDQGUR3DOPD5DPRV'HSDUWDPHQWRGH 6LVWHPDV%LROyJLFRV8QLYHUVLGDG$XWyQRPD0HWURSROLWDQD8QLGDG ;RFKLPLOFR&DO]DGDGHO+XHVRQ~PFRORQLD9LOOD4XLHWXG &30p[LFR')

&RUUHRHOHFWUyQLFRDOSDOPD#FRUUHR[RFXDPP[ 5HFLELGRDJRVWR$FHSWDGRRFWXEUH

(VWHDUWtFXORGHEHFLWDUVHFRPR3DOPD5DPRV$&DVWULOOyQ5LYHUD /(%HFHUULO3DUUD'(=DPRUD$OYDUDGR5\FRO(VWLPXODFLyQGH FpOXODVPRQRQXFOHDUHVKXPDQDVin vitroFRQH[WUDFWRWRWDO\SpS

WLGRVOLEHUDGRVDOPHGLRSRUCandida albicans'HUPDWRO5HY0H[

QXFOHDUFHOOV0+&ZHUHWDNHQIURPSHULSKHUDOEORRGDQGZHUHSXUL¿FDWHGZLWK/\PSKRSUHSZDVKHGZLWKVDOLQHVROXWLRQDQGPL[HGLQWKH PLGGOHRI530,DGMXVWLQJWR[6_{FHOOVP/&\WRNLQHVTXDQWL¿FDWLRQZDVFDUULHGRXWE\WKH(/,6$WHFKQLTXHXVLQJWKHNLWRI5 '6\VWHPV}

4XDQWLNLQH®_{+XPDQ,)1aQXPEHURIFDWDORJXH',)DQGWKHNLWGH5 '6\VWHPV4XDQWLNLQH}®_{+XPDQ,/QXPEHURIFDWDORJXH'}

5HVXOWV(OHFWURSKRUHWLFVWXG\RIWRWDOH[WUDFWRICandida albicansVKRZHGPDLQO\RQHSHSWLGHRIWRN'DDSSUR[LPDWHO\ZKLFKLV DWWULEXWHGWRWKHVWLPXODWLRQRIWKH7+W\SHLPPXQHUHVSRQVH,WLVDFOHDUREVHUYDWLRQRIWKHKLJKSURGXFWLRQRI,1)aE\0+&DFWLYDWHG E\SHSWLGHVRIWKHWRWDOH[WUDFWRICandida albicansZKLFKLVJUHDWHUWKDQWKHSURGXFWLRQRI,1)aSURYLGHGE\WKHVWLPXODWLRQZLWK3+$ DQGSHSWLGHVSXUL¿HGIURPWKHFXOWXUHPHGLXPRIWKHVDPHPLFURRUJDQLVP0HGLXPSXUL¿HGSHSWLGHVWLPXODWHVWKHSURGXFWLRQRI,/DW UHSUHVHQWDWLYHFRQFHQWUDWLRQVEXWQRWYHU\KLJKDWKRXUVRIDFWLYDWLRQDQGKRXUVIRUWKHWRWDOH[WUDFW

&RQFOXVLRQ3HSWLGHVRIWKHWRWDOH[WUDFWRICandida albicansDUHYHU\JRRGLQWKHDFWLYDWLRQRIKXPDQPRQRQXFOHDUFHOOVin vitroIRUWKH SURGXFWLRQRI,1)a7KH\VWLPXODWHSURGXFWLRQRI,/WRR7KHSHSWLGHVREWDLQHGIURPWKHWRWDOH[WUDFWRICandida albicansFDQVWLPXODWH WKHIRUPDWLRQDQGDFWLYDWLRQRIFHOOV7&'7+.

isoeléctrico de 4.1 y una relación proteína-polisacárido de

/DSUROLIHUDFLyQGHFpOXODVPRQRQXFOHDUHVGHVDQJUH

periférica humana se produjo con dosis de nanogramos de

03SXUL¿FDGR

Las proteínas que se encuentran en el medio de creci-miento in vitro a menudo son llamadas proteínas secretadas o extracelulares. Para alcanzar esta localización, viajan a través de la pared celular donde coexisten con fracciones proteicas ligadas a ésta; por su localización, son proteínas que contribuyen a los componentes proteicos totales de la pared; sin embargo, es razonable considerarlas proteínas asociadas de forma transitoria para ser secretadas pos-teriormente. Diversos componentes de la pared celular que se creía que no eran secretados se han detectado en los sobrenadantes de los cultivos de C. albicans. La relación de algunas de estas fracciones con la estructura de la pared celular no es muy clara. Pueden provenir de las capas más externas de la pared. De manera alterna, es posible que sean liberadas por células que fueron lisadas o como consecuencia de una degradación controlada de la estructura de la pared, requerida para la expansión celular durante el crecimiento. Uno de los criterios usados para

GHPRVWUDU XQD ORFDOL]DFLyQ FHOXODU VXSHU¿FLDO VRQ ORV

ligandos o anticuerpos.2

2%-(7,92

Estimular células mononucleares humanas in vitro con péptidos de extracto total y péptidos secretados al medio de cultivo por Candida albicans y la mezcla de ambos.

MATERIAL Y MÉTODOS

3XULILFDFLyQGHSURWHtQDV

El crecimiento de Candida albicans $7&& VH HIHFWXyHQPHGLRGH6DXWRQGXUDQWHFLQFRGtDVDž&6H

centrifugó y se separó la biomasa del medio; se ajustó al tubo 3 del nefelómetro de McFarland con solución salina

\VHSURFHGLyDODVRQLFDFLyQFLFORVPLQFRQSHULRGRV

de 15 minutos de sonicación por 15 minutos de descanso, lo que se denomina un ciclo. Se realizaron cinco ciclos diarios durante cinco días. Se centrifugó, y al sobrenadante se le precipitaron las proteínas con solución saturada de

VXOIDWRGHDPRQLRGLOX\HQGRFRQODPXHVWUDKDVWDGH

saturación. Se mantuvo durante 24 horas, se centrifugó y se resuspendió el precipitado en 3 mL de agua; después,

VHGLDOL]yFRQWUDDJXDGXUDQWHKRUDVVHFRQJHOyHQXQ XOWUDFRQJHODGRUKRUDV\SRVWHULRUPHQWHVHOLR¿OL]ySRU

otras 24 horas. Se determinó la concentración de proteínas con el método de Lowry y se ajustó el antígeno a una con-centración de 1 mg/mL; a esto se le llamó extracto total. Para obtener los péptidos de medio se partió del culti-vo libre de levaduras, el cual se logró por centrifugación de la biomasa de Candida albicans; las proteínas fueron precipitadas con solución saturada de sulfato de amonio. El procedimiento, a partir de este punto, fue el mismo que para la obtención del extracto total (Figura 1).

2EWHQFLyQ GH FpOXODV PRQRQXFOHDUHV KXPDQDV

(CMH) de sangre periférica

Este original método fue descrito por Boyum. De manera

DVpSWLFDVHWUDQV¿HUHQP/GHVROXFLyQGH)LFROO+\SD

-que (Lymphoprep) a un tubo de centrifugado de 15 mL. Se

PH]FODQP/GHVDQJUHKHSDULQL]DGDRGHV¿EULQDGDFRQ P/GHVROXFLyQ¿VLROyJLFD\VHYLHUWHODVDQJUHGLOXLGD

cuidadosamente sobre los 3 mL del medio a temperatura ambiente en un tubo de centrífuga de 15 mL. Después, se

FHQWULIXJDHOWXERDJDWHPSHUDWXUDDPELHQWHGXUDQWH

DPLQXWRV6HUHWLUDODFDSDGHSODVPDKDVWDDSUR[L

-madamente 2 o 3 mL antes de la capa de mononucleares, y posteriormente también se retira ésta junto con la mitad del

YROXPHQGHOPHGLRGHVHSDUDFLyQUHVWDQWH\VHWUDQV¿HUHQ

a un tubo de centrífuga. Se adiciona un volumen igual de buffer de solución salina a la capa de linfocitos y se

cen-WULIXJDPLQXWRVDWHPSHUDWXUDDPELHQWHDXQDYHORFLGDG VX¿FLHQWHSDUDVHGLPHQWDUVLQGDxDUDODVFpOXODV6HODYDQ

las células nuevamente con el buffer de solución salina y

VHUHVXVSHQGHQHQXQPHGLR530,DMXVWDQGRD6 _cel/mL.

&XOWLYR FHOXODU FRQGLFLRQHV \ FRQFHQWUDFLRQHV

finales de los antígenos

La incubación de células mononucleares humanas (CMH) con el antígeno se realiza en un medio de RPMI

enrique-FLGRFRQVXHURGHWHUQHUDD\PH]FODGHDQWLELyWLFRV

DXQLGDGHVGHSHQLFLOLQD\PJGHHVWUHSWR

-PLFLQDHQFORUXURGHVRGLRDHQDWPyVIHUDSDUFLDOGH

CO₂DDXQDWHPSHUDWXUDGHƒ&WRPDQGRDOtFXRWDV

GHP/GHPXHVWUDDODV\KRUDV 6H FRORFDURQ P/ GH OD VXVSHQVLyQ GH FpOXODV

mononucleares en un pozo de una caja de cultivo de

FpOXODVGHSR]RV'HVSXpVVHFRORFDURQP/GHODV

)LJXUD0pWRGRGHSXUL¿FDFLyQGHSURWHtQDV

Adaptación de Candida albicans (ATCC 10231) a un medio mínimo (caldo Sauton)

Centrifugar y separar la biomasa Precipitación de proteínas

liberadas al medio con solución saturada de sulfato

de amonio (v/v)

Sonicar la biomasa para la rotura de la levadura en

solución salina

Precipitación de proteínas liberadas con solución saturada de sulfato de amonio

(v/v) Diálisis para eliminación de

sales

Liofilización

Ajustar a 1 mg/mL de proteína por el método de Lowry y para realizar

electroforesis

Diálisis para eliminación de sales

Liofilización

Ajustar a 1 mg/mL de proteína por el método de Lowry y para

realizar electroforesis

Preparación de la concentración

SUREOHPDȝJP/HQPHGLR530,

Cultivos celulares con los antígenos. Toma de muestra a las 24, 48, 72 y 96 h.

(/,6$SDUDFXDQWLILFDU,1)γH,/

Obtención de células mononucleares

KXPDQDVUHVXVSHQGLGDVHQPHGLR530,

con 10% de suero de ternera

Preparación de la concentración

SUREOHPDȝJP/HQPHGLR 530,

medio, extracto total o mezcla de ambas muestras, con una

FRQFHQWUDFLyQ;VREUHXQDFDQWLGDGGH[6 _células

PRQRQXFOHDUHVP//DVFRQFHQWUDFLRQHV¿QDOHVSDUDORV

antígenos fueron de 12 mg/mL de péptidos liberados al medio, 12 mg/mL de extracto total, y también se probó en

HOFDVRGHODFXDQWL¿FDFLyQGH,/XQDFRQFHQWUDFLyQGH

36 mg/mL de extracto total. Se utilizaron, como testigo

SRVLWLYR FpOXODV DFWLYDGDV FRQ ¿WRKHPDJOXWLQLQD D XQD FRQFHQWUDFLyQGHPJP/

Western blot

Se llevó a cabo la técnica usando como antígeno a las proteínas del extracto total de Candida albicans (an-teriormente descrito) contra sueros humanos normales (anticuerpo primario), el anticuerpo secundario fue anti-IgG humano hecho en cabra y conjugado con la enzima

($QWL+XPDQ ,J* JFKDLQ VSHFL¿FSHUR[LGDVH

'HYHOR-SHGLQ*RDW$I¿QLWU\LVRODWHGDQWLJHQVSHFL¿FDQWLERG\,

ELISA

Se efectuó la técnica utilizando el paquete de R&D Sys-tems Quantikine® +XPDQ ,)1Ȗ Q~PHUR GH FDWiORJR

',)SDUDFXDQWL¿FDUHO,)1Ȗ\HOSDTXHWHGH5 '

Systems Quantikine® _{Human IL-2, número de catálogo}

'SDUDFXDQWL¿FDUOD,/

5(68/7$'26

El estudio electroforético del extracto total de Candida albicans mostró varios péptidos entre los que destaca un

SpSWLGRGHDN'DDSUR[LPDGDPHQWHDOFXDOVHOH

atribuye la estimulación de la respuesta inmunitaria tipo TH₁,yes esencial enla defensa contra infecciones causadas por este micoorganismo (Figura 2).11

)LJXUD(OHFWURIRUHVLVHQJHOGHSROLDFULODPLGDDGHOH[WUDFWR WRWDOGHCandida albicansHQGRQGHVHPXHVWUDQSpSWLGRVTXHYDQ

GHDN'DDSUR[LPDGDPHQWH(QHOSULPHUFDUULOVHREVHUYDQ ORVHVWiQGDUHVGHSHVRPROHFXODUHQHOVHJXQGRODVSURWHtQDV GHOH[WUDFWRWRWDO

)LJXUD 3pSWLGRV REWHQLGRV GHO PHGLR GH FXOWLYR 6DXWRQ HQ GRQGHWDPELpQUHVDOWDHOSpSWLGRGHDN'DDSUR[LPDGDPHQWH

Posteriormente se realizó la separación de las proteínas secretadas al medio de cultivo por Candida albicans. El medio de Sauton es un medio mínimo esencial que con-tiene sales y glicerina, por lo que las proteínas presentes en el medio de cultivo provienen únicamente del micro-organismo. La electroforesis de estas proteínas se muestra en la Figura 3.

Al realizar la electrotransferencia e inmunodetección (técnica de Western blot), se observó que los anticuerpos IgG provenientes de los sueros humanos normales (SHN) reconocen al péptido de 65 kDa, lo que indica la impor-tancia de su participación en la activación de la respuesta inmunológica (Figura 4).

Para los estudios de activación de células mononuclea-res humanas (CMH) con el uso del extracto total de C.

albicansRVXVSURWHtQDVGHVHFUHFLyQVHFXDQWL¿FDURQODV

FRQFHQWUDFLRQHVGH,1)Ȗ\GH,/HQHOVREUHQDGDQWHGH

los cultivos. Como testigo negativo se utilizaron células solas sin estimular, y como testigo positivo se usaron

FpOXODV HVWLPXODGDV FRQ ¿WRKHPDJOXWLQLQD 3+$ /RV

resultados se muestran en la Figura 5.

La línea roja representa la concentración al doble del

YDORU Pi[LPR D SDUWLU GHO FXDO VH KDFH VLJQL¿FDWLYD OD

concentración evaluada.

Las células sin estimular alcanzan un valor

)LJXUD(OHFWURWUDQVIHUHQFLDHLQPXQRGHWHFFLyQWestern blot XWLOL]DQGRHOH[WUDFWRWRWDOGHCandida albicansHQGRQGHVHDSUHFLD TXHHOSpSWLGRGHN'D3HVUHFRQRFLGRSRUORVDQWLFXHUSRV ,J*GHOVXHURKXPDQRQRUPDO6+1

concentraciones superiores al doble de este valor son

UHSUHVHQWDWLYDV SJP/ \ DO REVHUYDU HO WHVWLJR SRVLWLYRPXHVWUDFRQFHQWUDFLRQHVTXHOOHJDQDSJ P/DODVKRUDVFRQFRQFHQWUDFLRQHVPD\RUHVD

pg/mL desde las 24 horas.

Al estimular células mononucleares humanas con

SpSWLGRVSXUL¿FDGRVGHOPHGLRGHFUHFLPLHQWRGHCandida

albicans (medio Sauton), a una concentración de 12 mg/mL,

VHREVHUYDQFRQFHQWUDFLRQHVDOWDVGH,1)ȖHQORVPHGLRV GHFXOWLYRFRQXQPi[LPRDODVKRUDVGHSJP/ \XQPtQLPRGHSJP/DODVKRUDVFRQEXHQDV

)LJXUD&XDQWL¿FDFLyQGH,1)ȖHQFXOWLYRVGHFpOXODVPRQRQX FOHDUHVKXPDQDVVLQDFWLYDUWHVWLJRQHJDWLYR\FpOXODVPRQRQX FOHDUHV KXPDQDV DFWLYDGDV FRQ ¿WRKHPDJOXWLQLQD 3+$ WHVWLJR SRVLWLYR SRU OD WpFQLFD GH (/,6$ /D OtQHD URMD UHSUHVHQWD OD FRQFHQWUDFLyQDOGREOHGHOYDORUPi[LPRDSDUWLUGHOFXDOVHKDFH VLJQL¿FDWLYDODFRQFHQWUDFLyQHYDOXDGD

Cuando se utiliza extracto total de proteínas a partir de la biomasa de Candida albicans para estimular células mononucleares humanas a una concentración de 12 mg/mL

HQ[6 _{células/mL, se encuentran concentraciones altas}

GH,1)Ȗ)LJXUD

)LJXUD&XDQWL¿FDFLyQGH,1)ȖHQFXOWLYRVGHFpOXODVPRQRQX FOHDUHVKXPDQDVHVWLPXODGDVFRQSpSWLGRVSXUL¿FDGRVGHOPHGLR GH FXOWLYR 6DXWRQ GH FUHFLPLHQWR GHCandida albicans D XQD

FRQFHQWUDFLyQGHPJP/SRUODWpFQLFDGH(/,6$

)LJXUD&XDQWL¿FDFLyQGH,1)ȖHQFXOWLYRVGHFpOXODVPRQRQX FOHDUHVKXPDQDVHVWLPXODGDVFRQSpSWLGRVSXUL¿FDGRVGHOH[WUDFWR WRWDOGHCandida albicansDXQDFRQFHQWUDFLyQGHPJP/SRU ODWpFQLFDGH(/,6$

0

24 horas 48 horas 72 horas 96 horas 100

200 300 400 500 600 700 800 900

Células normales sin estimular Células estimuladas con PHA

pg/mL

FRQFHQWUDFLRQHVDODVSJP/\SJP/

horas de estimulación (Figura 6).

0 100 200 300 400 500 600 700

24 horas 48 horas 72 horas 96 horas

pg

/mL

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

24 horas

pg

/mL

48 horas 72 horas 96 horas

En este caso, se halló una muy buena activación de células mononucleares humanas, ya que los valores de

FRQFHQWUDFLyQGH,1)ȖHQORVPHGLRVGHFXOWLYRDODV SJP/SJP/SJP/\

testigo positivo, se apreció que hay mayor estimulación con los péptidos del extracto total de Candida albicans,

TXHFRQOD¿WRKHPDJOXWLQLQD

/RVYDORUHVHQFRQWUDGRVHQODFXDQWL¿FDFLyQGH,/

HQFXOWLYRVFHOXODUHVHVWLPXODGRVFRQ\VLQPLWyJHQR¿

-WRKHPDJOXWLQLQDVHPXHVWUDQHQOD)LJXUD

)LJXUD&XDQWL¿FDFLyQGH,/SRUODWpFQLFDGH(/,6$HQPHGLR GH FXOWLYR GH FpOXODV PRQRQXFOHDUHV KXPDQDV HVWLPXODGDV FRQ ¿WRKHPDJOXWLQLQD3+$\FpOXODVVLQHVWLPXODU

Se nota la presencia de IL-2 con una concentración

VLJQL¿FDWLYDSJP/DODVKRUDVGHDFWLYDFLyQGHODV FpOXODVPRQRQXFOHDUHVKXPDQDVFRQSpSWLGRVSXUL¿FDGRV

del medio de crecimiento de Candida albicans.

El extracto total se probó de tres maneras: se utilizaron dos concentraciones por separado (36 y 12 mg/mL) y una

PH]FOD GH SpSWLGRV GH H[WUDFWR WRWDO \ SXUL¿FDGRV GHO

medio, a una concentración de 12 mg/mL. Los resultados

HQFRQWUDGRVVHUHVXPHQHQOD)LJXUD

0 50 100 150 200 250

24 horas 48 horas 72 horas 96 horas Células estimuladas con PHA Células sin estimular

pg

/mL

La células sin estimular alcanzan un valor máximo de

SJP/DODVKRUDVSRUORTXHHOGREOHGHHVWHYDORU HV UHSUHVHQWDWLYR SJP/ \ DO REVHUYDU HO WHVWLJR SRVLWLYR¿WRKHPDJOXWLQLQDVHDSUHFLDTXHHVWRVYDORUHV OOHJDQDSJP/DODVKRUDV

Al activar células mononucleares humanas con el

pép-WLGRSXUL¿FDGRGHOPHGLRGHFXOWLYRGHOFUHFLPLHQWRGH Candida albicans, se corrobora buena estimulación para producir IL-2 (Figura 9).

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

24 horas 48 horas 72 horas 96 horas

pg

/mL

)LJXUD&XDQWL¿FDFLyQSRUODWpFQLFDGH(/,6$GHODSURGXFFLyQ GH,/VHFUHWDGDSRUFpOXODVPRQRQXFOHDUHVKXPDQDVHVWLPXODGDV FRQSpSWLGRVGHH[WUDFWRWRWDO\SpSWLGRVGHPHGLRGHFXOWLYRGH

Candida albicansFRQODWpFQLFDGH(/,6$

)LJXUD&XDQWL¿FDFLyQGH,/SRUODWpFQLFDGH(/,6$HQPHGLR GHFXOWLYRGHFpOXODVPRQRQXFOHDUHVKXPDQDVHVWLPXODGDVFRQSpS WLGRVSXUL¿FDGRVGHOPHGLRGH6DXWRQFUHFLGRFRQCandida albicans.

24 horas 48 horas 72 horas 96 horas 0

20 40 60 80 100 120

36 mcg/mL Extracto total

pg/mL

12 mcg/mL Extracto total

12 mcg/mL Extracto total + péptido de medio

Se halló una secreción de IL-2 en células mononu-cleares humanas estimuladas con péptidos de extracto

WRWDOVyORHQODFRQFHQWUDFLyQGHPJP/SJP/

a las 96 horas, pero no en la concentración de 12 mg/mL. En las células mononucleares humanas estimuladas con

ORVSpSWLGRVGHH[WUDFWRWRWDO\SpSWLGRVSXUL¿FDGRVGHO

medio de cultivo, se observó IL-2 a una concentración

UHSUHVHQWDWLYDGHSJP/DODVKRUDV

',6&86,Ï1

El estudio electroforético del extracto total de Candida

albicansPRVWUySULQFLSDOPHQWHXQSpSWLGRGHDN'D

aproximadamente, al cual se le atribuye la estimulación de la respuesta inmunitaria tipo TH₁, que es esencial enla de-fensa contra infecciones causadas por Candida albicans.11

Es importante contar con un estimulador de estas

cé-OXODVSDUDREWHQHUHO,1)Ȗ\DTXHXQDGHVXVIXQFLRQHV

principales es la activación de macrófagos.12

+D\TXHKDFHUQRWDUTXHORVYDORUHVGH,1)ȖHQFRQWUD

REFERENCIAS

$VKPDQ 5% 3DSDGLPLWULRX -0 3URGXFWLRQ DQG IXQFWLRQ RI F\WRNLQHVLQQDWXUDODQGDFTXLUHGLPPXQLW\WRCandida albicans

LQIHFWLRQ0LFURELRO5HY

&KDI¿Q://ySH]5LERW-/&DVDQRYD0*R]DOER'0DU WtQH]-3&HOOZDOODQGVHFUHWHGSURWHLQVRICandida albicans: ,GHQWL¿FDWLRQIXQFWLRQDQGH[SUHVVLRQ0LFURELRO0RO%LRO5HY

$XVLHOOR&08UEDQL)*HVVDQL66SDJQROL*&HWDO&\WRNLQH JHQH H[SUHVVLRQ LQ KXPDQ SHULSKHUDO EORRG PRQRQXFOHDU FHOOVVWLPXODWHGE\PDQQRSURWHLQFRQVWLWXHQWVIURPCandida albicans,QIHFW,PPXQ

6WUDVV'03UXHEDVFXWiQHDVGLDJQyVWLFDVHQDOHUJLDHLQ PXQRORJtD(GXFDFLyQ0pGLFD&RQWLQXD3251$$, 5. +HQGHUVRQ'&5LSSLQ--6WLPXOXVGHSHQGHQWSURGXFWLRQRI

F\WRNLQHVDQGSWHULQVE\SHULSKHUDOEORRGPRQRQXFOHDUFHOOV ,PPXQRO/HWW

6. 1DND\DPD7,PPXQHVSHFL¿FSURGXFWLRQRIJDPPDLQWHUIHURQ LQKXPDQO\PSKRF\WHFXOWXUHVLQUHVSRQVHWRPXPSVYLUXV ,QIHFW,PPXQ

$XVLHOOR&06SDJQROL*&%RFDQQHUD0&DVDOLQXRYR,HW DO3UROLIHUDWLRQRIKXPDQSHULSKHUDOEORRGPRQRQXFOHDUFHOOV LQGXFHGE\Candida albicansDQGLWVFHOOVZDOOIUDFWLRQV-0HG 0LFURELRO

-RXDXOW70$EHG(O%HKL(0DUWtQH](VSDU]D0%UHXLOK/HW DO6SHFL¿FUHFRJQLWLRQRICandida albicansE\PDFURSKDJHV UHTXLUHV*DOHFWLQWRGLVFULPLQDWHSaccharomyces cerevisiae

DQG QHHGV DVVRFLDWLRQ ZLWK7/5 IRU VLJQDOOLQJ - ,PPXQRO

7RURVDQWXFFL$ %URPXUR & *RPH] 0-$XVLHOOR & HW DO ,GHQWL¿FDWLRQRIDN'DPDQQRSURWHLQDVDPDLQWDUJHWRI KXPDQFHOOPHGLDWHGLPPXQHUHVSRQVHWRCandida albicans. -,QIHFW'LV

/D9DOOH56DQGLQL6*RPH]0-0RQGHOOR)HWDO*HQHUDWLRQ RIDUHFRPELQDQWNLORGDOWRQPDQQRSURWHLQDPDMRUDQWLJHQ WDUJHWRIFHOOPHGLDWHGLPPXQHUHVSRQVHWRCandida albicans. ,QIHFW,PPXQ

.RVRQHQ-/XKWDOD09LDQGHU0.DOLPR.HWDOCandida albicansVSHFL¿F O\PSKRSUROLIHUDWLYH DQG F\WRNLQH ,/ DQG ,)1aUHVSRQVHVLQDWRSLFHF]HPDGHUPDWLWLVV\QGURPH(YL GHQFHRI&'&'DQG&'&'+_{&'UDWLRHOHYDWLRQVin}

vitro([S'HUPDWRO

6WHLQ0.HVKDY6+DUULV1*RUGRQ6,QWHUOHXNLQSRWHQWO\ HQKDQFHVPXULQHPDFURSKDJHPDQQRVHUHFHSWRUDFWLYLW\D PDUNHURIDOWHUQDWLYHLPPXQRORJLFPDFURSKDJHDFWLYDWLRQ-([S0HG

con los péptidos del extracto total de Candida albicans son mucho mayores que los obtenidos por el testigo positivo, que contiene células mononucleares humanas estimuladas

FRQ¿WRKHPDJOXWLQLQDHQGRQGHVHHQFXHQWUDHVWLPXODFLyQ DSDUWLUGHODVKRUDVFRQXQWtWXORGHSJP/KDVWDHO YDORUGHODVKRUDVTXHHVGHSJP/FRQXQYDORU GHOtPLWHGHUHSUHVHQWDWLYLGDGGHSJP/REWHQLGRSRU

el doble del valor encontrado en células sin activar. En las células mononucleares humanas estimuladas con el extracto

WRWDOVHKDOODURQYDORUHVGHSJP/DODVKRUDVGH SJP/DODVKRUDVHLQFOXVRGHSJP/DODVKRUDV PiVGHOGREOHGHORTXHHVWLPXODOD¿WRKHPDJOXWLQLQD3+$

/RVSpSWLGRVSXUL¿FDGRVGHOPHGLRGHFXOWLYRWDPELpQ

demuestran buenos resultados en la activación de células

PRQRQXFOHDUHV KXPDQDV SDUD OD SURGXFFLyQ GHO ,1)Ȗ SJP/DODVKRUDVKDVWDSJP/DODVKRUDV

aunque sus valores no son tan altos como en el caso del extracto total.

En la producción de la IL-2, el testigo positivo (células

PRQRQXFOHDUHV KXPDQDV HVWLPXODGDV FRQ ¿WRKHPDJOX

-WLQLQDRWRUJDYDORUHVDOWRVLQFOXVRGHSJP/DODV KRUDVFRQXQYDORUGHUHSUHVHQWDWLYLGDGGHSJP/

obtenido por el doble del valor encontrado en células

VLQDFWLYDU(OSpSWLGRSXUL¿FDGRGHOPHGLRHVWLPXODFRQ

concentraciones representativas, aunque no muy altas, a las 24 horas de activación. El extracto total activa su

SURGXFFLyQSHURKDVWDODVKRUDVDOPH]FODUORFRQORV

péptidos secretados al medio de cultivo.

&21&/86,Ï1

Los péptidos del extracto total de Candida albicans son

PX\H¿FLHQWHVHQODDFWLYDFLyQGHFpOXODVPRQRQXFOHDUHV

humanas in vitroSDUDODSURGXFFLyQGH,1)ȖH,//RV