Efecto de los extractos de membrana de merozoitos de plasmodium falciparum sobre la yema de huevo de gallus gallus

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. IC A. FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA E. A. P. DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. O. Q. UI M. TRABAJO DE INVESTIGACIÓN II. Y. BI. Efecto de los extractos de membrana de Merozoitos de. RM. AC. IA. Plasmodium falciparum sobre la yema de huevo de Gallus gallus.. FA. PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE:. BI BL. IO. AUTORES:. TE. CA. DE. BACHILLER EN FARMACIA Y BIOQUÍMICA. CRUZ BUEZA, Fredy. POMA VIDAL, Jorge.. ASESOR. :. Dr. Q.F. Lizardo Cruzado Razco. Trujillo – Perú 2009. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTOS A DIOS Por brindarme su amor, por bendecir mi familia, iluminar y guiar mi vida.. IC A. Por darme la fortaleza y el valor. UI M. para seguir adelante, para superar los obstáculos que pueda encontrar. O. Q. en mi camino.. Y. BI. Por darme la oportunidad de. AC. IA. lograr mi anhelada meta ser. BI BL. IO. TE. CA. FA. DE. Jorge. RM. profesional.. A LA MEMORIA DE MI PADRE EXALTACION POMA Y MI HERMANA MARTHA POMA Por su invalorable amor y sacrificio y quienes desde el cielo guían y me dan fuerza para seguir adelante. Que Dios los tenga en su gloria.. Jorge. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A MI MADRE VICTORIA VIDAL Con mucho amor, respeto y gratitud eterna, para el ser que me dio la vida y supo guiarme por el camino del bien con sus sabios consejos. Por su invalorable amor, sacrificio y comprensión que hizo. IC A. posible mi formación Profesional.. O. Q. UI M. Que Dios te bendiga siempre.. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. Jorge. A. MIS. HERMANOS. EUGENIO, ELENA. quienes. con su ayuda desinteresada me brindaron el apoyo, comprensión y aliento que más necesitaba y con su amor constante pude terminar mi carrera. Gracias por estar siempre a mi lado.. Jorge. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A MI ESPOSA FANNY, quien con su amor y ternura se constituyó uno de los pilares de mi vida. Gracias por estar siempre a mi lado y por darme una razón más para vivir. Siempre te amaré.. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. Jorge. A MI QUERIDO HIJO JOSUE ALESSANDRO quien con su amor y ternura se constituyó en el motor para seguir adelante, para levantarme cada vez que me desplomaba. Gracias por hacer mi vida feliz.. Jorge. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A LOS SEÑORES ANGEL, SU ESPOSA. DORIS. Y. LA. SEÑORA SILMA Por su apoyo incondicional ya que sin Uds. No hubiese cumplido mi mas anhelada. IC A. meta, mi más profundo y sincero. UI M. agradecimiento, respeto y estima, por sus consejos.. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. Jorge. A los Señores Miembros del Jurado: Mi. agradecimiento. por. la. dedicación y ayuda constante en la elaboración de este Informe del trabajo científico tipo II.. Jorge. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A MIS PADRES. LIZ BUEZA QUIÑONES FRANCISCO CRUZ. IC A. TOLENTINO. UI M. Gracias por su amor y apoyo. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. incondicional.. DE. A MIS HERMANOS. BI BL. IO. TE. CA. FERNANDO Y FRANK. A la persona que se convirtió en parte importante de mi familia:. VICTOR VILLANUEVA GOMERO. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A todos mis compañeros y amigos, muy en especial para:. Ivanner, Pamela, Liliana, Manuel, Edgar, Yonel, Carlos,. IC A. Ronald, Lucas, Juan Pablo,. BI. Y. Gracias por el cariño y apoyo demostrado. O. Q. UI M. Milagros, Ivan.. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. a través de los años. Gracias por el amor, amistad y alegría que me das cada día.. Josy. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Agradecemos sinceramente a todas aquellas personas que colaboraron con la. IC A. realización de esta. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. investigación.. Al Dr Lizardo Cruzado Razco, quien con su paciencia, conocimientos, experiencia y apoyo desinteresado hizo posible la culminación de este trabajo, para Ud. nuestro más sincero reconocimiento y admiración.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. JURADO DICTAMINADOR. IC A. PRESIDENTE : Dr. RAMÓN PIMINCHUMO CARRANZA.. : Mg. LIZARDO CRUZADO RAZCO.. MIEMBRO. : Mg. VIRGINIA GONZÁLEZ BLAS.. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. MIEMBRO. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO:. De conformidad con las disposiciones del reglamento interno referente a grados y títulos de la facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, nos es grato someter a vuestra consideración y elevado criterio el presente Informe de. UI M. IC A. Investigación Tipo II.. Q. Efecto de los extractos de membrana de Merozoitos de. Y. BI. O. Plasmodium falciparum sobre la yema de huevo de Gallus gallus.. IA. Es propia la oportunidad para manifestar nuestro más sincero reconocimiento y gratitud. AC. a nuestra Alma Mater y toda su plana docente y administrativa que con su capacidad y. RM. buena voluntad han contribuido decididamente a nuestra formación profesional.. FA. Dejamos a la consideración de los Señores Miembros del Jurado la calificación del. TE. CA. DE. Presente trabajo.. BI BL. IO. Trujillo, 31 de Agosto del 2009.. Cruz Bueza Fredy Luis. Poma Vidal Jorge Luis. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE. Página RESUMEN ……………………………………………………………………. i. UI M. IC A. ABSTRACT …………………………………………………………………. 3. BI. O. Q. INTRODUCCIÓN.......................................................................................... ii. 10. AC. IA. Y. MATERIAL Y MÉTODO………………….………..………..……..………. 18. DE. FA. RM. RESULTADOS…………….……………………………………….…………. 22. TE. CA. DISCUSIÓN……………………………………….…….…………............... 25. BI BL. IO. CONCLUSIONES …………………….……..……………………………... REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…..….………….……………………... 26. ANEXOS ……………………………………………………….……………. 30. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN El objetivo del presente estudio es inducir la formación de anticuerpos específicos IgY en Gallus gallus inmunizadas con extractos de membrana de Merozoitos de Plasmodium falciparum. Se formaron tres grupos de 2 Gallus gallus cada uno; al primer grupo se le inoculó intravenosamente 0.5 mL. de los extractos de membrana de Merozoitos de Plasmodium falciparum. , a otro grupo con 1.0 mL. de los extractos de. IC A. membrana de Merozoitos de Plasmodium falciparum.; habiendo también un grupo. UI M. testigo al que se le inoculo 1.0mL. de Solución Salina Fisiológica. Los huevos fueron. BI. los huevos a partir de los 15 días post inoculación.. O. Q. recogidos diariamente y conservados en refrigeración a 4 oC, se procedió a trabajar con. IA. Y. Se purificó la Ig Y por deslipidación con PBS - Cloroformo y precipitación proteica. AC. fraccionada con sulfato de amonio. Se realizó la evaluación de la concentración de. RM. inmunoglobulina (mg/ml) de la yema de huevo con el método de Brandford.. DE. FA. Se realizo un análisis por western blot, el cual reveló 2 bandas antigénicas con masas. CA. relativas entre 42 y 19 kDa reconocidas por las inmunoglobulinas Ig Y sintetizadas por. TE. los Gallus gallus inmunizadas con los extractos de membrana de Merozoitos de. IO. Plasmodium falciparum. Por la facilidad y la economía de la producción de anticuerpos. BI BL. IgY anti membrana de Merozoitos de Plasmodium falciparum en Gallus gallus se recomienda esta técnica de detección del parasito en sangre de pacientes infectados. Los datos obtenidos en este estudio demuestran la presencia de bandas antigénicas relevantes de los extractos de membrana de Merozoitos de Plasmodium falciparum.. Palabras clave: Yema de huevo, Anticuerpos, Malaria, Plasmodium falciparum, Western blot.. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT. The aim of this study is to induce specific antibody IgY in Gallus gallus immunized with membrane extracts of merozoites of Plasmodium falciparum. Three groups were formed from 2 hens each, the first group was inoculated intravenously 0.5 mL. membrane extracts of Plasmodium falciparum merozoites. , Another group with 1.0 mL.. IC A. membrane extracts of Plasmodium falciparum merozoites., having also a control group. UI M. who is 1.0mL inoculum. physiological saline. Eggs were collected daily and stored in. BI. O. Q. refrigeration at 4 oC, we proceeded to work with eggs from 15 days post inoculation.. IA. Y. Ig Y was purified with PBS deslipidación And - Chloroform and fractional protein. AC. precipitation with ammonium sulfate. We evaluated the immunoglobulin concentration. RM. (mg / ml) of egg yolk with the method of Brandford.. DE. FA. Were analyzed by western blot, which revealed 2 bands with relative masses antigen. CA. between 42 and 19 kDa recognized by the immunoglobulins synthesized by hens For. TE. immunized with the membrane extract of Plasmodium falciparum Merozoite.. IO. facility and economy of the anti IgY antibody production membrane of Plasmodium. BI BL. falciparum Merozoite in egg yolk of Gallus gallus recommend this technique for detecting the parasite in the blood of infected patients. Data from this study demonstrate the presence of significant antigenic bands of membrane extracts of merozoites of Plasmodium falciparum.. Keywords: Egg yolk, antibodies, Malaria, Plasmodium falciparum, Western blot.. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. INTRODUCCIÓN. La malaria (mal aire), conocida también como paludismo (palus = laguna), fiebre intermitente, fiebre de los pantanos, o fiebre palustre es la enfermedad parasitaria más importante por causar anualmente, cerca de 500 millones de casos en 100 países de la tierra; es una enfermedad endémica en el Perú, producida por protozoos. IC A. del género Plasmodium y de transmisión vectorial por mosquitos del género. UI M. Anopheles. En el Perú, la malaria sigue siendo uno de los más importantes. O. Q. problemas para la salud pública por su alta incidencia y por el impacto económico. BI. que produce sobre los limitados recursos estatales y en la economía de las familias. IA. Y. de las comunidades afectadas, por ello, el diagnóstico y tratamiento oportuno de los. AC. casos es una estrategia considerada por la Organización Mundial de la Salud (OMS). DE. FA. RM. como crítica para reducir la morbilidad y mortalidad por esta enfermedad 1,3.. CA. Existen cuatro especies de Plasmodium que causan la enfermedad en el hombre: P.. TE. vivax, P. ovale, P. malariae y P. falciparum. Las tres primeras producen un. IO. paludismo relativamente benigno, pero la cuarta produce un paludismo grave que. BI BL. amenaza la vida del enfermo. Además, con el paso del tiempo, Plasmodium falciparum ha desarrollado resistencia a algunos de los medicamentos utilizados por el ser humano para combatirlo 1.. La manifestación clínica típica del paludismo es el síndrome palúdico; cada 36 horas el paciente presenta escalofríos, proceso febril, nauseas, vómitos e ictericia 1.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La malaria se transmite principalmente por la picadura de la hembra del anofelino que se infecta chupando sangre de reservorios naturales que tienen las formas sexuales del parásito (micro y macrogametocitos). Después de una fase de desarrollo en el mosquito, se trasforman en esporozoítos, que muestran una selectividad particular por las células hepáticas en donde el parásito se desarrolla y genera el esquizonte hepático que en unas dos semanas se rompe, dejando en. UI M. IC A. libertad a miles de merozoitos hepáticos que caen en el torrente circulatorio. 3, 10.. Q. En la actualidad no existe un sistema de prevención contra el paludismo, se ha. BI. O. comprobado que el hombre que vive en aéreas endémicas presenta inmunidad. Y. humoral e inmunidad celular en razón de tal es que el hombre es un reservorio de. RM. AC. IA. los agentes etiológicos 9, 11.. FA. Los anticuerpos inducidos en yema de huevo de Gallus gallus son una interesante. DE. alternativa al uso de anticuerpos mamíferos. Hacia fines del siglo XVIII, el. CA. investigador alemán Klemperer demostró que extractos de yema de huevo. IO. TE. obtenidos a partir de gallinas hiperinmunizadas contra la toxina tetánica, eran. BI BL. capaces de proteger a ratones inoculados con dosis letales de la misma toxina. La yema de huevo también constituye una fuente económica de anticuerpos monoclonales como policlonales dado que los contiene en alta concentración y pueden obtenerse utilizando una sencilla metodología de purificación 7, 8.. La producción de anticuerpos requiere normalmente del uso de animales de laboratorio (conejo, ratón, rata, etc) o de animales de mayor tamaño (cabra, oveja. caballo, etc) Gouelli en 1990, sostuvo que los métodos de obtención de. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. inmunoglobulinas por inmunización de animales de laboratorio como conejos, ratones, cobayos, equinos, cabras, etc. son mas complejos que la producción de los mismos en aves puesto que estos métodos son invasivos y en la mayoría de casos llevan a la muerte del animal. El uso de aves en la producción de anticuerpos policlonales se ha reconocido en las últimas décadas, cobrando mayor demanda hoy. IC A. en día 5.. y. actualmente. se. publican. constantemente. trabajos. sobre. la. Q. décadas. UI M. La importancia del uso de IgY fue tenida en cuenta recién durante las últimas. BI. O. inmunoglobulina de la yema de huevo, describiendo sus propiedades y aplicaciones. AC. IA. Y. en diferentes campos científicos 8.. RM. El sistema inmune de las gallinas, en forma similar al de los mamíferos, está. FA. formado por dos componentes principales; el sistema inmune innato “inespecífico”. DE. y el otro corresponden al sistema de defensa adquirido “especifico”. El sistema. CA. inmune adquirido comprende la respuesta celular y otra humoral, incluyendo esta. BI BL. IO. TE. última a la producción de anticuerpos específicos 7.. En las aves se ha demostrado la existencia de tres clases de Inmunoglobulinas análogas a los de los mamíferos y que se denominan Ig A, Ig M e IgY, sin embargo, ésta última fue incorrectamente denominada Ig G debido a que la función que cumplen y su concentración sanguínea es similar a la de Ig G de los mamíferos; al comparar a la estructura de la inmunoglobulina aviar y mamífera se observan diferencias en la masa molecular, siendo de 180 kDa en las aves y de 160 kDa en. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. los mamíferos, producto de estas diferencias la inmunoglobulina G aviar fue denominada Ig Y. 7.. La Ig Y se transfiere exclusivamente a la yema por un proceso activo mediado por receptores. Esta demora aproximadamente unos 5 días en aparecer en un huevo desde el momento en que es activamente transportada desde la circulación. IC A. sanguínea al ovocito hasta que es puesto por la gallina; sin embargo este periodo. UI M. varía según distintos autores y los anticuerpos específicos séricos pueden aparecer. BI. O. Q. en la yema de los huevos con un retraso de 3 a 4 días 8, 10.. Y. Estructuralmente, la IgY se compone de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas;. AC. IA. estas últimas contienen un dominio variable y cuatro dominios constantes. El peso. RM. molecular es de alrededor de 167.250 Daltons. El punto isoeléctrico varía entre 5,7. FA. y 7,6. La IgY se transfiere activamente desde la sangre a la yema, mediante un. DE. proceso donde están involucrados receptores específicos. En general, las IgM e. CA. IgA se pueden encontrar en la clara del huevo, mientras que la IgY predomina en la. IO. TE. yema, con concentraciones de entre 1 y 3 mg/ml. Existen diferentes métodos de. BI BL. precipitación y cromatográficos para la extracción de IgY a partir de la yema de huevo 8.. La producción de anticuerpos a partir de la yema de huevo de gallinas inmunizadas se convierte en una alternativa hacia la producción de anticuerpos policlonales de mamíferos por las diversas ventajas que presenta. Reconoce proteínas altamente conservadas o péptidos que serian indetectables por conejos hiperinmunizados, por esta razón los anticuerpos IgY serian importantes en test. de diagnostico,. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. inmunoprofiláctico e inmunoterapéutico, se producen en grandas cantidades, no presentan reacciones cruzadas, no activa el sistema del complemento, presenta menor fluorescencia inespecífica tienen afinidad y sensibilidad similares a IgG de mamíferos 7, 18.. Para evaluar la inmunidad en las enfermedades parasitarias se emplean técnicas que. IC A. se basan en la detección de antígenos específicos o de anticuerpos en diversos. y. caracterización. de. fracciones. antigénicas. es. la. Q. análisis. UI M. líquidos biológicos (Roitt et al., 1997). Una de las técnicas más importantes en el. BI. O. Electroinmunotransferencia (Western Blot), que básicamente es un proceso. Y. cualitativo que combina la selectividad de la electroforesis en gel de poliacrilamida,. AC. IA. que permite fraccionar al antígeno, con la sensibilidad de la prueba. FA. DE. formados (Garfín, 1990) 20.. RM. inmunoenzimática, que pone en evidencia los complejos antígeno-anticuerpo. TE. de la electroforesis en gel para separar a las proteínas, con la. IO. resolución. CA. La técnica denominada Western Blot o Inmunoblottiing combina la capacidad de. BI BL. especificidad de la detección inmunológica con los anticuerpos. Asimismo, esta técnica, contribuye a determinar características importantes de los antígenos como su presencia, cantidad, peso molecular relativo de las cadenas polipéptidicas y grado de pureza. El Western Blot es un método para identificar proteínas en una mezcla compleja de proteínas, transfiriendo las proteínas separadas mediante el peso molecular, de un medio gelificado a una membrana de nitrocelulosa de unión de las proteínas para su análisis. 20, 21.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Desde. principios. de. 1990. se. viene. empleando. la. técnica. de. electroinmunotransferencia o Western Blot en el diagnóstico de la cisticercosis, VIH, etc. Esta técnica tiene mayor especificidad que las otras, sin afectar su alta sensibilidad. Una de las técnicas estandarizadas usó antígenos purificados por cromatografía de afinidad, alcanzado una sensibilidad de 98% y una especificidad. IC A. de 100% 22.. UI M. La obtención de anticuerpos específicos es un proceso costoso y complejo, por ello. Q. el interés de probar nuevas alternativas que permitan contar con una fuente práctica. BI. O. y económica de anticuerpos de alta calidad. Aunque casi siempre los anticuerpos. Y. utilizados para los ensayos inmunológicos provienen del suero de animales. AC. IA. inmunizados, existen algunos trabajos en donde se ha utilizado la yema de huevo de. RM. gallinas inmunizadas como fuente para la obtención de anticuerpos, además el uso. FA. de las gallinas para la producción de anticuerpos en contraposición al de mamíferos. DE. representa reducción en el número de animales porque estos producen cantidades. CA. mas altas de anticuerpos (1500 mg de Ig Y por mes) que los mamíferos pequeños. BI BL. IO. TE. (200 mg de IgG por mes) 2, 9.. Puesto que los anticuerpos de Gallus gallus simplemente pueden extraerse de la yema de sus huevos, no es necesario sangrar al ave para obtenerlos. Además de los aspectos referentes al bienestar animal, la cantidad de anticuerpos producida por. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. una gallina es mucho mayor que la cantidad de anticuerpos que pueden obtenerse de los mamíferos pequeños 3, 4.. Por la facilidad y la economía de la producción de anticuerpos IgY anti membrana de Merozoito de Plasmodium falciparum en Gallus gallus se recomienda esta. IC A. técnica de detección del parasito en sangre de pacientes infectados 4.. UI M. Por lo expuesto anteriormente en este trabajo se planteo la siguiente interrogante:. Q. ¿Cuál es el efecto de los extractos de membrana de Merozoitos de Plasmodium. BI. O. falciparum sobre la yema de huevo de Gallus gallus?. Y. En este contexto, surge el presente trabajo de investigación que busca encontrar los. AC. IA. anticuerpos Ig Y en la yema de Gallus gallus contra los extractos de membrana de. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. Merozoitos de Plasmodium falciparum.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. MATERIAL Y MÉTODO. 2.1. MATERIAL 2.1.1.- Material biológico:. . Se utilizaron (6) Gallus gallus de postura de raza Hy line Brown de 40. UI M. IC A. semanas de edad y 1.8 kg de peso y alojadas en jaulas independientes.. . O. Q. Cultivo de extractos de membrana de Merozoitos de Plasmodium. BI. falciparum, proveídos por la Cátedra de Toxicología de la Facultad de. 2.1.2.- Material de laboratorio:. RM. AC. IA. Y. Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo.. Bolsa colectora de sangre.. . Matraz 50, 100, 250 mL.. . Jeringas de 1, 5, 10, 20 mL.. . Mechero.. . Pipetas 1, 5, 10 mL.. DE. CA. TE. IO. BI BL. . FA. . Probeta 100 mL.. . Varilla de vidrio.. . Tubos de ensayo.. . Tubos para cultivo de 10 mL.. . Vasos de precipitación 100, 250, 1000 mL.. . Viales esterilizados.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Autoclave “All American – Mod – 25x”.. . Balanza analítica “ohaus” 0.001g.. . Crioconservador. . Estufa “memmert”. . Centrifuga refrigerada “Universal 320 R”. . Refrigeradora “Moraveco”. . Agitador magnetico “nuova II stire plate”. . Sonicador “transsonic 460/H”. . Cámara electroforética.. . Fuente de poder “BIORAD”. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. . IC A. 2.1.3.- Equipos:. RM. 2.1.4.- Reactivos:. FA.  Solución salina fisiológica (SSF).. CA.  Cloroformo.. DE.  Solución buffer fosfato (PBS) pH: 7.2. IO. TE.  sulfato de amonio (NH4)2 SO4. BI BL.  Albúmina Sérica Bovina  Ampolla de Gentamicina 20mg/2ml  Papel de nitrocelulosa 0.2 mm  Medio de cultivo de plasmodio Waymouth MB 752/1 (Sigma).  N’N’N’N’ – Tetrametiletilendiamina.  Dodecilsulfato de sodio (SDS) al 10%.  2 – mercaptoetanol.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2. Método 2.2.1.- Grupos de animales de experimentación:. . Se utilizaron 6 Gallus gallus de raza Hy Line Brown de 40 semanas y de 1.8 Kg de peso.. Se dividieron en los grupos A, B y C, cada uno conformadas por 2 Gallus. IC A. . O. IA. Y. BI. 2.2.2.- Aislamiento de Plasmodio falciparum.. Q. UI M. gallus. AC. Del cultivo masivo de los extractos de Merozoitos de Plasmodium falciparum. RM. se trasvasó 0.5 ml de sobrenadante y se centrifugó a 3000 rpm por 15. FA. minutos, el precipitado se lavó con agua bidestilada 3 veces y se conservó el. CA. DE. precipitado hasta su uso.. BI BL. IO. TE. 2.2.3.- Preparación del Antígeno para inoculación.. Al precipitado que se obtuvo en el paso anterior se le adicionó 5 ml de ácido Tricloroacético al 10% y se agitó constantemente, luego se dejó reposar por 48 horas. Se centrifugó a 3000 rpm por 10 minutos, se eliminó el ácido sobrenadante, el precipitado se re suspendió con 3 ml de suero fisiológico, luego se trasvasó a viales estériles y se agregó una solución de fenol al 0.5%, se mezcló mediante agitación y se conservó a – 40ºC en el Crio conservador hasta el momento de su uso.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.4.- Inmunización de los grupos de experimentacion:. La inmunización de Gallus gallus se realizó en el Bioterio de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional De Trujillo (UNT), se inmunizaron vía intravenosa, seis (6) Gallus gallus de 40 semanas de edad y. El grupo A (Problema) se le inoculó vía intravenosa 0.5 ml del cultivo. UI M. . IC A. de 1.8 Kg de peso; siendo las dosis para cada subgrupo de:. Q. de extracto de membrana de Merozoitos de Plasmodium falciparum. El grupo B (Problema) se le inoculó vía intravenosa 1 ml del cultivo de. AC. . IA. Y. BI. O. (Antígeno).. RM. extracto de membrana de Merozoitos de Plasmodium falciparum. DE. FA. (Antígeno).. CA.  El grupo C (Control) se le inoculó vía intravenosa 1 ml de Solución. BI BL. IO. TE. Salina Fisiológica (SSF).. 2.2.5 Recolección de los huevos. Se recolectaron los huevos a partir del primer día post inoculación de ambos grupos y se almacenaron a 4 ºC hasta su uso, se trabajó con los huevos recolectados a partir del día 15 post inoculación.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.6 Purificación de la IgY a partir de yema de huevo.. La yema fue removida cuidadosamente y separada completamente de la albumina. Para la remoción de lípidos se empleó el método descrito por Polson (1990), en el que se mezcla un volumen de yema por tres volúmenes de suspensión. IC A. PBS- cloroformo (un volumen de cloroformo por tres volúmenes de PBS pH. UI M. 7.2), la suspensión luego fue sometida a vortex por 5 minutos, posteriormente. Q. centrifugado a 3000 rpm por 15 minutos a 4°C y finalmente, la fase acuosa. BI. O. se recuperó en un tubo nuevo.. de IgY. con Sulfato de. Y. El proceso de purificación con precipitaciones. AC. IA. Amonio por salting-out sobre la fase acuosa recuperada en el proceso. RM. anterior, se adicionó lentamente en agitación constante a 4°C un volumen. FA. igual de solución al 50% de saturación de sulfato de amonio (NH4)2 SO4 en. DE. PBS pH 7.2, la agitación y la temperatura fueron mantenidas sobre la mezcla. CA. final durante toda la noche; al día siguiente, se centrifugó a 4°C por 20. IO. TE. minutos a 3000 rpm, para cosechar el precipitado proteico; el sobrenadante. BI BL. se descarto y el precipitado se reconstituyo en PBS 1X pH 7.2 a un volumen igual al inicialmente tomado de yema; este se precipito nuevamente con una solución al 30% de saturación con (NH4)2 SO4. Este precipitado fue re suspendido y luego éste se sometió a diálisis contra PBS 0.5X Ph 7.2 a 4ºC, realizándose seis cambios de buffer en un período de 24 horas.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.7. Cuantificación de proteínas. La concentración de las proteínas extraídas de la yema de huevo fue determinada por el método de Bradford (1976), usando albúmina sérica bovina como control estándar. La lectura fue. hecha a 595 nm en un. IC A. espectrofotómetro.. Q. UI M. 2.2.8. Identificación de Anticuerpos Ig Y:. Y. BI. O. Ensayo de western blot. AC. IA. Preparación del antígeno: Se prepara la mezcla antigénica que contiene. RM. la membrana del Merozoito de Plasmodium falciparum (Antígeno) con. FA. una solución TRIS – HCl, SDS, Azul de Bromofenol, 10% de Glicerol y. CA. DE. agua ultrapura; fue calentado a 65ºC por 20 minutos. IO. TE. Electroforesis vertical: La solución obtenida en el paso anterior fue. BI BL. colocado sobre la superficie de un gel de poliacrilamida al 12% y fue sometido a corriente constante durante aproximadamente 2 horas en un equipo de electroforesis vertical (Mini Protean II, Bio RAD).. Electroforesis horizontal: Al finalizar la corrida se realizó la transferencia del patrón electroforético hacia una membrana de nitrocelulosa de 0.2 µm, para ello se utilizo un quipo de transferencia. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. (Mini Proten Transfer Unit, Bio RAD) durante 1.5 horas. Posteriormente el papel fue cortado en tiras de 5 mm de ancho.. Elisa (Ensayo por Inmunoabsorcion Ligado a Enzimas): las tiras de nitrocelulosa fueron bloqueadas con una mezcla de leche descremada al 2.5% disuelta en solución salina tamponada con fosfato que contenía. IC A. 0.05% de Tween 20, las cuales fueron incubadas toda la noche a 4ºC con. UI M. las inmunoglobulinas purificadas de los grupos: Testigo, Problema1 y. Q. Problema 2; después se realizaron 3 lavados de 5 minutos cada uno con. BI. O. PBS – Tween20, mas tarde se incubó durante 1.5 horas con el conjugado. Y. enzimático que contenía una Anti IgY de gallina – Peroxidasa. Luego de. AC. IA. otros 3 lavados las tiras fueron incubadas con la solución de sustrato (10. RM. mg de diaminobencidina, 10 µL de H2O2, 30% W/V y 10 mL de. DE. FA. solución salina tamponada).. CA. 2.3 Procedimiento de Recolección de Datos. IO. TE. 2.3.1.- Recolección de Datos. BI BL. Para la determinación de la concentración de proteínas se utilizo el método de Brandford el cual es capaz de determinar proteínas aún en concentraciones muy bajas. Para ello se realizo una curva de calibración con concentraciones conocidas de Albúmina Sérica Bovina, luego se leyeron las absorbancias a 595nm. de las muestras problemas y la muestra testigo, diez valores para cada uno, luego se hizo el análisis estadístico.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Para la técnica de Western blot las bandas antigénicas se mostrarón en papel de Nitrocelulosa en le cual se evidencia las bandas antigenicas para extractos de membrana de Merozoitos de Plasmodium falciparum a un determinado peso molecular.. 2.3.2.- Diseño estadístico:. IC A. Los resultados se reportarán como valor promedio (X), desviación. UI M. estándar, los cuales se compararán con la Prueba t – student y valor de p,. Q. donde p ≥ 0.05 será no significativo (NS), p < 0.05 significativo (S) y p <. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. 0.001 altamente significativo (AS). Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESULTADOS. Los resultados obtenidos en ambos grupos, control y problemas son expuestos en la Tabla y Figura que se muestran a continuación.. Tabla 1: Muestra las concentraciones de proteínas (Método de Brandford) de las IgY. IC A. inducidas a partir del extracto de membrana de Merozoitos de Plasmodium falciparum,. UI M. no se muestran las proteínas obtenidas en el grupo testigo ya que estuvo muy por debajo. BI. O. Q. del rango en la curva de calibración.. IA. Y. Tabla 2: Muestra la comparación del promedio de las concentraciones de proteínas de. AC. las IgY inducidas a partir del extracto de membrana de Merozoitos de Plasmodium. RM. falciparum entre los grupos inmunizados con este antígeno, el grupo al cual no se le. DE. FA. había inmunizado no se comparó estadísticamente debido que es muy evidente la. TE. CA. diferencia con los grupos problemas.. IO. La figura 1: Muestra el corrido sobre el papel de nitrocelulosa del Antígeno (Extracto. BI BL. de Membrana de Merozoito de Plasmodium falciparum), en el cual se encuentra: A: Gallina inoculada con 0.5 mL de Antígeno. B: gallina inoculada con 1.0 mL de Antigeno. C: muestra la gallina inoculada con SSF. D: Marcador de peso molecular.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. TABLA 1: Concentración de proteinas en Yema de Huevo de Gallus gallus inmunizadas con extractos de membrana de Merozoitos de Plasmodium falciparum. y no inmunizadas (metodo de Brandford).. B. C. DIA. (μg/ mL). (μg/ mL). (μg/ mL). 15. 1300. 2600. 16. 1285. 2720. 17. 1300. 2650. 18. 1375. 19. 1400. 20. 1450. 21. 1500. 2750. 1490. 2760. 1510. 2765. 1490. 2760. 24. UI M. ----. BI. O. Q. ----. ----. Y IA AC RM FA. DE. CA TE IO. 23. BI BL. 22. IC A. A. 2680. ----. 2695. ----. 2720. ----------------. A: Yema De Huevo de Gallus gallus inoculadas con 0.5 mL de los extractos de membrana de Merozoito de Plasmodium falciparum. B: Yema De Huevo de Gallus gallus inoculadas con 1.0 mL de los extractos de membrana de Merozoito de Plasmodium falciparum. C: Yema De Huevo de Gallus gallus inoculadas 1.0 mL de Solucion Salina Fisiológica. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla. 2: Comparación del promedio de las concentraciones de proteínas de las IgY inducidas a partir de los extractos de membrana de Merozoitos de Plasmodium. falciparum entre los grupos inmunizados con. este. antígeno.. A. B. “t”. (μg/ mL). SIG. ESTAD.. p. n. 10. 10. PROMEDIO. X. 1410. 2710. DESV. ESTAND. S. 90.46. Y. BI. O. MUESTRA. IA. Q. UI M. (μg/ mL). PRUEBA ESTAD. IC A. PARAMETROS. 30.942. < 0.001. DE. FA. RM. AC. 54.42. TE. CA. P: donde p ≥ 0.05 no significativo (NS), p < 0.05 significativo (S) y p < 0.001. BI BL. IO. altamente significativo (AS).. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A. B. c. d.. (KDa) 97.4 66.2. 45.0. 42 KDa. UI M. 21.5. 14.4. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. 19 KDa. IC A. 31.0. FIGURA 1: Bandas antigénicas de yema de huevo de Gallus gallus testigo (no inmunizada) y Problemas (inmunizadas). con extractos de membrana de Merozoitos de Plasmodium falciparum.. A: Yema de huevo de. Gallus gallus inoculada con 0.5 mL de Antígeno; B: Yema de Huevo de Gallus gallus inoculada con 1.0 mL de antígeno; C: Yema de Huevo de Gallus gallus inoculada con SSF.; D: Marcador de peso molecular.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DISCUSIÓN. El Paludismo o Malaria sigue siendo un importante problema de salud a nivel mundial y nuestro País no es ajeno a esta realidad. En la actualidad hay cada vez una búsqueda más intensa de encontrar anticuerpos para la protección contra la malaria humana. Sin embargo, hasta ahora esta protección es relativamente inestable, y el papel exacto sigue. UI M. IC A. sin estar claro en relación con la variabilidad antigénica de las proteínas del parásito 3, 5.. O. Q. Diferentes métodos de inmunización aplicados en Gallus gallus son reportados en la. BI. literatura. La vía de inoculación aplicada a las aves en este trabajo (I.V.) no causó. IA. Y. ningún malestar, ni proceso inflamatorio, debido a que se respetó un volumen por dosis. RM. AC. moderadamente bajo para la especie5.. DE. FA. El esquema de inmunización empleado en el cual se aplicó solamente una dosis. CA. intravenosa a un volumen de 0,5 mL. y 1.0 mL. de cultivo de Plasmodium falciparum. TE. al grupo problema y de 1ml de solución salina fisiológica (SSF) al grupo control; el. IO. método busca la producción de anticuerpos contra los extractos de membrana de. BI BL. Merozoitos de Plasmodium falciparum.. Separar la yema de la albúmina del huevo garantizó la ausencia de las inmunoglobulinas IgA e IgM. La IgY total obtenida en el estudio fue purificada a partir de yema de huevo por eliminación de las lipoproteínas, utilizando para esto PBS: Cloroformo en la relación 1:3, el cual permite usarlos para removerlos y además tiene la ventaja de no requerir ambientes exigentes, ya que maneja volúmenes bajos de cloroformo. Las inmunoglobulinas de la yema (IgY) fueron aisladas utilizando un procedimiento de. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. precipitaciones fraccionadas con una solución saturada de sulfato de amonio hasta una concentración final de un tercio de saturación. 7, 14. .. La técnica de Western Blot tiene elevada sensibilidad, ya que detecta los complejos antígeno-anticuerpo mediante la técnica de Elisa y también elevada especificidad,. IC A. debido a que fracciona los componentes proteínicos del antígeno 20.. UI M. La tabla 1 muestra la concentración de IgY de los grupos problema (inmunizados con. Q. 0.5 y 1.0 mL.) y testigo (no inmunizado), se encontraron valores altamente. BI. O. significativos, ésto se debe al incremento en la concentración de anticuerpos en el grupo. Y. problema, en comparación con el grupo testigo; además se observa que el grupo al cual. AC. IA. se le inoculo 1.0 mL produjo una concentración de IgY mayor que el grupo al cual se le. FA. RM. inoculo 0.5 mL de extractos de membrana de Merozoito de Plasmodium falciparum.. DE. La tabla 2 muestra diferencias altamente significativas entre los grupos A y B, los. CA. cuales fueron inmunizados con los extractos de membrana de Merozoito de Plasmodium su. IO. TE. falciparum, 0.5 y 1.0mL.respectivamnte. Esto se evidencia debido a que. BI BL. significancia estadística p < 0.001, esto nos indica que a mayor concentración de los extractos de membrana de Merozoito de Plasmodium falciparum, inmunizados a Gallus gallus , son capaces de inducir mayor cantidad de inmunoglobulinas IgY 2,3.. En la figura 1 mediante la prueba de Western blot, se enfrentaron los extractos de membrana de Merozoito de Plasmodium. falciparum (Antigeno) contra la IgY. purificada a partir de la yema de huevo de Gallus gallus, inmunizados con el mismo. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. antígeno. En la muestra testigo no se evidencio ninguna banda proteica esto debido a que en el papel de nitrocelulosa solo se encuentra el antígeno especifico para el Plasmodium falciparum y como en la muestra del testigo no hubo inmunización previa, tampoco hay producción de anticuerpos (IgY) y por lo tanto no ocurre la reacción Antigeno – Anticuerpo; mientras que en las dos muestras problemas se observaron 2 bandas bien nítidas de 19 y 42 KDa aproximadamente, esto se debe a que las. IC A. inmunoglobulinas IgY son capaces de reaccionar con el antígeno en porciones. UI M. especificas evidenció la reacción Antígeno – Anticuerpo además, esto nos permite. Q. concluir que los anticuerpos (IgY) formados por los Gallus gallus y transmitidos a la. BI. O. yema de huevo son especificas para los extractos de membranas de Merozoitos de. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. Plasmodium falciparum..22. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. CONCLUSIONES. 1.- Se concluye que el efecto de los extractos de membrana de Merozoitos de Plasmodium falciparum sobre yema de huevos de Gallus gallus es el de inducir la formación de anticuerpos específicos Ig Y, también se encontró una mayor respuesta. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. inmunológica a mayor dosis de Antígeno administrada.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1. García A., Gallo F.: Producción de Anticuerpos para la detección De IgG de Plasmodium vivax. escuela de microbiología y parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo.2002. pp:20-25. IC A. 2. Herrera S.: LA Malaria: estrategias actuales para el desarrollo de una vacuna. O. Q. UI M. efectiva. 2005 Rev. Academ. Colombiana de ciencia. 29 (113). Pp: 535 – 546.. BI. 3. Cabezas C.: Pruebas rápidas para el diagnóstico de la malaria: Una necesidad en. IA. Y. áreas rurales con limitado acceso al diagnóstico microscópico. Salud Pública.. RM. AC. Instituto Nacional de Salud. Lima. Perú.2006. pp: 79 – 81.. DE. FA. 4. Rangel L., Perera G.: Comparación de dos fuentes biológicas para producir. los. niveles. plasmáticos. de. testosterona.. Laboratorio. de. TE. determinar. CA. anticuerpos destinados al desarrollo de métodos de radioinmunoanálisis para. IO. Endocrinología, Departamento de Reproducción, Facultad de Medicina. BI BL. Veterinaria y Zootecnia. Universidad Nacional Autónoma de México, México, D.F. 2000. Pp: 279- 286.. 5. Pinto J., Barco M.: Obtención de Anticuerpos Policlonales Ig Y Antiparvovirus Canino A Partir De Yema De Huevo De Gallina; Unidad de Investigaciones Agropecuarias (UNIDIA), Microbiología Agrícola y Veterinaria, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá. Colombia. 2005. Pp: 37 – 43.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 6. Contreras V., De Lima A.: Producción y purificación de anticuerpos (IgY) a partir de huevos de gallinas inmunizadas con Epimastigotas de Trypanosoma cruzi. Revista de la Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad de Carabobo. Agosto 2005. Vol. 9 Nº 2. Venezuela. 2005. Pp: 21 – 27.. 7. Chacana P., Terzolo H.: Una introducción a la tecnología IgY, anticuerpos de. IC A. yema de huevo. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria - Estación. Q. UI M. Experimental. Balcarse. Buenos Aires – Argentina. 2003. Pp: 47 – 52.. BI. O. 8. Moreira R.: Tecnología IgY o aplicaciones de los anticuerpos de yema de huevo. RM. AC. Aires. Argentina 2004. pp: 12 – 20.. IA. Y. de gallina. Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuária (INTA). Buenos. FA. 9. Garcia G.: Obtención, purificación y caracterización de anticuerpos policlonales. DE. IgY desarrollados en gallina, dirigidos contra aislamientos colombianos de. TE. BI BL. IO. 451 – 463.. CA. Giardia duodenalis. Instituto Nacional de Salud, Bogotá Colombia. 2005. pp:. 10. Koneman E., Allen S., Janda W., Schreckenberger P. y Winn W.: Diagnóstico microbiológico. Texto y Atlas. 5ta ed. Edit. Médica Panamericana, Madrid. España.1999. Pp: 25 – 41.. 11. Kasper H.: Harrison Principios de Medicina Interna 16º ed. ED: Mac Graw Hill. pp: 6851 – 6886.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 12. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. Washington; D.C. Institute of laboratory Animals Resources; 1996.. 13. Terzolo H., Sandoval V.: Agglutination of hen egg – yolk immunoglobulins (IgY) against Salmonella enteric, serovar enteriditis, Rev. Argentina de. IC A. Microbiologia, 1998; pp: 89 – 92.. UI M. 14. Donald V.: Bioquímica 3ra ed. ED. Panamericana. Buenos Aires - Argentina. BI. O. Q. 2006. Pp: 135 – 166.. Y. 15. Astiasaran I., Martínez J.: Alimentos: Composición y propiedades. 2 ed ED: Mc. RM. AC. IA. Graw Hill Interamericana. Madrid España 2000. Pp 53 – 66.. FA. 16. Scheneider P., Schoone G.: Quantification of Plasmodium falciparum. DE. gametocytes in differential stages of development by quantitative nuclic acid. IO. TE. CA. sequence – based amplification. Biochemical parasitol. 2004; 137. Pp 35 – 41.. BI BL. 17. Pérez C.: Estandarización de la técnica de electroforesis denaturante en gel de poliacrilamida (SDS - PAGE) para el control de calidad de sueros antiofídicos. Informe de internado. Facultad de Farmacia. y Bioquímica. Universidad. Nacional de Trujillo. 2008.. 18. Polson A., Von Wechmar.: Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens. Van Regenmortel. 1980. Pp: 475 – 493.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 19. Wayne. D.: Bioestadística. Base para el análisis de las ciencias de la salud. 4ta ed. ED: Limusa wiley. México – 2004. Pp: 150 – 180.. 20. Anaya E., Montoya I.: Proteínas Inmunodominantes de Brucella Melitensis Evaluados por Western Blot. Soporte [PDF]. [citado 06 Agosto 2009]. INS.1997.. 14(1). –. pp:40. 44.. Disponible. en:. IC A. Rev.Med.Exp.. UI M. http://sisbib.unmsm.edu.pe/BVrevistas/Medicina_Experimental/v14_n1/pdf/a09. BI. O. Q. .pdf. Y. 21. Torres K., Clark E. y col.: Antibody response dynamics to the Plasmodium. AC. IA. falciparum conserved vaccine candidate antigen, merozoite surface protein-1 C-. RM. terminal 19kD (MSP1-19kD), in Peruvians exposed to hypoendemic malaria. FA. transmisión. Soporte[PDF].Fecha de acceso[08de agosto 2009] (173). pp: 1-11.. CA. DE. Disponible en: http://malariajournal.com/content/pdf/1475-2875-7-173.pdf.. IO. TE. 22. Escalante H., Pereda F., Sanchez M. et al.: Pacientes neurológicos del. BI BL. noroeste del Perú con serología positiva por Western Blot a la larva de Taenia solium. Soporte[PDF] Rev.Med.Exp. Perú.2004, 21(2) [citado 08 Agosto. 2009],. p.92-97.. Disponible. en:. <http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S172646342004000200007&lng=es&nrm=iso>. ISSN 1726-4634.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. ANEXOS. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. MEDICION DE LA CONCENTRACION DE PROTEINAS (Método de Brandford). O. Q. proteínas. Abs -. μg/mL. Lectura (Abs). 1. 25. 0.481. 2. 20. 0.446. 3. 15. 0.435. 0.273. 4. 10. 0.4. 0.238. 5. 8. 0.378. 0.216. 6. 6. 0.353. 0.191. 7. 4. 0.302. 0.14. 8. 2. 0.251. 0.089. 9. 0. 0.162. 0. BI B. LI O. FA RM. AC IA. Y. BI. Nº DE TUBO. DE. de. TE CA. Concentración. UI. M. IC. A. CURVA ESTANDAR. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/. Blanco 0.319 0.284.

(43) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. M. IC. A. MEDICION DE LA CONCENTRACION DE PROTEINAS (ANTIGENO –BLANCO. Q. UI. Concentración LECTURA. Abs - Blanco. Dilución. obtenida. ANTIGENO.. 0.387. 0.225. 1 / 1O. 6.75. BLANCO. 0.167. 0.005. 1/200. AC IA. Y. BI. O. CODIGO. BI B. LI O. TE CA. DE. FA RM. 0. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/. Concentración en μg/mL 67.5 0.

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