Estandarización y perfil genético de Vitis vinífera L var, “Red Globe

Texto completo

(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE. CI A. S. BI. OL. OG. IC. CIENCIAS BIOLOGICAS. AS. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. CA. DE. CI. EN. “Estandarización y perfil genético de Vitis vinífera L. var, “Red Globe””. TESIS. IO TE. PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE. BIÓLOGO. BI BL. Autor: Br. Pamela Jhasmin Luna Cardoso BIÓLOGO Asesor: Dra. Zulita Adriana Prieto Lara TRUJILLO - PERU. 2015. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. Dr. Orlando Gonzáles Nieves. BI. OL. OG. IC. RECTOR. S. Dr. Rubén Vera Véliz. DE. CI. EN. CI A. VICE-RECTOR ACADÉMICO. CA. Dr. Weyder Portocarrero Cárdenas. BI BL. IO TE. VICE-RECTOR DE INVESTIGACIÓN. Dr. Steban Ilich Zerpa SECRETARIO GENERAL. i. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC. AS. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO. OG. Dr. José Mostacero León. EN. CI A. S. BI. OL. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. Dr. William Elmer Zelada Estraver. BI BL. IO TE. CA. DE. CI. SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. Dr. Freddy Pelaez Pelaez. DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. ii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEL ASESOR. El que suscribe: Dra. Zulita Adriana Prieto Lara, asesor de la presente tesis titulada:. OG. IC. AS. “Estandarización y perfil genético de Vitis vinífera L. var. “Red Globe” ”.. OL. CERTIFICA:. BI. Que ésta ha sido desarrollada, de acuerdo al reglamento establecido por la. S. Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en. CI A. conformidad con su correspondiente proyecto, y que el informe ha sido redactado. CI. EN. acogiendo las observaciones y sugerencias alcanzadas.. Por lo tanto, autorizo a Pamela Jhasmin Luna Cardoso, continuar con el trámite. CA. DE. del reglamento correspondiente.. BI BL. IO TE. Trujillo, Diciembre de 2015. _____________________________ Dra. Zulita Adriana Prieto Lara. iii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC. AS. MIEMBROS DEL JURADO. Dra. Zulita Adriana Prieto Lara. CI A. S. BI. OL. PRESIDENTE. OG. --------------------------------------------. EN. --------------------------------------------. CI. Dra. Fátima Zavala de la Cruz. BI BL. IO TE. CA. DE. SECRETARIO. -----------------------------------------------Mg. Carlos Quijano Jara VOCAL. iv. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN. Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran que. AS. el presente informe de tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales,. OL. OG. IC. siendo aprobado por unanimidad.. BI. --------------------------------------------. S. Dra. Zulita Adriana Prieto Lara. CI. EN. CI A. PRESIDENTE. DE. --------------------------------------------. SECRETARIO. BI BL. IO TE. CA. Dra. Fátima Zavala de la Cruz. -----------------------------------------------Mg. Carlos Quijano Jara VOCAL. v. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. mis. padres. y. hermana,. como. OG. A. IC. AS. DEDICATORIA. OL. agradecimiento a su esfuerzo, amor y apoyo incondicional; tanto moral como. BI. económico durante el desarrollo de la. EN. CI A. S. Tesis.. CI. A mi familia, por su apoyo en cada. DE. momento de mi carrera profesional,. por ser mi motor para salir adelante. IO TE. CA. cada día.. BI BL. A todas aquellas personas que de una u otra forma, colaboraron o participaron en la realización de este trabajo, hago extensivo. mi. más. sincero. agradecimiento y afecto.. vi. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTOS. AS. Agradezco a mi asesora Dra. Zulita Adriana Prieto Lara, por el tiempo y el apoyo brindado en la elaboración y ejecución de este trabajo. Porque gracias a sus consejos y. OG. IC. conocimientos me permitieron sortear dificultades.. OL. A mis profesores, por los conocimientos brindados a lo largo de los años de. BI. estudios, los que pondré en práctica en el desempeño de las labores que tenga que. CI A. S. realizar.. Al personal del Laboratorio de Genética y Biología Molecular, María Fernanda. EN. Rabanal, Linda Sánchez, Mónica Arqueros, así como a mis amigos y compañeros. CI. Marco Quiroz y David Salirrosas que me brindaron apoyo y palabras de aliento para. BI BL. IO TE. CA. DE. continuar la realización de la presente tesis.. vii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:. AS. En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de Grados. IC. y Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra consideración y. OG. criterio, el informe de tesis titulado: “Estandarización y perfil genético de una variedad. Trujillo, Diciembre de 2015. IO TE. CA. DE. CI. EN. CI A. S. BI. OL. de Vitis vinífera L.”, con el propósito de obtener el Título Profesional de Biólogo.. BI BL. Br. Pamela Jhasmin Luna Cardoso. viii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONTENIDO Pág.. vi. Agradecimientos. vii. AS. Dedicatoria. Presentación. IC. Contenido. OG. Lista de Tablas. OL. Lista de Figuras. BI. Resumen. S. INTRODUCCIÓN. CI A. MATERIAL Y MÉTODO 2.1 Material vegetal. EN. 2.2 Extracción de ADN. CI. 2.3 Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR). x xi xii. 1 4 4 4 5. 7. 8. IO TE. RESULTADOS. ix. 7. CA. 2.5 Análisis de datos. DE. 2.4 Electroforesis. viii. 19. CONCLUSIONES. 22. RECOMENDACIONES. 23. BI BL. DISCUSIÓN. 24. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. ANEXOS. 29. ix. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. LISTA DE TABLAS. AS. Tabla 1. Protocolo estandarizado de master mix en base a referencias de tres publicaciones para la amplificación de los microsatélites VVMD5 y. OG. IC. VrZag79 en muestras de hojas de Vitis viinifera var “Red Globe”.. OL. Tabla 2. Temperaturas y tiempos de amplificación estandarizado en base a las. BI. publicaciones citadas para los microsatélites VVMD5 y VrZag79 en. S. muestras de hojas de Vitis vinifera var “Red Globe” en el. CI A. termociclador Veriti (AppliedBiosystems).. EN. Tabla 3. Valores de tamaño de fragmentos PCR para los microsatélites VVMD5. DE. CI. y VrZag79 en Vitis vinifera L. var. “Red Globe”.. Tabla 4. Promedio y desviación estándar de los tamaños de los fragmentos PCR. CA. para los microsatélites VVMD5 y VrZag79 en muestras de hojas de. BI BL. IO TE. Vitis vinifera var “Red Globe”. .. x. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. LISTA DE FIGURAS. AS. Figura 1. ADN total extraído de Vitis vinífera L. var “Red Globe” en gel de. OG. IC. agarosa al 1%.. Figura 2. Amplificación del microsatélite VVMD5 en gel de agarosa al 2%. OL. con bromofenol mixto en gradiente de temperatura: (1) 45°C, (2)50. S. BI. °C y (3)55°C.. CI A. Figura 3. Amplificación del microsatélite VrZag79 en gel de agarosa al 2% en. EN. gradiente de temperatura: (1) 54°C, (2) 55°C y (3) 56°C.. CI. Figura 4. Amplificación del microsatélite VVMD5 en gel de agarosa al 2%.. DE. M: marcador molecular de 100 bp, B: control blanco, 1-10: muestras. CA. de Vitis vinífera L. var. “Red Globe”.. IO TE. Figura 5. Amplificación del microsatélite VrZag79 en gel de agarosa al 2 %. M: marcador molecular 100 bp. B: control blanco. 1-10: muestras de. BI BL. Vitis vinífera L. var. “Red Globe”.. xi. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN. AS. El objetivo del presente trabajo fue estandarizar protocolos para el perfil genético de Vitis vinífera L. var. “Red Globe” con los microsatélites VVMD5 y. IC. VrZAG79. Se realizó la extracción de ADN de hojas jóvenes de Vitis vinífera L. var.. OG. “Red Globe” obtenidas del campamento San José del Proyecto Especial Chavimochic -. OL. Virú; se realizó la PCR con los primers para los microsatélites VVMD5 y VrZag79. El. BI. microsatélite VVMD5 mostró dos bandas en cada individuo, loci monomórfio y tamaño. S. promedio del fragmento PCR fue 213.6 pb y 239.7 pb y con el microsatélite VrZag79,. CI A. una banda única, monomórfica y tamaño del fragmento PCR promedio en 242.2 pb.. BI BL. IO TE. CA. DE. CI. EN. Resultados fueron concordantes con los reportados solo para el marcador VrZag79.. xii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCIÓN. La uva hizo su primera aparición hace aproximadamente 65 millones de años en. AS. Eurasia de dos formas: una que posteriormente se desarrolló para cultivo, V. vinífera. IC. subsp. vinifera y la otra silvestre, V. vinífera subsp. silvestris; domesticada a través de. OG. los años los cultivares fueron clasificados de acuerdo a su producción final, en uva de. OL. vino, uva de mesa y pasas (This et al. 2006). En el siglo XVI la iglesia católica se encargó de expandir los cultivos de Vitis a diferentes regiones del mundo mediante. BI. “cruzadas”, entre los cuales países de Latinoamerica, como el Perú (Huertas, 2004,. CI A. S. Poblete et al., 2011).. Dentro de las variedades introducidas al Perú, se cultiva; quebranta (35.4%),. EN. Italia (23.9%), Gross Colman (10.7%), Red Globe (5.5%), Thompson Seedless (5.4%),. CI. FlameSeedless (4%), y el resto de Borgoña, Alfonso Lavallete, Malbec, Alvilla,. DE. Cardinal y Semillon en área sembrada total (comexperu, 2010; comexperu, 2005) Otras variedades que se distinguen por su rusticidad y resistencia al estrés hídrico son. CA. las variedades llamadas “criollas” (Martínez et al. 2006, Bavestrello-Riquelme et al.. IO TE. 2012).. El cultivo de la vid en el Perú es uno de los productos con mayor crecimiento,. BI BL. siendo el segundo producto en el ranking de exportaciones con 4.453 millones de dólares en uva fresca a china en el 2010 (Comex Peru, 2010). La producción de uva en el Perú se cosecha durante todo el año, esto constituye una ventaja frente a otros países donde disminuye la oferta mundial desde diciembre a. marzo (Comexperu, 2010;. Comexperu, 2005) compitiendo con Colombia, Ecuador y Sudáfrica durante los meses de diciembre y junio (Vergara, 2010). Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Debido a su importancia, no solo en el Perú sino en el mundo se creó una ciencia llamada ampelografía encargada de identificar a las variedades de Vitis vinífera L. usando caracteres morfológicos; pero no es completamente fiable para la identificación. AS. de cultivares y portainjertos, a causa que la planta cambia conforme pasa las etapas de. IC. crecimiento, el fenotipo se ve influenciado por las condiciones climáticas, entre otras. OG. desventajas (Lamboy et al., 1998; Sefc et al., 2001).. OL. Existen casos de sinonimia, es decir muchos nombres para el mismo material, u. BI. homonimias, por motivos de peculiaridades de las variedades o las regiones en las que crecieron ocurre una convergencia de nombre aun siendo diferentes cultivares (This et. CI A. S. al., 2006; Ulanovsky et al., 2002; Rao et al., 2014). El Perú es un país de diferentes dialectos donde los pobladores suelen ponerle un nombre costumbrista a las distintas. EN. variedades de uva de acuerdo a su región causando confusiones en la sinonimia u. CI. homonimias ya existentes entre diferentes variedades (Martinez et al., 2006).. DE. Ulanovsky et al. (2002), fueron unos de los primeros en diferenciación de sinonimias y homonimias de variedades de la vid mediante marcadores moleculares de. CA. ADN. El análisis por microsatélites y RAPDS permite identificar y diferenciar. IO TE. genotipos, diversidad genética, mapeo, estudios poblacionales, medir polimorfismo entre las variedades de Vitis muy relacionadas; para las variedades de Vitis vinífera L.. BI BL. los microsatélites tienen la ventaja de ser altamente polimórficos, ser de locus especifico y altamente discriminativos, estos marcadores son codominantes y es por ello permite discriminar los genotipos homocigotos y heterocigotos (Azofeifa, 2006; Safec et al., 2001). De los microsatélites más importantes para genotipado según la Swiss Vitis Microsatellite Database (SVMD) y la comunidad internacional genética en uva destacan. 2. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. a VVMD5 y VrZAG79, por sus altos niveles de polimorfismo y poder de discriminación y heterocigosidad observada (Castro et al., 2011; Moreno-Sanz et al., 2011). La heterocigosidad observada fue de 1.0 para VrZag79 y de 0.92 para VVMD5. AS. indicando un alto nivel de diversidad genética para las variedades Criollas para estos. OG. IC. loci (Martinez et al., 2006).. OL. En la región La Libertad existen plantaciones de vid para consumo local y de. BI. exportación que requieren evaluación del grado de estabilidad genotípica de las variedades en proceso de propagación, para lo cual es importante el uso de marcadores. CI A. S. moleculares como los microsatélites VVMD5 y VrZAG79 en la var. “Red Globe” de la especie Vitis vinífera, variedad de importancia productiva en diferentes departamentos. EN. del Perú. Siendo el objetivo del presente trabajo estandarizar protocolos para obtener el. BI BL. IO TE. CA. DE. especie Vitis vinífera.. CI. perfil genético con los microsatélites VVMD5 y VrZAG79 en la var. “Red Globe” de la. 3. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MATERIAL Y MÉTODO. AS. 2.1 Material vegetal Un total de dieciocho plantas fueron seleccionadas al azar de cultivares de Vitis. IC. vinífera L.var. “Red Globe” del campamento San José del Proyecto Especial. OG. Chavimochic ubicado en Viru - La Libertad (Anexo 1), de los cuales fueron colectadas. OL. hojas frescas y jóvenes transportadas en un contenedor frio hasta ser congeladas y. BI. preservadas a -80°C en el Laboratorio de Genética y Biología Molecular, Universidad. CI A. S. Nacional de Trujillo.. EN. 2.2 Extracción de ADN. CI. El ADN de cada accesión fue extraído mediante el protocolo de Lamboy et al.. DE. (1998); que consiste en moler la hoja con nitrógeno líquido, el polvillo de la hoja fue transferido rápidamente a un tubo de 1.5 mL, mezclado por inversión con 600 µl de. CA. buffer (Tris, NaCl, EDTA, SDS, PVP, DTT y beta-mercaptenol) y suspendido por 10. IO TE. min. Se retiró la fase resuspendida a otro tubo de 1.5 mL y se agregó la misma cantidad de fase resuspendida por cloroformo se agito y se llevó a la centrifuga refrigerada por. BI BL. 15 min a 13000 rpm a 4°C. Nuevamente se retiró la suspensión y agrego NaCL y se llevó a la centrifuga refrigerada por el mismo tiempo anterior y se retiró el sobrenadante y agrego isopropanol para que precipite para nuevamente llevarlo a la centrifuga refrigerada y retirar el pellet. El pellet fue lavado con etanol al 70% y fue dejado al aire para que evapore. Finalmente el pellet obtenido fue resuspendido en buffer TE. La calidad de extracción del ADN se realizó por medio de electroforesis en un gel de. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. agarosa al 1% en buffer TAE 1X. El gel fue teñido con 4 µl de bromuro de etidio para luego hacer el corrido con una mezcla de 8 µl de ADN extraído y 2 µl de bromofenol mixto (azul de bromofenol y xylencianol) visualizado en un transiluminador ultravioleta. AS. (UV starbiometra) a una intensidad de 80. Se seleccionaron las diez mejores. OG. IC. extracciones de ADN para continuar con la amplificación.. OL. 2.3 Reacción en Cadena de Polimerasa. BI. Se seleccionaron los microsatélites VVMD5 y VrZag79 recomendados para. para. VVMD5. son. F:. CI A. S. tipificar las variedades comerciales de la especie Vitis vinifera , la secuencia de primers CTAGAGCTACGCCAATCCAA, y. para. VrZag79. son. F:. el. R: AGA. EN. TATACCAAAAATCATATTCCTAAA. y. CI. TTGTGGAGGAGGGAACAAACC G, y R: TGC CCCCATTTTCAAACTCCCTTC C. Se realizó la resuspensión de primers a una solución madre de la cual se hizo una. DE. dilución para obtener una solución a una concentración de 20 µM.. CA. Determinación de la hibridación óptima de primers: se realizaron gradientes de. IO TE. temperatura en el termociclador para hallar la temperatura de hibridación (Tm) de cada primer, siendo observadas en un transiluminador UV biostarbiometra (Anexo2).. BI BL. 2.3.1 Estandarización de protocolos master mix. Se consideró los siguientes protocolos para las pruebas de master mix: Protocolo 1a, según Karatas et al. (2007) uso 1x PCR reaction buffer, Mg Cl2 6mM, dNTP mix (0.2mM c/u), Primer F y R 0.5 ul c/u, HotStart taq DNA polymerase 0.25 ul, aforando hasta 12.5 ul con agua MilliQ.. 5. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Protoco 2a, según Jahnke et al. (2009) uso Hot Start Master mix 12.5 ul, Primer F y R 0.2 uM c/u. y de ADN 2 ul.. AS. Protocolo 3a, según el inserto de la taq polimerasa usada (Qiagen) usar 2.5 ul de 10x CoralLoad PCR, 0.5 ul dNTPmix (10mM c/u), Primer F y R según marcador, 0.5 ul. IC. HotStart Taq plus DNA polymerase, la cantidad de ADN y Rnase-free wáter son. OG. variables.. OL. 2.3.2 Estandarización de temperaturas y tiempos de amplificación. BI. Protocolo 1b, según Cuhna et al. (2010) realizó 35 ciclos de amplificación, 95. CI A. S. °C y 5 min para la desnaturalización seguido de 95°C, 20 segundos, temperatura de hibridación 55 °C por 30 segundos, luego 72°C por 30s y 72° por 5 min para VVMD5. EN. y VrZag79.. CI. Prtocolo 2b, según Nookaraju & Agrawal (2012) usaron 35 ciclos para el. DE. microsatélites VVMD5 con una temperatura de desnaturalización de 94°C por 5 min seguido de 94 °C por 30 s con una temperatura de hibridación de 45 °C por 45 s y. CA. finalizando con 72 °C por 7 min.. IO TE. Protocolo 3b, según Poblete et al. (2011), aplico 35 ciclos para el microsatélite. VrZag79 con temperatura de desnaturalización es de 95 °C por 5 min seguido de 95°C. BI BL. por 45 s y temperatura de hibridación de 56 °C por 45s finalizando con 72 °C por 7 min.. 6. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.3.3. Aplicación de protocolos estandarizados de master mix, temperaturas y tiempos de amplificación.. AS. Se continuó con las condiciones de amplificación estandarizadas para volumen total de 25 ul. Se utilizaron para la preparación del master mix una cabina de trabajo UV SCIE-PLAS 4PC GLE-UVSC (Anexo 3) y para la Programación de. IC. para PCR. OG. amplificación se usó un Termociclador Veriti (AppliedBiosystems) (Anexo4).. OL. El producto PCR obtenido aplicando el protocolo estandarizado fue almacenado. BI. en una congeladora vertical a -20 °C (Anexo 5).. CI A. S. 2.4 Electroforesis. Se tomó 5 µl de producto amplificado por reacción y se analizaron en un gel de. EN. agarosa al 2 % con 4 µl bromuro de etidio, en Buffer TAE 1X. Se utilizó un marcador. CI. de peso molecular Sigma de 100 pb. La electroforesis fue llevada a cabo en cámara. DE. horizontal a 100 V por 30 minutos. Posteriormente, el gel fue observado en UV Bio-. IO TE. CA. Rad ChemiDoc XRS (Anexo 6) para la lectura de geles.. 2.5 Análisis de datos. BI BL. Se consideró como homocigotos a los genotipos por la presencia de una sola. banda por locus, tanto para el microsatélite VVMD5 como pàra VrZag79.. 7. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS. Se seleccionaron las 10 mejores extracciones de ADN, que se muestran. AS. enumeradas en la figura 1. La temperatura óptima para la hibridación de primers del. IC. microsatélite VVMD5 fue 45ºC (Fig. 2) y para el microsatélite VrZag79 fue 55ºC (Fig.. OG. 3).. OL. El protocolo estandarizado para el master mix fue para un volumen de 25 ul se usó tanto para los microsatélites VVMD5 y VrZag79, 2.5 ul de 10x CoralLoad PCR. BI. Buffer (Anexo 7), 0.5 ul de dNTPmix (10mM c/u), 1 ul de cada primer (forward y. S. reverse), 0.125 de HotStart Taq plus DNA polymerase, 16.875 de agua ultrapura y 3 ul. , 1x PCR reaction Buffer y HotStart Master mix adecuando así a las. EN. adicionar. CI A. de ADN. Los constituyentes y cantidades del master mix ajustadas para 25µl difieren en. DE. CI. condiciones de laboratorio como se muestra en la tabla 1.. El protocolo estandarizado para las temperaturas y tiempos de PCR vario de. CA. temperatura de hibridación para cada microsatélite como se menciona anteriormente,. IO TE. siendo el protocolo estándar de 95 °C durante 5 minutos la temperatura de desnaturalizacion, 94 °C , 1 minuto la temperatura de iniciación; la temperatura de hibridación durando 1 minuto con su temperatura correspondiente de acuerdo al. BI BL. microsatélite, 72 °C durante 1 minuto como temperatura de extensión y como temperatura de extensión final 72 °C por 10 minutos, diferenciándose de los otros autores en la temperatura de desnaturalizacion, temperatura de hibridación y tiempo de extensión final como se puede ver en la tabla 2.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Los loci VVMD5 y VrZag79 amplificaron en las diez muestras tomadas de Vitis vinífera L. var. “Red Globe”. El microsatélite VVMD5 amplificó dos bandas para las 10 muestras (Fig. 4), y el microsatélite VrZag79 amplificó una sola banda para las 10. AS. muestras (Fig. 5). Ambos loci amplificaron entre 200 a 300 pares de bases (Tabla 3) con. IC. un promedio para el marcador VVMD5 la banda de migración rápida fue 213.6 ± 1.43 y. BI BL. IO TE. CA. DE. CI. EN. CI A. S. BI. OL. OG. la de migración lenta 239.7 ± 7.76 y para el VrZag79 de 242.2 ± 3.01 (Tabla 4).. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) EN. CI A. S. BI. OL. OG. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CI. Figura 1. ADN total extraído de Vitis vinífera L. var “Red Globe” en gel de agarosa al. BI BL. IO TE. CA. DE. 1%.. 10. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) DE. CI. EN. CI A. S. BI. OL. OG. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Figura 2. Amplificación del microsatélite VVMD5 en gel de agarosa al 2%. con. CA. bromofenol mixto en gradiente de temperatura: (1) 45°C, (2)50 °C y. BI BL. IO TE. (3)55°C.. 11. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) DE. CI. EN. CI A. S. BI. OL. OG. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CA. Figura 3. Amplificación del microsatélite VrZag79 en gel de agarosa al 2% en gradiente. BI BL. IO TE. de temperatura: (1) 54°C, (2) 55°C y (3) 56°C.. 12. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) OG. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. OL. Tabla 1. Protocolo estandarizado de master mix en base a referencias de tres publicaciones para la amplificación de los microsatélites VVMD5 y VrZag79. CI A. S. BI. en muestras de hojas de Vitis viinifera var “Red Globe”. Componentes. Jahnke et al. (2009). + + 0.8 µl 1 µl 1 µl 0.25 Aforar hasta 25 µl 2 µl. + 1 µl 1 µl 2 µl. DE. HotStart Taq plus PCR Handbook – inserto (2010) 2.5 µl 0.5 µl + + 0.125 µl + +. IO TE. CA. Adicional 1x PCR reaction Buffer dNTP mix HotStart Master mix Primer F Primer R HotStart taq plus DNA Agua ultra pura ADN. 2.5 µl 0.5 µl 1 µl 1 µl 0.125 µl 16.875 µl 3 µl. CI. 10 x CoralLoad PCR Buffer. Karatas et al. (2007). EN. Master Mix estandarizado. BI BL. +: Presencia -: Ausencia. 13. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) OL. OG. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 2. Temperaturas y tiempos de amplificación estandarizado en base a las. BI. publicaciones citadas para los microsatélites VVMD5 y VrZag79 en. CI A. S. muestras de hojas de Vitis vinifera var “Red Globe”.. Estandarización de temperaturas y tiempos de amplificación 35 ciclos 95 °C, 5’ 94 °C, 1’ 45°C / 55°C, 1’ 72 °C, 1’ 72 °C, 10’. Nookaraju & Agrawal (2012). Poblete et al. (2011). 35 ciclos 95 °C, 5’ 95 °C, 20s 55°C , 30s 72 °C, 30s 72 °C, 5’. 35 ciclos 94 °C, 5’ 94 °C, 30s 45 °C *, 45 s 72 °C, 2’ 72 °C, 7’. 35 ciclos 95 °C, 5’ 95 °C, 45s 56 °C**, 72 °C, 90 s 72 °C, 7’. DE. IO TE. CA. N° de ciclos T° de desnaturalización Tº de iniciación T° de hibridación T° extensión T° de extensión final. Cuhna et al. (2010). CI. EN. Condiciones de amplificación. BI BL. *: Temperatura de hibridación del microsatélite VVMD5 **: Temperatura de hibridación del microsatélite VrZag79 : La misma temperatura para ambos microsatélites. 14. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) CA. DE. CI. EN. CI A. S. BI. OL. OG. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IO TE. Figura 4. Amplificación del microsatélite VVMD5 en gel de agarosa al 2%. M: marcador molecular de 100 bp, B: control blanco, 1-10: muestras de Vitis. BI BL. vinífera L. var. “Red Globe”.. 15. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) CI. EN. CI A. S. BI. OL. OG. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DE. Figura 5. Amplificación del microsatélite VrZag79 en gel de agarosa al 2 %. M:. CA. marcador molecular 100 bp. B: control blanco. 1-10: muestras de Vitis. BI BL. IO TE. vinífera L. var. “Red Globe”.. 16. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC. Tabla 3. Valores de tamaño de fragmentos PCR para los microsatelites VVMD5 y. VVMD5. 2. 213:219. 3. 214:238. 240. 4. 242 240. S. BI. OL. 211:240. 238. 216: 242. 240. 216: 244. 242. 7. 213:248. 242. 8. 213:243. 247. 9. 213:242. 244. 10. 213:241. 247. CI A. 214:240. CI. EN. 6. BI BL. IO TE. CA. DE. VrZag79. 1. 5. Alelo (pb). OG. VrZag79 en Vitis vinifera L. var. “Red Globe”.. 17. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) OG. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. OL. Tabla 4. Promedio y desviación estándar de los tamaños de los fragmentos PCR para los microsatélites VVMD5 y VrZag79 en muestras de hojas de Vitis vinifera var. Microsatelite. BI. “Red Globe”.. SD. VrZag79 242.2 3.01. BI BL. IO TE. CA. DE. CI. EN. 1.43 : 7.76. CI A. 213.6 : 239.7. S. VVMD5. 18. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DISCUSIÓN. La técnica PCR en conjunto con los microsatélites para la identificación de. AS. especies de Vitis vinífera L. se ha incrementado en los últimos años, esto se debe a la. IC. alta sensibilidad y precisión de esta técnica, llegando a ser una herramienta útil y. OL. OG. complementaria a otras técnicas de identificación.. Para la ejecución de técnicas moleculares, es importante contar con una buena. BI. calidad y concentración de ADN, ya que es el punto de partida para una correcta. S. reacción de PCR. Es por ello que se debe contar con metodologías de extracción. CI A. adecuadas para obtener estás condiciones. Los resultados obtenidos en el presente. EN. trabajo con el método de extracción de ADN (Fig. 1) descrito por Lamboy et al.. CI. (1998), fueron óptimas que se demuestra con los productos PCR de los marcadores. DE. VVMD5 y VrZag79 (Figura 2 y 3, respectivamente).. CA. Mediante la estandarización del master mix y, temperaturas y tiempos para la PCR se logró hacer la amplificación de las secuencias de los marcadores. Como se. IO TE. puede ver en la tabla 1 y 2 tanto el master mix como la programación para la amplificación han sido adaptados variando la cantidad de primers y ADN comparado. BI BL. con los otros autores Jahnke et al. (2008), Karatas et al. (2007) para el master mix; optamos por seguir las bases del inserto de la taq polimerasa que usaríamos (HotStart Taq DNA plus polimerasa) ya que depende en su mayoría de esta molécula termolábil los resultados de amplificación. No fue necesario adicionar. a la reacción ya que. el buffer usado, 10X CoralLoad PCR Buffer, contiene esta molécula encargada de la activación de la Taq Polimerasa.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En tanto para la programación de ciclos, temperatura y tiempos se observa en la tabla 2 que se respetó y continuo con el número de ciclos (35 ciclos), se comprobó la. AS. temperatura de hibridación para el microsatélite VVMD5 para los autores Nookaraju &. IC. Agrawal, (2012) variando el tiempo de desnaturalización debido a la taq polimerasa. OG. que usamos. Y para el microsatélite VrZag79 se comprobó la temperatura de. OL. hibridación del autor Cuhna et al. (2010), igualmente variando el lapso de tiempo de. BI. desnaturalización a hibridación un grado para mayor estabilidad.. S. Los microsatélites han sido utilizados resaltando esencialmente en estudios de. CI A. variación genética intraespecifica como ejemplo, Vignani et al. (1996); y, Nookaraju y. EN. Agrawal, (2012) dando referencia del microsatélite VVMD5 y para el microsatélite. CI. VrZag79, Regner et al. (2000) y Kosjak et al. (2003); e interespecificas como ejemplo Jahnke et al. (2009) para el microsatélite VrZag79 y Coelho de Souza et al. (2013) para. DE. ambos microsatélites pertenecientes del presente estudio. Dentro de las variaciones. CA. genéticas intraespecificas en el caso de Kosjak et al. (2003) se muestra una variación clonal para 2 de 18 muestras variando en 3 a 4 loci demostrando así la utilidad del. IO TE. análisis de estos marcadores moleculares evitando la mala identificación de estos cultivares incluso en plantas clonadas. En el presente trabajo el microsatélite VVMD5. BI BL. muestra dos bandas para las diez muestras de Vitis vinifera L. var. “Red Globe” (Fig. 4), variando la cantidad de bases como se puede observar en la Tabla 3, siendo el promedio un patrón de 213.6 : 239.7 pares de bases ( Tabla 4).. El locus par VrZag79 fue monomórfico con el fragmento PCR promedio de 256 pb a diferencia de Zulini et al. (2002) que reportó dos loci con 247: 259 pb para la. 20. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. misma variedad Red Globe; es posible que esto se deba a mutaciones en uno de los sitios de restricción del microsatélite VrZag79. No obstante, Coelho de Souza, P. y Yoshimitsu, S. (2011) casi todas sus bandas fueron monomórficas para Vitis labrusca al. OG. IC. “Red Globe” sea el ingreso de la secuencia de una variedad silvestre.. AS. usar RAPD; existiendo la posibilidad que el locus VrZag79 para Vitis vinífera L. var.. Al comparar con otros trabajos, con otras variedades presentes en el Perú, el. OL. microsatélite VrZag79 para “Red Globe” muestra una sola banda de 242.2 bp. Al. BI. cotejar el mismo microsatélite con Italia, Criolla chica, Criolla grande, Negra corriente. S. y otras variedades reportadas por Martinez et al. (2006), variedades presentes en el. CI A. Perú, todas muestran dos bandas. Podría decirse que el microsatélite VrZag79 es clave. BI BL. IO TE. CA. DE. CI. EN. para la identificación de Vitis vinífera L. var. “Red Globe”.. 21. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONCLUSIONES.  Se estandarizo protocolos para el perfil genético de Vitis vinífera L. var. “Red. IC. AS. Globe” con los microsatélites VVMD5 y VrZAG79.. OG.  Se estandarizo los componentes y cantidades del Master mix para los. OL. microsatélites VVMD5 y VrZag79.. BI.  Se estandarizó la temperatura de hibridación óptima para los primers VVMD5 y. S. VrZag79, 45°C y 55°C respectivamente, así como las temperaturas y tiempos de. CI A. amplificación.. EN.  Los tamaños de los fragmentos amplificados para los microsatélites VVMD5 y. CI. VrZag79, diseñados para la identificación de Vitis vinifera L. fueron 213.6 :. DE. 239.7 y 242.2 respectivamente, concordantes a lo esperado.. CA.  El microsatélite VrZag79 amplifico una sola banda que diferencian a las citadas. BI BL. IO TE. de acuerdo a su origen fue de dos bandas.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RECOMENDACIONES. Se recomienda realizar una secuenciación de los resultados amplificados para. BI BL. IO TE. CA. DE. CI. EN. CI A. S. BI. OL. OG. IC. AS. revelar si presenta alguna mutación.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. Azofeija-Delgado, A. (2006). Uso de marcadores moleculares en plantas;. AS. aplicaciones en frutales del trópico. Agronomia mesoamericana, 17 (2), 221-. OG. IC. 242.. OL. Bavestrello-Riquelme, C., Cavieres, L., Gallardo, J., Ibache, A., Franck, N., Zurita-Silva, A. (2012). Evaluación de la tolerancia a estrés por sequía en cuatro. BI. genotipos naturalizados de vid (Vitis vinífera) provenientes del norte de Chile.. CI A. S. IDESIA, 30 (3): 83-92.. and. geneticrelationships. CI. discrimination. EN. Castro, I., Martin, J.P., Ortiz, J.M., y Pinto-Carnide, O. (2011). Varietal. cultivarsfromtwomajorControlledAppellation. of (DOC). Vitis. vinífera. región. in. L.. Portugal.. CA. DE. ScientiaHorticulturae, 127, 507-514. doi: 10.1016/j.scienta.2010.11.018.. Coelho,. P.,. Damiao,. C.,. Yoshimitsu,. S.. (2013).. Diversity. and. IO TE. geneticrelatednessamonggenotypes of Vitisspp. Usingmucrosatellite molecular. BI BL. markers. Rev. Bras. Fruti., 35(3): 799-808.. Coelho, P., Yoshimitsu, S. (2011). Geneticdiversity in table grapes bases on RAPD and microsatellite. Pesq. Agropec. Bras., 49 (9): 1035-1044.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ComexPeru. (2010).. Versión. online.. Vol. 13.. www.comexperu.org.pe/media/files/revista/Noviembre-. (2010).. Version. online.. Visto. en:. IC. ComexPeru. AS. Diciembre10/index.html.. OG. www.comexperu.org.pe/media/files/revista/Febrero05/producto.pdf. Visitado el. OL. 05 de Febrero.. BI. ComexPeru. Principales actores del Mercado Mundial de la uva de mesa.. CI A. S. www.comexperu.org.pe/media/files/revista/Febrero05/producto.pdf.. P.. (2010).. Theportuguesevitis. vinífera. L.. germplasm:. CI. Fevereiro,. EN. Cunha, J., Teixeira-Santos, M., Veloso, M., Carneiro, L., Eira-Dias, L.,. CA. 25(1):25-37.. DE. geneticrelationsbetween wild and cultivatedvines. Ciencia e Tec. Vitiv.,. Huertas V., L. (2004). Historia de la producción de vinos y piscos en el Perú.. IO TE. Universum, 2 (19), 44-61.. BI BL. Jahnke, G., Korbuly, J., Janos, M., Lakatos, A., Gyorffyne, M. J. Analysis of grapevine (Vitis vinifera L.) varieties by molecular markers.. Kozjak, P., Korosec-Koruza, Z., Javornik, B. (2003). Characterisation of cv. Refosk (Vitis vinifera L.) by SSR markers. Vitis, 42(2), 83-86.. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Lamboy, W., y Alpha, C.G. (1998). Using simple sequence repeats (SSRs) for DNA finger printing germplasm accessions of grape (Vitis L.) species. J. Amer.. AS. Soc. Hort. Sci. 123(2): 182-188.. IC. Martinez, L.E., Cavagnaro, P.F., Masuelli, R.W., Zuñiga, M. (2006). SSR-. OG. basedassessment of geneticdiversity in South American Vitis viníferavarieties.. OL. PlantScience, 170: 1036-1044.. BI. Martinez, L., Cavagnaro, P., Masuelli, R. (2006). Caracterizacion molecular de. S. variedades de vid (Vitis vinífera L.) de calidad enológica por marcadores. P.,. Loureiro,. M.D.,. y. Suarez,. B.. (2011).. CI. Moreno-Sanz,. EN. CI A. microsatelites. Rev. FCA UNCuyo. Tomo XXXVIII (1): 77-86.. Microsatellitecharacterization of grapevine( Vitis vinífera L.) geneticdiversity in (NorthernSpain).. DE. Asturias. ScientiaHorticulturae,. 129,. 433-440.. doi:. CA. 10.1016/j.scienta.2011.04.013.. IO TE. Nookaraju, A., Agrawal, D.C. (2012). Genetic homogeneity of in vitro raised plants o grapevine cv. Crimson Seedless revealed by ISSR and microsatellite. BI BL. markers. South African journal botany, 78: 302-306.. Poblete, I., Pinto, M., de Andres, M.T., y Hinrichsen, P. (2011). Geneticcharacterization of oldgrapevinescollected in oases of the atacama desert. ChileanJournal of Agriculturalresearch, 71 (3), 476- 482.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Rao, V., Narayanaswamy, P., y Srinivasa, B.N. (2014). GeneticDiversityanalysis in grape (Vitis vinífera L) germplasmusingmicrosatellitemarkers. American International Journal of Research in Formal, Applied& Natural Sciences, 6 (1),. IC. AS. 12-18.. OG. Regner, F., Wiedeck, E., Standlbauer, A. (2000). Differentiation and. OL. identification of white Riesling clones by genetic markers. Vitis, 39 (3), 103-. BI. 107.. S. Sefc, K.M., Lefort, F., Grando, M.S., Scott, K.D., Steinkellner, H., y Thomas,. CI A. M.R. (2001). Microsatellitemarkersforgrapevine: a state of the art. Molecular. CI. EN. Biology&Biotechnology of grapevine, 1-30.. This, P., Lacombe, T., y Thomas, M. (2006). Historicalorigins and. DE. geneticdiversity of wine grapes. TRENDS in Genetics, 9 (22), 511-519. doi:. CA. 10.1016/j.tig.2006.07.008.. IO TE. Ulanovsky, S., Gogorcena, Y., Martinez de Toda, F., y Ortiz, J.M. (2002). Use of molecular markers in detection of synonymies and homonymies in grapevines. BI BL. (Vitis vinífera L.). ScientiaHorticulturae, 92, 241-254.. Veloso, M.M., Almadanim, M.C., Baleiras-Couto, M., Pereira, H.S., Carneiro, L.C., Fevereiro, P., Eiras-Dias, J. (2010).Microsatellitedatabae of grapevine (Vitis vinífera) cultivar use forwineproduction in Portugal. Ciencia Tec. Vitiv., 25(2): 53-61. 27. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Vergara, S.A.(2010). Resumen del trabajo “perfil de mercado de la uva fresca de cascas en clombia y Ecuador Junio 2010”. Reporte inteligencia de Mercados,. AS. Gerencia Regional de Agricultura Region La Libertad.. IC. Vignani, R., Bowers, J.E., Meredith, C.P. (1996). Microsatellite DNA. OG. polymorphism analysis of clones of Vitis vinífera “Sangiovese”. Scientia. OL. Horticulturae, 65: 163-169.. BI. Zulini, I., Russo, M., Peterlunger, E. (2002). Genotypingwine and table grape. S. cultivarsfrom Apulia (South Italy) usingmicrosatellitemarkers. Vitis, 41(4): 183-. BI BL. IO TE. CA. DE. CI. EN. CI A. 187.. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) BI. OL. OG. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI BL. IO TE. CA. DE. CI. EN. CI A. S. ANEXOS. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(43) IO TE. CA. DE. CI. EN. CI A. S. BI. OL. OG. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Anexo 1. Cultivos de Vitis vinífera L. var. “Red Globe” del Campamento “San Jose” del. BI BL. Proyecto Especial Chavimochic – Viru; La Libertad.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(44) DE. CI. EN. CI A. S. BI. OL. OG. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI BL. IO TE. CA. Anexo 2. Transiliminador UVstarbiometra de 0 al 100% de intensidad.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(45) CI. EN. CI A. S. BI. OL. OG. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI BL. IO TE. CA. Cabina UV.. DE. Anexo3. Preparación del master mix para los microsatélites VVMD5 y VrZag79 en. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(46) DE. CI. EN. CI A. S. BI. OL. OG. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CA. Anexo 4. Programación para la amplificación en el Termociclador Veriti. BI BL. IO TE. (AppliedBiosystems).. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(47) BI BL. IO TE. CA. DE. CI. EN. CI A. S. BI. OL. OG. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Anexo 5. Almacenamiento de reactivos y moléculas termosensibles en congeladora verticales a -20 ° C.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(48) BI BL. IO TE. CA. DE. CI. EN. CI A. S. BI. OL. OG. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Anexo 6. Fotodocumentador Bio-Rad para observar los geles de agarosa.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(49) AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. OG. Componentes. IC. Anexo 7. Composición del Buffer 10X CoralLoad PCR. OL. Tris-Cl. CI A. Buffer 10X CoralLoad PCR. S. BI. KCl. 15 mM. Gel loading reagent Orange dye Red dye. BI BL. IO TE. CA. DE. CI. EN. pH 8.7 (20 °C). Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(50)