Cuantificación de artemisinina de las hojas de Artemisia absinthium “ajenjo” mediante el método de espectrofotometría UV Vis
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(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. A Dios, por estar conmigo en cada paso que doy, por fortalecer mi corazón e iluminar mi mente y por haber puesto en mi camino a aquellas. IC A. personas que han sido mi soporte y. UI M. compañía durante todo el periodo de. Q. estudio.. BI. O. A mi madre Rosa Chamache. Y. por ser el pilar fundamental en. FA. RM. AC. IA. todo lo que soy, en toda mi educación, tanto académica, como de la vida, por los ejemplos de. DE. perseverancia y constancia que la. CA. caracterizan. TE. infundado. y. que. siempre.. me. ha. Por. su. BI BL. IO. incondicional. apoyo. perfectamente mantenido a través del tiempo.. Junior Antonio Malca Chamache. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. A. mi. madre. Susana. Muñoz. de. Rodríguez, por su infinito amor y sus sabios consejos que día a día me forjaron y alentaron mi superación, Eres mi máximo. IC A. orgullo y mejor ejemplo que he tenido, tu. UI M. perseverancia fue mi motivación y tu. Q. comprensión mi fuerza de voluntad, TE. RM. AC. IA. Y. BI. O. AMO MAMÁ, gracias por ser mi madre.. FA. A. mi. padre. Agustín. Rodríguez. Florentino, porque siempre fui la niña de. DE. tus ojos y supiste robarme cada sonrisa en. CA. el camino de mi vida, siempre me sostuviste. TE. cuando caí y me ayudaste a levantar,. BI BL. IO. gracias por todo PAPÁ.. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A mis hermanos: Hugo, sé que ahora desde el cielo me guías y cuidas; Fredy, siempre fuiste y serás un ejemplo a seguir; Melisa, mi pequeña rebelde que siempre tuve que guiar. A los tres los amo mucho y a pesar que hay un vacío en mi corazón, tengo la. Q. UI M. IC A. fortaleza de su amor.. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Cecilia Anataly Rodríguez Muñoz. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTO. A Dios y a nuestras familias quienes han sido los pilares más importantes durante la realización de este trabajo.. A nuestra asesora. Dra. Marilú Roxana Soto Vásquez por su tiempo, confianza,. IC A. apoyo, dedicación y conocimientos compartidos para la realización del trabajo de. Q. Y. BI. O. con éxito nuestra tesis.. UI M. investigación y por afianzar nuestra formación profesional logrando que culminemos. AC. IA. Al proyecto Canon minero PIC 01-2014 (Desarrollo de Fitomedicamentos orales para. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. el tratamiento de la malaria a base de Artemisia absinthium y Cinchona pubencens). 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN. Estimados Señores Miembros del Jurado:. En cumplimiento con las disposiciones emanadas del reglamento de Grados y Títulos de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, sometemos. IC A. a vuestra consideración y elevado criterio, la presente Tesis II titulada: Cuantificación de. UI M. artemisinina de las hojas de Artemisia absinthium “ajenjo” mediante el método de. IA. Y. BI. O. Q. espectofometría UV- Vis.. AC. Esperando que el jurado se sirva a calificar este trabajo según su criterio establecido a. RM. pesar de la existencia de alguna deficiencia encontrada durante el desarrollo del presente. CA. DE. FA. trabajo de investigación. BI BL. IO. TE. Trujillo, setiembre del 2018. MALCA CHAMACHE, JUNIOR A.. RODRIGUEZ MUÑOZ, Cecilia A.. AUTOR. AUTOR. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. JURADO DICTAMINADOR. (PRESIDENTE). UI M. IC A. Segundo Guillermo Ruiz Reyes. (MIEMBRO). IA. Y. BI. O. Q. Edmundo Arturo Venegas Casanova. (MIEMBRO). BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. Marilú Roxana Soto Vásquez. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN El objetivo del presente estudio fue cuantificar artemisinina de las hojas de Artemisia absinthium “ajenjo” mediante el método de espectrofotometría UV- Vis, utilizando diferentes métodos de extracción. Se recolectó la especie en estudio del distrito de Otuzco, región La Libertad. Posteriormente, a partir de las hojas desecadas y pulverizadas, se prepararon los extractos con diferentes métodos de extracción: soxhlet, percolación,. IC A. maceración, decocción e infusión. Luego, se realizó la cuantificación de artemisinina con. UI M. el método de espectrofotometría UV- Vis a una longitud de onda de 512 nm, según el. O. Q. método descrito por Sreevidya y Narayana. Las concentraciones de artemisinina (g/100. BI. g de hojas desecadas), según los métodos de extracción fueron: extracción por Soxhlet. IA. Y. (0,433 ± 0,003), extracción por percolación (0,356 ± 0,008), extracción por maceración. AC. (0,180 ± 0,001), extracción por infusión (0,083 ± 0,002), extracción por decocción (0,052. RM. ± 0,002), con diferencias estadísticamente significativas (p<0,05). Se obtuvo mayor. CA. DE. FA. concentración de artemisinina mediante el método de extracción por Soxhlet.. BI BL. IO. TE. Palabras clave: Artemisia absinthium, artemisinina, espectofometría UV- Vis.. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT The aim of the present study was to quantify artemisinin from the leaves of Artemisia absinthium "wormwood" by the UV-Vis spectrophotometry method, using different. IC A. extraction methods. The study species were collected from the district of Otuzco, La. UI M. Libertad region. Next, from the dried and pulverized leaves, the extracts were prepared. Q. with different extraction methods: soxhlet, percolation, maceration, decoction and. BI. O. infusion. Then, the artemisinin quantification was performed with the UV-Vis. Y. spectrophotometry method at a wavelength of 512 nm, according to the method described. AC. IA. by Sreevidya and Narayana. The concentrations of artemisinin (g / 100 g of dried leaves),. RM. according to the extraction methods were: Soxhlet extraction (0.433 ± 0.003), percolation. FA. extraction (0.356 ± 0.008), maceration extraction (0.180 ± 0.001), extraction by infusion. DE. (0.083 ± 0.002), extraction by decoction (0.052 ± 0.002), with statistically significant. CA. differences (p <0.05). The highest concentration of artemisinin was obtained by the. BI BL. IO. TE. Soxhlet extraction method.. Key words: Artemisia absinthium, artemisinin, UV-Vis spectrophotometry. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE. RESUMEN………………………………………………………………………………i. ABSTRACT……………………………………………………………………………ii. INTRODUCION………………………………………………………………01. II.. MATERIAL Y MÉTODO…………………………………………………….08. III.. RESULTADOS……………………………………………………………….15. IV.. DISCUSIÓN…………………………………………………………………..16. V.. CONCLUSIONES…………………………………………………………….21. VI.. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………………22. VII.. ANEXOS……………………………………………………………………….30. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. I.. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I.. INTRODUCCIÓN. Desde la antigüedad, el hombre utilizó diversas plantas para satisfacer sus necesidades básicas como son la alimentación y la curación de enfermedades. Originando de esta manera el interés de algunos por el estudio químico de las plantas, permitiendo la formación de la fitoquímica, una disciplina científica que emplea diversas técnicas que. IC A. le permiten aislar extractos y fraccionarlos sucesivamente hasta obtener metabolitos. O. Q. UI M. secundarios 1, 2, 3.. BI. El uso de las plantas medicinales se ha extendido mucho más allá de las fronteras de las. IA. Y. comunidades nativas por desempeñar un papel importante en el tratamiento y prevención. AC. de enfermedades, originando una fuerte demanda de estos productos. Por otro lado, hoy. FA. RM. en día la mayoría de los fármacos clínicamente eficaces se desarrollan a partir de plantas. DE. medicinales; es por ello, que para facilitar su consumo, se ha desarrollado una floreciente. CA. industria “fitofarmacéutica” , y prolifera como cápsulas, tabletas, extractos, entre otros. BI BL. IO. TE. que han sido preparados a partir de dichas especies vegetales 3, 4, 5.. Aún en muchos lugares del mundo es frecuente el uso de las plantas o de sus principios activos en la terapéutica, como parte de la medicina tradicional; desempeñando un papel esencial en la asistencia sanitaria, especialmente en el ámbito de la atención primaria de salud. Se calcula que los medicamentos tradicionales son utilizados por el 60% de la población mundial y en algunos países están ampliamente incorporados al sistema público de salud 5, 6.. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Aunque no existen datos precisos para evaluar la extensión del uso global de plantas medicinales, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que más del 80% de la población mundial utiliza, rutinariamente, la medicina tradicional para satisfacer sus necesidades de atención primaria de salud. Se tiene que dentro de los países de América que han desarrollado su economía a base de plantas medicinales son por ejemplo. IC A. Brasil, Argentina, Perú y México 7,8.. UI M. La investigación en el campo de la Fitoterapia y la Medicina Tradicional son temáticas. O. Q. importantes en el Perú, país de inmensa riqueza en plantas medicinales, tanto. AC. IA. Y. BI. domesticadas como silvestres con potencial farmacológico 8,9.. RM. Hasta mediados del siglo XX el principal empeño en cuanto a la química de los productos. FA. naturales, siguió siendo el aislamiento y determinación de la estructura de una amplia. DE. gama de compuestos. Resulta claro que se habían establecido los principales tipos. IO. TE. CA. estructurales encontrados en las plantas, denominados metabolitos secundarios 10. BI BL. Entre los metabolitos secundarios aislados de las plantas medicinales se encuentran las lactonas sesquiterpénicas, que son usadas en la medicina tradicional para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y han mostrado diferentes actividades biológicas tales como antimicrobiana, citotóxica, antibacteriana, anticancerígena, antiviral, antifúngica, efectos en el sistema nervioso central y cardiovascular así como su potencia alergénica, y en algunas presentan actividad antimalárica 11,12.. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Este metabolito está presente en familias de plantas angiospermas, sobre todo, en la familia de las Compuestas (Asteraceae), aunque también se encuentran en umbelíferas (Apiaceae), y en menor grado, en escrofulariáceas, aristoloquiáceas y valerianáceas12.. En el Perú, existe una especie de Artemisia absinthium, esta planta pertenece a la familia Asteraceae, se desarrolla generalmente en condiciones semejantes a la Artemisia annua,. IC A. y se e encuentra en zonas de la sierra peruana, aunque también se le encuentra en algunas. O. Q. UI M. zonas de la Costa norte del Perú 8.. BI. El género Artemisia está recibiendo una creciente atención debido a su amplio espectro. IA. Y. biológico y diversidad química de sus constituyentes, como es el caso de la Artemisia. AC. absinthium, los científicos han buscado un tipo de lactona sesquiterpénica, denominada. DE. FA. RM. artemisinina, por su efecto antimalárico 11.. CA. La artemisinina presenta un grupo endoperóxido en la molécula, que demuestra ser. TE. esencial para la actividad esquizotótida y tiene fundamental importancia en el tratamiento. IO. de formas de malaria resistente a la terapia convencional con drogas, como cloroquina y. BI BL. mefloquina. A partir de la artemisinina, ya se han obtenido otros derivados semisintéticos con mayor potencia antimalárica, como el artesunato y el arteméter 12, 13.. Esta lactona sesquiterpénica (artemisinina) resulta específicamente tóxica para el Plasmodium falciparum cuando se introduce in vivo en los eritrocitos infectados, ya que estos contienen elevadas concentraciones de hierro en la molécula de hemoglobina. La generación de radicales libres centrados estructuralmente en carbono, por un mecanismo de transferencia electrónica conduce así a la destrucción del parásito. Estudios más 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. recientes indican que por un mecanismo semejante artemisinina actuaría también sobre células malignas de algunos tumores, incluídos los del cáncer de mama en la mujer 14.. Si bien los principios activos contenidos en las plantas pueden ser extraídos mediante diversas técnicas extractivas o bien pueden ser administrados tal y como se encuentran en la planta desecada o en la planta fresca. A lo largo de la historia de la fitoterapia se ha. IC A. desarrollado diversos métodos de extracción para el mejor aprovechamiento de las. O. Q. UI M. plantas tratadas14, 15.. Y. BI. El método de extracción utilizado depende del tipo de planta que se va a emplear,. AC. IA. concentración de principios activos y de sus propiedades farmacológicas. Es conveniente. RM. también recordar la gran importancia que posee la forma de recolección y conservación. FA. de las plantas, ya que las células vegetales, desde el mismo momento de la recolección,. DE. sufren un cierto número de transformaciones biológicas. Puesto que una incorrecta. CA. recolección y desecación de la planta aumenta la cantidad de productos de degradación. TE. y con ello parte de su calidad, ya que las enzimas que contiene, y que antes favorecían la. BI BL. IO. formación de materias activas, se empiezan a descomponer mediante reacciones de degradación; manifestándose con emisión de olor, modificación del color, etc 14.. Asimismo la calidad de los extractos vegetales biológicamente activos depende principalmente del método de extracción empleado en su obtención. Resulta evidente también que el procedimiento seguido en estos casos se ve reflejado tanto en el rendimiento del compuesto orgánico de interés, como en el de otros metabolitos que. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. pueden en un principio no interesar y que sin embargo, encontrándose presentes en el vegetal, poseen otras potenciales y diversas aplicaciones 15.. Dentro de las operaciones de extracción se encuentran dos grupos: extracción líquidolíquido y extracción sólido-líquido. Esta última consiste en la separación preferencial de uno o más componentes de una mezcla sólida por disolución en un solvente líquido. En. UI M. BI. O. Q. percolación, se suma a éstos la extracción por soxhlet 14.. IC A. la industria farmacéutica los dos procedimientos de extracción básicos son maceración y. IA. Y. En la maceración el principio consiste en que la muestra vegetal, con el grado de finura. AC. adecuada, se pone en contacto duradero con el solvente, además se deben realizar. RM. agitaciones frecuentes a lo largo de varios días, tratando de influenciar el gradiente de. FA. concentración. Al principio de la extracción este gradiente está en el punto máximo, con. DE. el correr de los días, a pesar de la agitación, éste disminuye. Como norma se macera la. IO. TE. CA. muestra vegetal por siete días con agitación frecuente y protegida de la luz solar 13,14.. BI BL. Mientras que en el caso de la percolación, se trata de un proceso de paso, si bien hay una maceración previa el disolvente se renueva de modo continuo y, debido a ello, mantiene el gradiente de concentración lo más alto posible, el disolvente corre de arriba a abajo a través de la capa de droga; el disolvente puro desplaza al que contiene la sustancia extraída sin ser necesario aplicar presión. La calidad del extracto depende, al igual que la maceración, del grado de finura de la muestra vegetal, la velocidad de difusión de las sustancias activas desde la droga al disolvente y en la velocidad de pasaje del disolvente.. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Por otra parte la extracción por Soxhlet, que es un tipo de extracción continua, pues en una de las fases la muestra vegetal se agrega solo al principio, mientras que el solvente de extracción cumple un ciclo de extracción y purificación continua. La purificación se realiza en forma paralela por destilación del solvente, de manera que el sustrato siempre está en contacto con el solvente puro; se utiliza cuando es necesaria una extracción. IC A. exhaustiva de la muestra vegetal 14, 16.. UI M. La demanda mundial por artemisinina, en el tratamiento de la malaria, creció en las dos. Q. últimas décadas, debido a sus ventajas en relación a otros compuestos antimaláricos. La. BI. O. artemisinina tiene acción rápida actuando contra Plasmodium vivax y P. falciparum,. Y. incluso sobre las formas de malaria resistentes al tratamiento con cloroquinas y en casos. AC. IA. de malaria cerebral, es por ello que el presente trabajo de investigación que tiene como. RM. finalidad contribuir con el conocimiento y proporcionar información para elegir el mejor. FA. método de extracción para cuantificar artemisinina de la hojas de Artemisia absinthium. CA. DE. “ajenjo” mediante el método de espectrofotometría UV- Vis.. TE. Por lo cual se planteó el siguiente problema:. IO. ¿Cuáles serán las concentraciones de artemisinina de las hojas de Artemisia absinthium. BI BL. “ajenjo”, mediante diferentes métodos de extracción? Objetivo: Cuantificar artemisinina de las hojas de Artemisia absinthium “ajenjo” mediante el método de espectrofotometría UV- Vis, utilizando diferentes métodos de extracción.. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I.. MATERIAL Y MÉTODO. 2.1 MATERIAL. 2.1.1. Material biológico: Hojas de Artemisia absinthium “ajenjo”, procedentes de la provincia de. IC A. Otuzco, región de La Libertad.. Q. UI M. 2.1.2. Material de vidrio:. Y. BI. O. Uso común en el laboratorio. AC. IA. 2.1.3. Equipos:. Alcoholímetro Cartier GAY- LUSSAC. . Balanza analítica OHAUS GA 200. . Lámpara UV 254-366 nm DESAGA. . Cocina eléctrica FINELY. . Refrigeradora COLDEX. IO. TE. CA. DE. FA. RM. . Estufa MEMMERT. . Molino de cuchillas CORONA. . Balanza triple brazo OHAUS TJ 26II. . Equipo de bomba al vacío.. . Equipo de Sohxlet. . Equipo de Percolación. . Espectofotómetro THERMO modelo GENESSIS 10 UV. BI BL. . 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.1.4. Reactivos:. Agua destilada. . Etanol 70º G. L. . Artemisinina estándar (98% p/p) (Sigma-Aldrich,USA). . Ácido clorhídrico 5 M. . Yoduro de potasio 2%. . Tampón de acetato de sodio 2 M. . Safranina 0.01%. O. Q. UI M. IC A. . Y. BI. 2.2. MÉTODO. AC. Identificación y determinación taxonómica de la especie: Se llevó un. RM. . IA. 2.2.1. Preparación de la muestra:. DE. FA. ejemplar de la especie al Herbarium Truxillense (HUT) para su. CA. identificación y posterior verificación taxonómica según el sistema. Selección de la muestra: El material biológico fue recolectado en la. IO. . TE. filogenético de la especie.. BI BL. provincia de Otuzco, región de La Libertad. La recolección de la especie se realizó por el método convencional o clásico de la herborización, seleccionando el material en el campo y verificando que esté en buenas condiciones.. . Transporte de la muestra: El material recolectado fue transportado en cajas de cartón al laboratorio de Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, en donde se eliminaron las sustancias extrañas presentes en el material vegetal. 8. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. . Lavado de la droga: Luego de la separación de sustancias extrañas, se procedió a lavar el material vegetal con agua potable a chorro.. . Secado de la muestra: Posteriormente después del lavado se procedió a extender la muestra en papel kraft para poder secarlo a temperatura ambiente en un lugar fresco y seco por 24 horas; luego se colocó en bolsas. IC A. hechas de papel kraft y se llevó a la estufa a una temperatura de 40°C,. Molienda de la muestra: Se procedió a realizar la molienda con el molino. Q. . UI M. durante aproximadamente 48 horas.. BI. O. de cuchillas, hasta obtención de un tamaño de partículas adecuada de color. IA. Y. verde con olor característico.. AC. Luego se almacenó adecuadamente en frascos ámbar en un lugar. FA. RM. desprovisto de humedad y luz directa, hasta su posterior utilización.. DE. 2.2.2. Métodos de Extracción 17,18. TE. CA. 2.2.2.1. Extracción por Infusión. BI BL. IO. En un vaso de precipitación de 250 mL, se colocó 200 mL de agua destilada y se llevó a ebullición. Luego se dejó enfriar hasta 90°C y se vertió el agua sobre los 10 g de hojas pulverizadas y se tapó con luna de reloj por 15 min. Finalmente se filtró a través de una bomba al vacío con papel de filtro Whatman # 2 y se completó a volumen de 200 mL con agua destilada. Posteriormente se guardó en frasco de vidrio ámbar. Se repitió el proceso por triplicado.. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.2.2. Extracción por Decocción. En un vaso de precipitación de 250 mL, se colocó 10 g de hojas pulverizadas con 200 mL de agua destilada y se llevó a hervir por 15 minutos. Transcurrido el tiempo se filtró a través de una bomba al vacío con papel de filtro Whatman # 2 y se completó a volumen de 200 mL con agua destilada. Posteriormente. IC A. se guardó en frasco de vidrio ámbar. Se repitió el proceso por triplicado.. UI M. 2.2.2.3. Extracción por Maceración. O. Q. En un balón de 250 mL, se colocó 10 g de hojas pulverizadas, se agregó 200. Y. BI. mL de etanol de 70° GL (Gay Lussac). y se llevó a macerar por 48 horas,. IA. finalmente se filtró a través de una bomba vacío con papel de filtro Whatman. RM. AC. # 2 y se guardó en un frasco ámbar. Se repitió el proceso por triplicado.. DE. FA. 2.2.2.4. Extracción por Percolación. CA. Se pesó 50 g de hojas pulverizadas previamente humectadas con 100 mL de. TE. alcohol de 70°GL. Se colocó en el equipo de percolación con cantidad. BI BL. IO. suficiente de etanol de 70°GL, dejándose macerar por un periodo de 48 h. Pasado el periodo de maceración se percoló a velocidad constante de 20 gotas/min el equivalente a 75% del extracto fluido se guardó en frasco ámbar. Posteriormente se percoló hasta que el ensayo de Baljet realizado a una alícuota del extracto, de negativo y el volumen obtenido se concentró en baño María a cantidad equivalente a 25% del extracto fluido, lo cual se reunió con la primera fracción, obteniéndose un extracto fluido de 50 mL. Finalmente se filtró a través de una bomba al vacío con papel de filtro Whatman # 2 y se guardó en frasco ámbar. Se repitió el proceso por triplicado. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.2.5. Extracción por Sohxhet. Se pesó 10 g de hojas tamizadas y se colocó en un cartucho de papel filtro Whatman # 2, luego se introdujo el cartucho en la cámara extractora del equipo Soxhlet. En el balón del equipo se colocó 250 mL de etanol de 70°GL y se procedió a extraer por 4 horas. Finalmente se filtró a través de una bomba al vacío con papel de filtro. IC A. Whatman # 2 y se guardó en frasco de vidrio ámbar. Se repitió el proceso por. UI M. triplicado.. O. Q. Todos los extractos fueron llevados a concentrar al rotavapor hasta obtener el. Y. BI. 30% de volumen inicial y luego fueron tratados con carbón activado, durante. IA. 1 hora y media y con agitación. Posteriormente el carbón fue eliminado por. RM. AC. filtración al vacío con tierra diatomea (esto es para eliminar impurezas, grasas,. FA. pigmentos). Posteriormente se determinó los sólidos totales de cada extracto,. DE. según su método de extracción.. TE. CA. 2.2.4. Cuantificación de artemisinina por espectrofotometría UV-VIS 17. BI BL. IO. 2.2.4.1. Preparación de la solución estándar Se preparó la solución estándar de artemisinia a una concentración de 1000 µg/mL disuelta en etanol de 96 G.L. 2.2.4.2. Preparación de la curva de calibración A partir de la solución estándar se prepararon las diferentes concentraciones de artemisinina: 10, 20, 30, 40 μg/mL. En 4 fiolas de 10 mL, se colocaron por separado 1 mL de cada concentración de de artemisinina. Luego se añadieron 1 mL de yoduro de potasio al 2% y 1 mL de HCl. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 5 M, se mezclaron suavemente hasta que aparezca el color amarillo que indica la liberación de yodo. Posteriormente se añadiron 0,5 mL de solución de safranina al 0,01% y 2 mL de acetato de sodio 2M. Se agitaron suavemente por 5 minutos, y luego se completaron a volumen con agua destilada. Posteriormente se llevaron a leer al espectrofotómetro a 521 nm. Se repitió el proceso por triplicado.. UI M. IC A. 2.2.4.3. Preparación de la muestra problema. En fiolas de 10 mL, se colocaron 1 mL de cada extracto y se adicionaron 1 mL de. BI. O. Q. yoduro de potasio al 2% y 1 mL de HCl 5 M, se mezclaron suavemente hasta que. Y. aparezca el color amarillo que indica la liberación de yodo. Posteriormente se. AC. IA. añadieron 0,5 mL de solución de safranina al 0,01% y 2 mL de acetato de sodio. RM. 2M. Luego se agitaron suavemente por 5 minutos, y se completaron a volumen. FA. con agua destilada. Posteriormente se llevaron a leer al espectrofotómetro a 521. CA. DE. nm. Se repitió el proceso por triplicado.. TE. 2.2.4.4. Preparación del blanco. BI BL. IO. En una fiola de 10 mL, se colocaron 1 mL de yoduro de potasio al 2%, 1 mL de HCl 5 M, 0,5 mL de solución de safranina O al 0,01% y 2 mL de acetato de sodio 2M. Se agitaron suavemente por 5 minutos, y luego se completaron a volumen con agua destilada. Posteriormente se llevaron a leer al espectrofotómetro a 521 nm. Se repitió el proceso por triplicado.. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.5. Análisis de resultados: Los resultados fueron procesados utilizando el programa estadístico SPSS v. 20.0 y expresados como media aritmética ± desviación estándar. Se determinó la relación entre los grupos mediante la prueba de ANOVA de una vía, donde p<0,05 se. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. consideró como estadísticamente significativo.. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II.. RESULTADOS. Tabla 1. Concentración de Artemisinina de las hojas de Artemisia absinthium, por diferentes métodos de extracción.. Concentración de artemisinina (g/100g hoja desecada). IC A. Método de extracción. UI M. ±D.E.. 0,433 ± 0,003. BI. O. Q. Extracción por Soxhlet. 0,356 ± 0,008. RM. AC. Extracción por Maceración. IA. Y. Extracción por Percolación. 0,083 ± 0,002. DE. FA. Extracción por Infusión. 0,180 ± 0,001. 0,052 ± 0,002. CA. Extracción por Decocción. BI BL. IO. TE. : Promedio de tres repeticiones D.E: Desviación estándar. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III.. DISCUSIÓN. La Artemisia absinthium es importante principalmente por ser una de las fuentes naturales para. la extracción de artemisinina, compuesto antimalárico altamente. efectivo.18 De esta forma, en vista de los beneficios de esta planta, se realizó la cuantificación de artemisinina de las hojas de Artemisia absinthium “ajenjo” mediante. IC A. espectrofotometría UV- Visible, evaluando el rendimiento de los métodos de extracción. UI M. sólido - líquido, para lo cual se procedió a realizar la extracción de artemisinina, mediante. Q. los métodos de extracción de Soxhlet, percolación, maceración, infusión y decocción.12,. Y. BI. O. 14. AC. IA. Entre los métodos empleados, se tiene los de tipo continuo, dentro de ellos, la percolación. RM. y el método de Soxhlet; o de los de tipo discontinuo, dentro de ellos, la decocción,. FA. infusión y maceración. Estos métodos permiten obtener los productos en formas. IO. TE. CA. acción que se recomiende.12,. DE. farmacéuticas adecuadas para su administración oral o externa de acuerdo al lugar de. BI BL. La cuantificación de artemisinina de las hojas de Artemisia absinthium “ajenjo” se realizó mediante espectofometría UV- Visible, para lo cual se leyeron las absorbancias de las muestras, referidos como artemisinina a una longituid de onda de 521 nm, utilizando el método descrito por Sreevidya y Narayana. Este método se fundamenta en que el enlace endoperóxido de la artemisinina en medio ácido, produce peróxido de hidrógeno (H2O2) (Esquema I, anexo 2), el cual reacciona con el yoduro de potasio, para liberar yodo. Este yodo liberado decolora el color rojo de la safranina O, la cual se mide a una longitud de onda de 521 nm (Esquema II, anexo2) 17,19 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En la tabla 1, se observa las concentraciones promedios de artemisinina, según los métodos de extracción, obteniendo los siguientes valores: extracción por Soxhlet (0,433 ± 0,003 g de artemisinina por cada 100 g hoja desecada), extracción por percolación (0,356 ± 0,008 g de artemisinina por cada 100 g hoja desecada), extracción por maceración (0,180 ± 0,001 g de artemisinina por cada 100 g hoja desecada), extracción. IC A. por infusión (0,083 ± 0,002 g de artemisinina por cada 100 g hoja desecada), extracción. UI M. por decocción (0,052 ± 0,002 g de artemisinina por cada 100 g hoja desecada). Estos. O. Q. valores son estadísticamente significativos (p<0.05) (Anexo 4). Lo que nos indica que los. BI. métodos de extracción influyen en la extracción de artemisinina. De todos estos métodos. IA. Y. de extracción el que extrajo mayor cantidad de artemisinina fue la extracción por Soxhlet,. RM. AC. seguido de la extracción por percolación, maceración, infusión y decocción.. DE. FA. Es importante señalar que de acuerdo a otros estudios, se han reportado que dentro de la familia Asteraceae la extracción de sesquiterpenlactonas, como la artemisinina; Barbarie. TE. CA. y col.(2017)19, en su estudio de Cuantificación de Artemisinina, concluyó que el mejor. BI BL. de Soxhlet.. IO. método la extracción de artemisinina en las hojas de Artemisia Annua, fue por el método. Villacorta J. et al (2013), en su estudio de Cuantificación de sesquiterpenlactonas. provenientes de las hojas de Calea urticifolia (Juanislama), obtuvo mejores resultados por el método de Soxhlet 14 ,15.. La extracción por Soxhlet, es un tipo de extracción continua, pues en una de las fases la muestra vegetal se agrega solo al principio, mientras que el solvente de extracción cumple un ciclo de extracción y purificación continua. La purificación se realiza en forma paralela 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. por destilación del solvente, de manera que el sustrato siempre está en contacto con el solvente puro; se utiliza cuando es necesaria una extracción exhaustiva de la muestra vegetal 14. Es por ello que el método de Soxhlet, fue más representativo, además es el método recomendado por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (USEPA) 20-22. UI M. IC A. para la extracción de compuestos orgánicos semi-volátiles y no volátiles.. Q. La percolación, se trata de un proceso de paso, si bien hay una maceración previa el. BI. O. disolvente se renueva de modo continuo y, debido a ello, mantiene el gradiente de. Y. concentración lo más alto posible, el disolvente corre de arriba a abajo a través de la capa. AC. IA. de droga; el disolvente puro desplaza al que contiene la sustancia extraída sin ser. RM. necesario aplicar presión. La calidad del extracto depende, al igual que la maceración, del. FA. grado de finura de la muestra vegetal, la velocidad de difusión de las sustancias activas. CA. DE. desde la droga al disolvente y en la velocidad de pasaje del disolvente 21,22.. IO. TE. El proceso de extracción va incurrir significativamente sobre la actividad biológica de la. BI BL. muestra vegetal, la elección de un método adecuado va a estar influenciada por los factores propios del proceso. Entre los parámetros que afectan el proceso de extracción, se tiene el tipo de disolvente, el volumen de disolventes orgánicos, la duración del proceso de extracción y la temperatura. Uno de los parámetros de mayor importancia en la extracción es el disolvente, dado que, su naturaleza determina la eficiencia del proceso en términos de la solubilidad de los compuestos de interés y la penetrabilidad en las partículas de la muestra19, 22.. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En el caso de las metodologías de extracción con diferentes solventes se tiene que Cafferata L y Jeandupeux R., en su estudio Extracción con solventes de artemisinina y otros metabolitos de Artemisia annua, obtuvieron mejores resultados con los métodos de extracción continua como son el método de Soxhlet y Percolaciòn, asimismo se evidencia que los solventes orgánicos tienen mayor capacidad de extracción, aunque el agua extrajo. IC A. en poca cantidad 19,22.. UI M. Puesto que, en la estructura de la artemisinina, se encuentra un puente de peróxido y un. O. Q. anillo δ-lactona, generando una polaridad débil y una solubilidad relativamente alta en el. BI. disolvente de polaridad media, en este caso el etanol. Pero la diferencia polar de los. AC. IA. Y. solventes es solo uno de los factores que afectan el comportamiento de disolución.17, 21,23. RM. El método de extracción de tipo discontinuo se tuvo que la maceración, fue más. FA. representativa, en comparación con la infusión y la decocción. En el proceso de extracción. DE. mediante el método de maceración, se trabajó a temperatura ambiente y con agitación. CA. mecánica a fin de incrementar el proceso de difusión de la muestra vegetal desde la. IO. TE. superficie a la solución 23.. BI BL. Asimismo en la infusión se trabajó con agua a temperatura próxima a la ebullición, luego se colocó el material vegetal y dejó enfriar conjuntamente hasta temperatura ambiente, mientras, que en la decocción se colocó en contacto el material vegetal con el solvente y en conjunto se lleva a ebullición durante 15 -30 min, aunque este va a depender de las características del material vegetal, es menor para material vegetal blando (hojas, flores, etc.) y mayor para material vegetal duro (corteza, semillas, etc.) 23, 24. El agua, si bien extrae artemisinina, lo hizo de forma lenta debido a su reducida solubilidad, y en caso de periodos prolongados extrae otros metabolitos, mientras, el. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. etanol, es la que definitivamente resulta de mejor aplicación práctica para la obtención de artemisinina, debido a que el etanol tiene mayor capacidad extractiva que el agua16, 25,26. Dado que el proceso de extracción incide significativamente sobre la actividad biológica, la elección de una técnica adecuada supone una decisión importante, la cual está supeditada a los factores propios del proceso y cómo la técnica de extracción proporciona. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. beneficios para su optimización 26,27.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. V.. CONCLUSIÓN. 1. Se obtuvo una mayor concentración de artemisinina (0,433 ± 0,003 g/100 g de hojas desecadas) de las hojas de Artemisia absinthium “ajenjo”, extraídas por el método de Soxhlet, seguida de extracción por percolación (0,356 ± 0,008 g/100. IC A. g de hojas desecadas), extracción por maceración (0,180 ± 0,001 g/100 g de hojas. UI M. desecadas), extracción por infusión (0,083 ± 0,002 g/100 g de hojas desecadas),. Q. extracción por decocción (0,052 ± 0,002 g/100 g de hojas desecadas),. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. evidenciado mediante el método de espectrofotometría UV- Vis.. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
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(38) BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. ANEXOS. IC A. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 1. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. Constancia de la Identificación Taxonómica de la Artemisia absinthium. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 2. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. Reacción Química para la cuantificación de artemisinina. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 3. Curva de calibración de artemisinina. 0.120 y = 0.0021x + 0.0137 R² = 0.9998. IC A Q. UI M. 0.080. BI. O. 0.060. IA. Y. Absorbancia (521nm). 0.100. RM. AC. 0.040. DE. FA. 0.020. CA. 0.000. 10 20 30 40 Cocentración de artemisinina (µg/mL). 50. BI BL. IO. TE. 0. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 4. Análisis Estadístico Descriptivos VAR00002. 95% del intervalo de confianza para la media N. 1. Desviación estándar. Media. Error estándar. Límite inferior. Límite superior. Mínimo. Máximo. .433000. .0026458. .0015275. .426428. .439572. .4310. .4360. 2. 3. .356000. .0078102. .0045092. .336598. .375402. .3510. .3650. 3. 3. .181000. .0010000. .0005774. .178516. .183484. .1800. .1820. 4. 3. .082667. .0015275. .0008819. .078872. .086461. .0810. .0840. 3. .052000. .0020000. .0011547. .047032. .056968. .0500. .0540. 15. .220933. .1552760. .0400921. .134944. .306922. .0500. .4360. UI M. Y. BI. O. Total. Q. 5. IC A. 3. VAR00002. 10. .338. 14. FA. .000. .084. 5598.423. Sig. .000. .000. DE. 4. F. CA. .337. RM. Media cuadrática. gl. BI BL. IO. TE. Entre grupos Dentro de grupos Total. Suma de cuadrados. AC. IA. ANOVA. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(43) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 5. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. Imágenes de la preparación de la muestra. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(44) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 6. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. Imágenes de la extracción por Maceración. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(45) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 7. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. Imágenes de la extracción por Sohxlet. 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(46) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 8. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. Imágenes de la extracción por Percolación. 36 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(47) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 9. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. Preparación de la muestra y estándar para su lectura. 37 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
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