Validación del método elisa para la determinación cuantitativa de antígeno prostático específico como prueba diagnóstica en el laboratorio Quintanilla S R L de la ciudad de Trujillo

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. ESCUELA DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. FA. RM. AC. IA. “Validación del método ELISA para la determinación cuantitativa de antígeno prostático específico como prueba diagnóstica en el Laboratorio Quintanilla S.R.L. de la ciudad de Trujillo”. DE. INFORME DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN. TE. CA. PARA OPTAR EL GRADO DE:. BI BL. IO. BACHILLER EN FARMACIA Y BIOQUÍMICA AUTORES :. VALENCIA VALERA, DANIEL ANTONIO VÁSQUEZ CHÁVEZ, PAÚL. ASESORES :. Mg. PEDRO ALVA PLASENCIA Dra. JUDITH CASTRO GUZMÁN. TRUJILLO – PERÚ 2006. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTOS. Q. UI M. IC A. Nuestro más profundo y sincero IA. Y. BI. O. agradecimiento a Dios por su inmensa FA. RM. AC. ayuda y por la oportunidad que nos dio CA. DE. de ser profesionales y de haber concluido BI BL. IO. TE. con gran satisfacción nuestros estudios en ésta nuestra alma mater.. Daniel Valencia Valera. Paúl Vásquez Chávez. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IC A. A todos nuestros maestros y personas que BI. O. Q. UI M. a lo largo de nuestra estancia en esta AC. IA. Y. facultad nos motivaron a seguir adelante FA. RM. y de esta manera lograr alcanzar el éxito. BI BL. IO. TE. CA. DE. profesional.. Daniel Valencia Valera. Paúl Vásquez Chávez. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. A la Dra. Judith Castro Guzmán y a todo el personal del Laboratorio Quintanilla SRL que nos acogieron cálidamente y nos brindaron su apoyo desinteresado durante todo el tiempo de nuestro internado para nuestro crecimiento profesional y por habernos brindado también su total respaldo para la ejecución del presente trabajo.. Daniel Valencia Valera. Paúl Vásquez Chávez. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. Agradezco de todo corazón el gran apoyo que me brindó mi padre quien se esforzó para poder ofrecerme una buena educación como la mejor herencia que un padre puede dejar a su hijo.. A todos mis hermanos y personas que de alguna manera colaboraron para que pueda terminar con éxito mi carrera profesional.. Daniel Valencia Valera Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Con mucho cariño agradezco a Dios, a mis IC A. padres y a todas las personas que con su sola O. Q. UI M. presencia marcaron época en mi vida y IA. Y. BI. despertaron en mí buenos sentimientos y fueron RM. AC. la motivación que tanto necesitaba para poder DE. FA. seguir transitando en el difícil camino de la vida. TE. CA. A todos Uds. mi más sincero agradecimiento, los BI BL. IO. llevaré por siempre en mi corazón.. Paúl Vásquez Chávez Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. O. Q. UI M. IC A. JURADO DICTAMINADOR. AC. IA. Y. BI. Mg. Q.F. Jesús Gallardo Meléndez .......(Presidente). DE. FA. RM. Mg. Q.F. Yuri Curo Vallejos ............. (Miembro). BI BL. IO. TE. CA. Mg. Q.F. Pedro Alva Plasencia .......... (Miembro). Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN. E. l presente trabajo fue realizado con la intención de garantizar la calidad de los resultados de los análisis. reportados en el Laboratorio Quintanilla SRL y ampliar el. IC A. conocimiento sobre este tipo de estudios.. UI M. El trabajo fue llevado a cabo en las instalaciones del laboratorio. O. Q. antes mencionado bajo la supervisión y apoyo de los analistas que. Y. BI. laboran en esa institución.. AC. IA. Esperamos que la información aquí brindada sea de gran utilidad. RM. para nuestros futuros colegas o para todos aquellos profesionales. FA. interesados en ampliar sus conocimientos en el tema de. DE. aseguramiento de la calidad.. TE. CA. Dejamos a vuestro criterio, Sres. Miembros del Jurado, la. BI BL. IO. calificación que corresponde a éste trabajo.. Trujillo, Mayo del 2006. Daniel Valencia Valera. Paúl Vásquez Chávez. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ____________________________________ 1 2. MATERIALES Y MÉTODOS ___________________________ 5. IC A. 2.1 MATERIALES __________________________________________________ 5. UI M. 2.1.1 Materiales de Laboratorio: _________________________________________ 5 2.1.2 Reactivos: ________________________________________________________ 5. O. Q. 2.2 MÉTODO ______________________________________________________ 5. BI. 2.2.1 Linealidad: _______________________________________________________ 6. Y. 2.2.2 Precisión: ________________________________________________________ 6. IA. 2.2.3 Exactitud: ________________________________________________________ 6. AC. 2.2.4 Límite de Detección y Límite de Cuantificación: _____________________ 6. RM. 2.2.5 Robustez _________________________________________________________ 7. FA. 2.3 TRATAMIENTO ESTADÍSTICO: __________________________________ 8. DE. 2.3.1 Linealidad: _______________________________________________________ 8 2.3.2 Precisión: _______________________________________________________ 12. CA. 2.3.3 Exactitud: _______________________________________________________ 14. TE. 2.3.4 Límite de Detección y Límite de Cuantificación: ____________________ 16. IO. 2.3.5 Robustez: _______________________________________________________ 17. BI BL. 3. RESULTADOS ____________________________________ 19 4. DISCUSIÓN_______________________________________ 25 5. CONCLUSIÓN ____________________________________ 30 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ____________________ 31 ANEXOS. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN En el presente trabajo se investigó si el método ELISA para la determinación de antígeno prostático específico (APE) empleado en el Laboratorio Quintanilla S.R.L. cumple con los criterios de validación. Para esto se evaluaron los siguientes parámetros: linealidad, precisión (repetibilidad y reproduciblilidad), exactitud, límite de detección, límite de cuantificación y robustez, los cuales fueron determinados de acuerdo a lo establecido por la. IC A. Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria y siguiendo los. UI M. procedimientos descritos en el inserto del kit de reactivos provisto por el fabricante “DIAGNOSTIC AUTOMATION INC.” Los resultados del estudio nos. Q. muestran que la curva de calibración fue lineal con un coeficiente de. BI. O. correlación igual a 0.998; la prueba estadística de la pendiente confirmó la. Y. linealidad. El coeficiente de variación en el estudio de la repetibilidad fue igual a. IA. 4,604 % y en el caso de la reproducibilidad fue de 4,432%. La exactitud del. AC. método quedó demostrada luego de aplicar el test t-student con el 95% de. RM. confianza y 8 grados de libertad y obtener un t experimental (1.541) menor al t. FA. de tablas (2.306). Los límites de detección y cuantificación fueron 0.272 ng/mL. DE. y 0.908 ng/mL respectivamente. El método resultó ser robusto ante la variación de analistas y puntas para micropipetas más no para el caso de variación de. IO. TE. CA. temperatura.. BI BL. De esta manera, se demostró que el método cumple con los criterios de validación.. Palabras Claves: ELISA, APE, validación, linealidad, precisión, repetibilidad, reproducibilidad, exactitud, robustez. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT In the present assay it was investigated if method ELISA for the determination of prostate specific antigen (PSA) employee in the Quintanilla Laboratory S.R.L. fulfills the validation criteria. For this the following parameters were. evaluated:. linearity,. precision. (repeatability. and. reproducibility),. IC A. exactitude, detection and quantification limits and robustness, which were. UI M. determined according to the established by the Spaniard Association of Pharmacists of the Industry and following the procedures described in the. O. Q. inserted of kit of reagents provided by the manufacturer "DIAGNOSTIC. BI. AUTOMATION INC". The results of the study show us that the calibration chart. Y. was linear with a correlation coefficient equal to 0.998; the statistical test of the. AC. IA. slope confirmed the linearity. The variation coefficient in repeatability assay was 4.604% and in the case of the reproducibility assay it was 4,432%. The. RM. exactitude of the method was demonstrated after applying the t-student test. FA. with 95% of confidence and 8 degrees of freedom and obtaining a t and. quantification. limits. were. 0,272ng/mL. and. 0,908ng/mL. CA. detection. DE. experimental value (1.541) smaller to t – distribution table value (2.306). The. TE. respectively. The method turned out to be robustness to the variation of. IO. analysts and ends for micropipettes more do not to the case of temperature. BI BL. variation.. This way, is demonstrated that the method fulfills the validation criteria.. Key words:. ELISA, PSA, validation, linearity, precision, repeatability,. reproducibility, exactitude, robustness.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1. INTRODUCCIÓN El antígeno prostático específico (APE) humano es una proteína producida por la próstata que participa en la disolución del coágulo seminal y es inmunológicamente específica para el tejido prostático. Está presente en condiciones normales en la sangre en pequeñas cantidades (1).. importancia. de. su. determinación. radica. IC A. La. en. que. UI M. concentraciones séricas elevadas de APE han sido reportadas de manera específica en pacientes con cáncer prostático benigno,. O. Q. hipertrofia y en condiciones inflamatorias de otro tejido genitourinario. BI. adyacente, por lo que el APE sérico es uno de los más útiles. Y. marcadores tumorales. En consecuencia, la determinación exacta de. AC. IA. su concentración sirve como un marcador puntual para evaluar la respuesta al tratamiento en pacientes con cáncer prostático, como una. RM. herramienta importante en la monitorización de dichos pacientes y en. DE. FA. la determinación de la efectividad potencial y actual de la terapia (2).. CA. Uno de los métodos de laboratorio empleados en la determinación. TE. del APE es el método de ELISA ("Enzyme Linked Immuno Sorbent. IO. Assay"), a través del cual dicha proteína se une a anticuerpos. BI BL. específicos marcados con una enzima que después de reaccionar con un substrato hace posible la determinación de su concentración por la producción de un cambio de color (2).. Por otro lado, uno de los problemas en lograr una cobertura adecuada de las necesidades de la población en materia de servicios de laboratorios es que la calidad de los mismos no llega a los estándares requeridos como resultado en buena medida de la globalización del mercado de bienes y servicios (3). Por ello, el interés de las empresas se encamina en la búsqueda de la estandarización. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. de los sistemas de aseguramiento de calidad en los laboratorios, puesto que la aceptación y credibilidad de sus resultados depende de la identificación de las fuentes de variabilidad, de su control y de la documentación que así lo demuestre (3). Como consecuencia, las grandes compañías abordan programas de validación de procesos por requerimientos de sus sistemas de calidad y para lograr el cumplimiento de los requisitos derivados de las buenas prácticas de. IC A. manufactura (4).. Esto significa mantener controladas todas las variables que. UI M. intervienen en los procesos productivos y de servicios. De este modo,. Q. toman particular importancia los procesos de validación como una. BI. O. herramienta importante para asegurar la trazabilidad de cada una de. IA. AC. prestación de los servicios (4).. Y. las variables que intervienen en la manufactura de productos o en la. RM. Como un inicio vale la pena mencionar que los procesos de. FA. validación son sistemas de aseguramiento de la calidad mediante los. DE. cuales se establecen evidencias documentadas para demostrar que un. CA. proceso conduce a resultados de calidad consistentes dentro de las. TE. especificaciones predeterminadas (5). En otras palabras, proporcionar. IO. un alto grado de confianza de que un proceso o sistema específico. BI BL. producirá en forma consistente un resultado que cumpla con sus especificaciones predefinidas (6).. Según la USP se debe realizar la validación de un método para asegurar que la metodología analítica seguida sea exacta, específica, reproducible y robusta, dentro del intervalo específico en que el analito será analizado (7).. La importancia de la validación de los procesos radica en que permite conocerlos, reducir las causas de variabilidad que pueden ser. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. causantes de error, para establecer controles en los factores de riesgos identificados, prevenir fallas potenciales por medio de un diagnóstico temprano, unificar los procedimientos de trabajo y estandarizar la manera de hacer las cosas en forma segura (8); también sirve para hacer un balance entre la teoría y la práctica y para asegurar la consistencia de las variables del proceso a lo largo del tiempo (9).. IC A. En el caso ideal en que los métodos analíticos no estuvieran sujetos a errores, evidentemente no sería necesario validar el. UI M. resultado y existiría la seguridad de que este sea fiable. Pero la. Q. realidad es otra, y todas las operaciones de un procedimiento de. BI. O. medida suponen introducir errores aleatorios y puede que también. IA. Y. sistemáticos (10)(11).. AC. La importancia de estos criterios modernos en el mejoramiento del. RM. desempeño de los laboratorios clínicos ha sido reconocida por la. FA. Organización Mundial de la Salud, que recomienda la implementación. DE. de sistemas de aseguramiento de calidad para mejorar el desempeño de los mismos, al proporcionar los laboratorios datos relevantes y. CA. creíbles, dando confianza a los médicos en los resultados reportados. TE. (12)(13). He allí la importancia de la realización de este trabajo, para el. BI BL. IO. cual se formuló el siguiente problema:. . ¿Cumplirá con los criterios de validación el método ELISA para. la determinación cuantitativa de antígeno prostático específico empleado en el Laboratorio Quintanilla S.R.L.? Los objetivos planteados fueron: . Determinar si el método ELISA para la determinación de antígeno prostático específico cumple con los criterios de validación.. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. . Establecer la linealidad,. exactitud, precisión, límite de. detección, límite de cuantificación y robustez del método propuesto para determinar si cumple con los criterios de. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. validación establecidos.. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 MATERIALES 2.1.1 Materiales de Laboratorio: Lectora de ELISA “Stat fax”. . Lavador de ELISA “Winer washer 331”. . Cronómetro. . Calculadora. . Papel toalla. . Guantes. . Micropipetas de 50 y 100 uL “Boeco”.. . Puntas nuevas y usadas para micropipetas. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. . AC. IA. 2.1.2 Reactivos:. Kit de Reactivos para la cuantificación de APE, la cual. . FA. RM. consta de:. DE.  Zero buffer.. CA.  Estándares conteniendo 0, 2, 4, 15, y 50 ng/ml de APE.. BI BL. IO. TE.  Reactivo de Enzima Conjugada.  Substrato TMB.  Solución Stop.. 2.2 MÉTODO Para. determinar. si. el. método. ELISA. empleado. en. la. determinación de APE cumple con los criterios de validación, se evaluaron los siguientes parámetros:. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.1 Linealidad: Para evaluar la linealidad se hizo uso de 4 estándares de APE cuyas concentraciones serán de 0.0; 2.0; 4.0 y 15.0 ng/mL, los cuales fueron analizados cada uno por triplicado y por un mismo analista. 2.2.2 Precisión: Para determinar la precisión del método, se evaluó su repetibilidad y su reproducibilidad de la manera que se describe. UI M. IC A. a continuación:. Q. 2.2.2.3 Repetibilidad:. O. Se realizaron un número de 10 determinaciones del. BI. estándar de 4 ng/mL por un mismo analista, el mismo reactivos. y. los. mismos. RM. instrumentos.. mismos. Y. los. IA. con. AC. día,. FA. 2.2.2.4 Reproducibilidad: Para su determinación se empleó el estándar de. DE. 4ng/m, el cual fue analizado en dos días diferentes por. CA. dos analistas en un número de dos determinaciones por. IO. TE. analista y por día.. BI BL. 2.2.3 Exactitud: Se la evaluó a través de un análisis repetitivo. de 3. estándares de concentraciones 1.0; 2.0 y 4.0 ng/mL. El análisis de cada uno de estos estándares se llevó a cabo por triplicado.. 2.2.4 Límite de Detección y Límite de Cuantificación: Se las determinó mediante el análisis repetitivo de un blanco. El blanco utilizado fue agua destilada y se llevaron a cabo 6 determinaciones.. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.5 Robustez La robustez se determinó de acuerdo al diseño de Youden & Steiner, siendo las variables evaluadas: temperatura, analista (2 analistas) y puntas de micropipetas (nuevas y usadas).. Cada una de las determinaciones realizadas fue efectuada empleando la técnica descrita en el inserto del kit de reactivos de la marca provista por el fabricante “DIAGNOSTIC AUTOMATION. IC A. INC.”, el cual se describe a continuación:. UI M. a. Dispensar 50l de estándar en los pozos dispuestos.. Q. b. Dispensar 100l de zero buffer dentro de cada pozo.. BI. O. c. Mezclar suavemente por 10 segundos,. Y. completamente.. procurando mezclar. IA. d. Incubar a temperatura ambiente (18-22oC) por 60 minutos.. AC. e. Remover la mezcla de incubación vaciando el contenido de los. RM. pozos en un recipiente de descarte.. FA. f. Lavar los pozos 5 veces con agua destilada.. DE. g. Secar los pozos en papel absorbente o papel toalla para remover toda la humedad residual.. CA. h. Dispensar 100l de Reactivo de Enzima Conjugada dentro de. IO. Incubar a temperatura ambiente por 60 minutes.. BI BL. i.. TE. cada pozo y mezclar suavemente por 5 segundos. j.. Remover la mezcla de incubación vaciando el contenido de los pozos en un recipiente de descarte.. k. Lavar los pozos 5 veces con agua destilada. l.. Secar los pozos en papel absorbente o papel toalla para remover toda la humedad residual.. m. Dispensar 100l de solución TMB dentro de cada pozo. Mezclar suavemente por 5 segundos. n. Incubar a temperatura ambiente por 20 minutos. o. Detener la reacción añadiendo 100l de Solución Stop dentro de cada pozo.. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. p. Mezclar suavemente por 30 segundos hasta asegurarse que el color azul cambie completamente a amarillo. q. Usando una lectora de ELISA, leer la densidad óptico a 450nm dentro de los 20 minutes posteriores.. 2.3 TRATAMIENTO ESTADÍSTICO: Los datos obtenidos fueron procesados estadísticamente de la. IC A. siguiente manera:. UI M. 2.3.1 Linealidad:. O. Q. 2.3.1.1 Cálculos de los Parámetros de Regresión:. BI. a. Ecuación de la Recta de Regresión: recta de regresión, la cual tuvo la siguiente. y  bx  a. Donde:. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. fórmula:. IA. a elaborar la. Y. Con los datos obtenidos en este ensayo se procedió. . y= absorbancias obtenidas a partir de las lecturas de los patrones del analito.. . x= concentración de los patrones del analito. . b= pendiente de la recta de regresión. . a= intercepto de la regresión lineal con el eje de ordenadas.. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. b. Fórmula empleada para el cálculo de la pendiente b: La pendiente b fue hallada empleando la fórmula siguiente: x y  x y   n b  x x   i. i. i. i. 2. 2. i. 1. n. IC A. c. Fórmula empleada para determinar el Intervalo de. UI M. Confianza de la Pendiente:. BI. O. Q. Se empleó la siguiente fórmula:. b = pendiente. FA. . RM. Donde:. AC. IA. Y. Límite de Confianza = b  t.Sb. t = ttab para un nivel de significancia del 95% y. n-2 grados de libertad.. TE. CA. DE. . BI BL. IO. d. Fórmula empleada para el cálculo del intercepto a: Su determinación se hizo mediante la siguiente. fórmula:. a. y. i.  b xi n. e. Fórmula empleada para determinar el Intervalo del Intercepto a: Para determinarla se aplicó la siguiente fórmula:. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Límite de Confianza = a  t.Sa Donde: . a = intercepto. . t = ttab para un nivel de significancia del 95% y n-2 grados de libertad.. . Sa = Desviación estándar del intercepto, que se determinó mediante el empleo de la. Q. UI M. IC A. siguiente fórmula:. x. 2 i. n. AC. IA. Y. BI. O. Sa  S. 2 b. f. Cálculo del Coeficiente de correlación (r):. TE. CA. FA. DE. fórmula:. RM. Para su determinación se empleó la siguiente. r. x y  x y   n    x   x   y   y    n  n i. i. 2. IO. 2. . BI BL. i. i. 2. i. 2. i. . i. i.    . 2.3.1.2 Cálculos efectuados en el Test de Linealidad de la Pendiente b:. a. Cálculo del valor de la desviación estándar de la pendiente b (Sb): Se obtuvo a partir del valor de la varianza de la pendiente b (S2b) mediante la siguiente fórmula:. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Sb  S 2 b. b. Cálculo del valor de la varianza de la pendiente b:. S 2b . S 2 y1 x.  x  x  n. IC A. Se determinó empleando la fórmula siguiente:. 2. Q. UI M. 2. BI. O. c. Cálculo del valor de la varianza residual (S2yx ):. RM. AC. IA. Y. Se la halló a través de la siguiente fórmula:. y . 2.  a y  b xy n2. DE. FA. S. 2 y' x. BI BL. IO. TE. CA. Donde: . b= pendiente. . a= intercepto con el eje de abscisas. . n= # de datos. d. Cálculo del valor de texp : El valor de texp se determinó empleando la siguiente fórmula:. texp . b sb. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Donde: . b= pendiente de la recta de regresión. . Sb=. desviación. estándar. de. la. pendiente b . El método será lineal si texp es mayor al ttab con el. IC A. 95% de confianza y n-2 grados de libertad (14).. UI M. 2.3.2 Precisión:. O. Q. 2.3.2.1 Repetibilidad. BI. a. Determinación de las Concentraciones Prácticas a. Y. partir de las absorbancias:. AC. IA. Los valores de las concentraciones prácticas se. RM. obtuvieron al empelar la fórmula siguiente, elaborada a partir de la ecuación de la recta obtenida en el ensayo. x. y  0.267 0.0455. IO. TE. CA. DE. FA. de linealidad:. BI BL. Donde: . x = concentración práctica. . y = absorbancia. b. Determinación de la Media: Se utilizó la fórmula siguiente: n. x.  i 1. xi. n. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Donde:  . x  media n = número de valores. c. Determinación de la Desviación Estándar (S): Para hallarla se empleó la fórmula siguiente:.  x  x  n. S. 2. i. i 1. IC A. n 1. UI M. d. Determinación de los Intervalos de Confianza Individual y de la Media:. Y. Intervalos de Confianza Individual:. IA. . BI. O. Q. Se hicieron uso de las siguientes fórmulas:. RM. AC.  x  ttab * S. Donde:. x  media. . ttab= valor de t tablas para un 95% de. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. . . confianza y n-1 grados de libertad. . S = desviación estándar. Intervalo de Confianza de la Media:.  x. ttab n. Donde: . x  media. . ttab= valor de t tablas para un 95% de confianza y n-1 grados de libertad.. . n = número de datos. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. e. Determinación del Coeficiente de Variación (CV): Se hizo uso de la fórmula descrita a continuación:. CV . Sx100 x. Donde: S = desviación estándar. . x = media. IC A. . UI M. 2.3.2.2 Reproducibilidad:. Q. Los valores de concentraciones prácticas, de la. BI. O. media, de la desviación estándar y del coeficiente de. Y. variación se obtuvieron de manera idéntica que en el. AC. IA. ensayo de repetibilidad. . RM. El método será preciso si en los ensayos de. FA. repetibilidad. y. reproducibilidad. se. obtienen. DE. coeficientes de variación menores a 5% (14).. TE. CA. 2.3.3 Exactitud:. IO. a. Cálculo de las Concentraciones Prácticas a partir de las. BI BL. absorbancias: Las. concentraciones. fueron. obtenidas. mediante. la. siguiente fórmula, obtenida a partir de la recta de regresión del ensayo de linealidad:. x. y  0.267 0.0455. Donde:  . x = concentración práctica y = absorbancia. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. b. Cálculo de los % de Recuperación: En la determinación de la exactitud del método los valores de. las. concentraciones se. expresaron como. % de. Recuperación de la siguiente forma: CC. Pr áctica  100 CC.Teórica. IC A. % Re cuperación . UI M. c. Cálculos efectuados en la aplicación del Test G de Cochran: Para la aplicación del Test G de Cochran fue necesaria la. BI. O. Q. obtención de las varianzas (S2) de los % de recuperación.. Y. c.1 Determinación de los valores de las Varianzas (S2):. AC. IA. Fueron obtenidas mediante el empleo de la fórmula.    S2     .  xi  x    n 1   .  n. i 1. . 2. 2. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. siguiente:. c.2 Determinación del valor de Gexp: Se aplicó la siguiente fórmula:. Gexp . S 2 máx S12  S22  S32. Donde: . S2 máx = valor mayor de las varianzas obtenidas.. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. S2x = varianzas obtenidas con los. . resultados de las 3 concentraciones analizadas. d. Cálculos efectuados en la aplicación de la Prueba t-Student: Para la aplicación de esta prueba fue necesaria la determinación del valor de texp mediante la siguiente fórmula:. IC A. 100  R  n CV. UI M. texp . R = valor del promedio de los % de. O. . Q. Donde:. Y. BI. Recuperación.. n = Nº de determinaciones.. . CV = coeficiente de variación, hallada. AC. IA. . FA. RM. mediante la fórmula siguiente: Sx100 x. CA. DE. CV . El método será exacto si el valor de ttablas es mayor. BI BL. IO. TE. . al texp, al 95% de confianza y n-1 grados de libertad (14).. 2.3.4 Límite de Detección y Límite de Cuantificación: Para su determinación se hizo uso de la siguiente fórmula:. CL . K  Sbl b. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Donde: . CL. =. Límite. de. detección. o. cuantificación. . K = constante (3 para el límite de detección y 10 para el límite de cuantificación) (14).. . b = pendiente obtenida en el ensayo de. IC A. linealidad. 2.3.5 Robustez:. UI M. Se empleó el diseño de Youden & Steiner (14), el cual se. 2. 3. 4. A/a. A. A. A. B/b. B. B. b. C/c. C. c. Resultado. s. t. 6. 7. 8. A. a. a. a. a. b. B. B. b. b. C. c. C. c. C. c. u. v. w. x. y. z. AC. RM. FA DE. CA. TE. Siendo:. 5. IA. 1. Factor. Y. Ensayo. BI. O. Q. muestra en el siguiente esquema:. A: Temperatura de 21ºC. IO. . a: Temperatura de 30ºC. . B: analista 1. . b: analista 2. . C: puntas de micropipeta nuevas. . c: puntas de micropipeta usadas. . s, t, u, v, w, x, y, z: concentraciones de antígeno. BI BL. . prostático específico determinadas en cada ensayo. A continuación se procedió a determinar las diferencias para cada factor, empleando la fórmula siguiente:. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. . VA = ¼ (s+t+u+v) – ¼ (w+x+y+z). . VB = ¼ (s+t+w+x) – ¼ (u+v+y+z). . Vc = ¼ (s+u+w+y) – ¼ (t+v+x+z) . Donde: . VA,. VB. y. Vc:. Valor. de. las. diferencias existentes entre las. IC A. variables estudiadas. Si VX  S 2  la diferencia es significativa y el. UI M. . método no será robusto para esa variable (14).. O. Q. (S = desviación estándar hallada en el ensayo de. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. repetibilidad).. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 3. RESULTADOS. Tabla #1: Valores de los parámetros de regresión lineal obtenidos en el ensayo de linealidad del método ELISA para la determinación cuantitativa de antígeno prostático específico (APE).. Ecuación de la Recta. Límite. Resultado. y = bx + a. y = 0,045x + 0,267. UI M. Pendiente b. IC A. Parámetros de Regresión. 0.267. O. Q. Intercepto a. 0,045. BI. r  0.95. 0.998. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. Coeficiente de correlación (r). Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura #1: Recta de regresión obtenida en el ensayo de linealidad del método ELISA empleado en la determinación cuantitativa de antígeno prostático específico (APE). 1,200. M. 15. Coeficiente de Correlación = 0,9968. BI. O. Q. UI. 1,000. FA RM. AC IA. Y. 0,800. 0,600 4. 2. LI O. 0. BI B. 0,200. 0,000 0. TE CA. 0,400. DE. Absorbancias (450 nm). IC. A. y = 0,0455x + 0,267. 2. 4. 6. 8 Concentración. 10. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/. 12. 14. 16.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Límite. Resultado. AC IA. Y. Parámetros de Regresión. BI. O. Q. UI. M. IC. A. Tabla #2: Tratamiento estadístico de la pendiente obtenida en el ensayo de linealidad del método ELISA para la determinación cuantitativa de antígeno prostático específico (APE).. Prueba t-Student. 0,035 – 0,056. BI B. LI O. TE CA. DE. Intervalo de confianza de la Pendiente b. Intervalo de confianza del Intercepto a. 9,514 > 2,228 (10;0.05). FA RM. texp > ttabla (10;0.05). Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/. 0,184 – 0,350.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla # 3: Valores individuales y estadística descriptiva de las concentraciones de antígeno prostático específico (APE) obtenidas en el ensayo de Repetibilidad del método ELISA empleado en su determinación cuantitativa.. Concentraciones Prácticas (ng/mL). UI M. 3,917 3,851 4,202 4,005 3,961 3,917 3,851 3,807 3,654 4,267. IC A. Concentración Teórica. AC. FA. DE. Media. RM. Nº de análisis. IA. Y. BI. O. Q. 4 ng/mL. TE. CA. Desviación Estándar. BI BL. IO. Intervalos de confianza individual Intervalos de confianza de la media C.V.. (aceptación  5%). 10. 3,943. 0,182 4.354 3,532 4,073 3,813 4,604%. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla #4: Valores individuales diarios y la estadística descriptiva de las concentraciones de antígeno prostático específico (APE) obtenidas en el ensayo de Reproducibilidad del método ELISA empleado en su determinación cuantitativa.. Concentraciones Prácticas Día 1 Día 2. Concentración Teórica: 4 ng/mL. UI M. Analista 2. 3,627 3,819 4,176 3,978 8 3,904 0,173 4,432%. IC A. 3,978 3,832 4,044 3,781. Analista 1. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. Nº de Determinaciones Valor medio global Desviación Estándar (S) Coeficiente de Variación. BI BL. IO. Tabla # 5: Porcentaje de recuperación media y Test de Cochran aplicada durante el ensayo de Exactitud del método ELISA para la determinación de antígeno prostático específico (APE).. Concentración 1 2 4. % de Recuperación Promedio. Test de G Cochran (aceptación Gexp < Gtabla(0.05;3;3). 78,244. 0.560 < 0.871(0.05;3;3). 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla # 6: Porcentaje de Recuperación media y Prueba t-Student aplicada en el ensayo de Exactitud del método ELISA para la determinación de antígeno prostático específico (APE).. Concentración. % de Recuperación Promedio. Prueba t-Student (aceptación texp < ttabla. 78,244. 1.541 < 2.306(0.05;8). BI. O. Q. UI M. IC A. 1 2 4. (0.05;8). RM. Límite de Detección. AC. IA. Y. Tabla # 7: Valores de los Límites de Detección y Cuantificación del método ELISA para la determinación de antígeno prostático específico.. 0,908 ng/mL. IO. TE. CA. DE. FA. Límite de Cuantificación. 0,272 ng/mL. BI BL. Tabla # 8: Parámetros obtenidos en el ensayo de Robustez del método ELISA para la determinación de antígeno prostático específico (APE).. Variable. Aceptación. A,a= Temperatura B,b= Analista C,c= Puntas nuevas y usadas. Resultado 13.266 > 0.257. Vx  S 2. 0.190 < 0.257 0.113 < 0.257. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 4. DISCUSIÓN Los parámetros a evaluar en un estudio de validación de un método dependerán de la naturaleza del mismo. En el caso estudiado, al tratarse de un método de determinación cuantitativa, correspondería evaluar, además de los parámetros estimados, la especificidad del método (14).. IC A. Sin embargo, hay que tener presente que siempre habrán. UI M. ocasiones en las que claramente ciertas características señaladas como requeridas pueden ser no necesarias y viceversa. Volviendo al caso. O. Q. nuestro, vemos que se trata de un método basado en una reacción. BI. antígeno – anticuerpo que, hasta donde se sabe, se tratan de reacciones. Y. de por si muy específicas (15), por lo cual en este estudio se consideró. RM. AC. IA. la evaluación de este parámetro como no indispensable.. FA. Luego de efectuados los cálculos respectivos, se apreció que el método presenta la capacidad de brindar resultados linealmente. DE. proporcionales a la concentración del analito en estudio, dentro del. IO. TE. en la figura #1.. CA. intervalo de concentración que va de 0 a 15 ng/mL, tal como se muestra. BI BL. Esto queda demostrado tras el análisis estadístico, ya que en la. tabla #1 se puede observar que a partir de la recta de regresión se obtuvo un valor de 0.998 para el coeficiente de correlación (r). Su valor cercano a la unidad nos indica que existe correlación entre los valores de concentración (x) y absorbancias (y) con una elevada probabilidad. Esta apreciación queda fortalecida al obtener un coeficiente de determinación de 0.9968, lo cual quiere decir que la variable independiente (concentración) explica un 99.68% de la varianza total de y (absorbancia). Además, este valor para el coeficiente de correlación, es muy cercano al obtenido en estudios similares, tal como se muestra. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. en un estudio de validación de un método ELISA para la determinación de anticuerpos contra Haemophilus influenzae, donde se obtuvo un valor de r igual a 0.9979 (16). Sin embargo, un valor del coeficiente de correlación muy cercano a la unidad no puede tomarse como indicador absoluto de linealidad, sino que además se tiene que demostrar mediante el empleo de un test de linealidad, siendo uno de los más confiables la prueba de t-student, que es empleada para mostrar la significancia estadística de la varianza de la pendiente b, la cual aplicada a nuestro estudio nos demuestra que el método de diagnóstico. IC A. analizado cumple con el criterio de linealidad, pues el valor del texp. UI M. (9.514) obtenido es mayor al ttab (2.228), tal como se muestra en la tabla. BI. O. Q. #2 (4)(12)(14).. Y. En lo que respecta al ensayo de precisión, se evaluó la. IA. repetibilidad como una medida de ésta, la cual se define como el grado. AC. de concordancia entre los valores de una serie repetida de ensayos. RM. analíticos efectuados sobre una muestra homogénea por un mismo. FA. analista bajo las mismas condiciones, es decir es la capacidad del. DE. método para dar resultados semejantes cuando se aplica repetidamente en una muestra. La precisión se expresa matemáticamente por la. CA. desviación estándar o preferiblemente por el coeficiente de variación, y. TE. se recomienda que el valor de dicho coeficiente sea menor a 5% para. IO. casos como el analizado en nuestro estudio, según la USP, tanto en la. BI BL. prueba de repetibilidad y de reproducibilidad. En el caso de la determinación de la repetibilidad, tal como se muestra en la tabla #3, se efectuaron 10 determinaciones sobre un estándar de concentración de 4ng/mL, tras la cual se obtuvieron una desviación estándar de 0.182 con un coeficiente de variación igual a 4.604%, lo cual nos indica que el método cumple con el criterio de precisión. Por otro lado, la precisión puede expresarse también a través de los límites de confianza de los resultados individuales y de los resultados promedio. En nuestro caso el intervalo de confianza de los resultados individuales indica que el 95% de las lecturas del estándar de concentración de 4ng/mL están entre. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 3.532 y 4.354 ng/mL; y el intervalo de confianza de la media de los resultados fue calculada entre 3.813 y 4.073 ng/mL, esto también con un nivel de confianza del 95%, tal como es apreciado en la tabla #3. En lo referente a la reproducibilidad, esta es definida como la medida de la precisión de los resultados de un método analítico efectuado sobre la misma muestra pero en condiciones diferentes. En nuestro estudio esta prueba se diseñó para ser efectuada por dos analistas y en dos diferentes días. El coeficiente de variación obtenida en este ensayo, como se muestra en la tabla #4, fue de 4.432%, lo cual es inferior al Esto último, confirma la buena precisión del método. UI M. muestra (<5%).. IC A. valor convencionalmente establecido por la USP para este tipo de. Q. (9)(10)(14), más aún si tomamos en cuenta que los valores del. O. coeficiente de variación obtenidos en el ensayo de precisión, tanto en lo. BI. referente a la repetibilidad como a la reproducibilidad, resultaron siendo. IA. Y. inferiores a los obtenidos en estudios similares, en donde se obtienen. AC. valores de coeficientes de variación, iguales a 6% en un caso (8), y a. FA. RM. 9.312% en otro (16).. DE. En lo referente a la exactitud de este método de diagnóstico, se puede decir que cumple con las especificaciones establecidas. En. CA. primer lugar, se puede definir a la exactitud como la capacidad de un. TE. método analítico de dar un resultado lo más próximo posible al valor. IO. verdadero, si la diferencia entre el valor hallado y el valor verdadero es. BI BL. pequeña, la exactitud es buena. Una diferencia grande significa que la exactitud es inadecuada y revela la existencia de errores determinados que deberían corregirse. En nuestro estudio, obtuvimos un porcentaje de recuperación media del 78.244%, tal como es aprecia en la tabla #4. La buena exactitud del método quedó demostrada luego de aplicado el test t-student con el 95% de confianza y 8 grados de libertad, obteniéndose un valor de texp (1.541) menor al ttablas (2.306), esto es mostrado en la tabla #6. Esto último nos indica que no existe diferencia significativa entre la recuperación media y 100, confirmando de esta manera la buena exactitud del método. Sin embargo, el valor del porcentaje de. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. recuperación hallado, resulta siendo inferior al determinado en estudios similares, en donde se obtienen porcentajes de recuperación promedio de 99.78% y 93.35% (17)(16). Previo a la aplicación del test t-student, se analizó estadísticamente si el factor concentración tiene alguna influencia en los resultados. Esto se realizó mediante la realización de un test de igualdad de varianzas, representado por el test de Cochran, que tal como se aprecia en la tabla #5, dicho factor no tiene influencia estadística en la variabilidad de los resultados al obtener un valor de Gexp (0.560) menor al valor de Gtab (0.871), esto con un nivel de. UI M. IC A. significancia del 95% (5)(9)(14).. O. Q. En lo referente al límite de detección y cuantificación, se puede para. dar. un. significado,. Y. requerida. BI. mencionar que sus valores se relacionan con la cantidad de analito cualitativo. o. cuantitativo,. IA. respectivamente. De esta manera, el límite de detección es definida. AC. como la menor concentración o cantidad de analito detectable con. RM. razonable certeza por un procedimiento analítico dado, en nuestro. FA. estudio, este límite fue calculado en 0.272 ng/mL. Esto quiere decir que. DE. el método ELISA empleado en la determinación de APE es capaz de. CA. detectar concentraciones a partir de 0.272 ng/mL. En tanto, el límite de cuantificación, definido como la menor concentración o cantidad de. TE. analito de una muestra que puede ser determinada con aceptable. BI BL. IO. precisión y exactitud bajo las condiciones experimentales establecidas, fue determinada en 0.908 ng/mL, lo cual quiere decir que el método evaluado es capaz de cuantificar concentraciones iguales o mayores a dicho valor (9)(11)(14).. En el caso del parámetro robustez, que es definida como el grado de influencia que pequeños cambios en las condiciones analíticas ejercen sobre la fiabilidad del método analítico. Es importante evaluarla porque permite localizar factores que originan fluctuaciones menores y los que necesitan una atención especial por cuanto son origen de variaciones significativas en los resultados. En nuestro estudio, los 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. cambios a los que fue sometido el método analítico, en concentración de 50 ng/mL fueron: la variación de analistas, temperaturas de trabajo (21º y 30ºC) y el uso de puntas para micropipetas nuevas y usadas. Se consideran como aceptables aquellos valores absolutos de las diferencias obtenidas de acuerdo al diseño de Youden & Steiner que sean menores o iguales al valor del producto de su desviación estándar por. 2 , que en nuestro caso fue 0.0117. Tomando en cuenta esto, se. aprecia en los resultados que el método es robusto a las variaciones que. IC A. surgen por el cambio de analistas y por el uso de puntas para micropipetas tanto nuevas como usadas. Sin embargo, se aprecia que el. UI M. efecto de cambiar la temperatura de trabajo de 21ºC a 30º C tiene una. Q. influencia importante en los resultados, pues se observa que los. BI. O. resultados de los ensayos efectuados a 30ºC nos muestran valores. Y. elevados. Esto está dentro de lo esperado, debido a que las. IA. especificaciones descritas por el fabricante del kit reactivos señala la. AC. realización del ensayo a temperatura ambiente, la cual es establecida. RM. entre 18º - 22ºC. Al realizarse el ensayo a 30ºC se producen variaciones. FA. significativas en los resultados debido a la inestabilidad que el aumento de la temperatura ocasiona en los reactivos provistos en el kit,. DE. produciéndose de ésta manera resultados erróneamente altos. Al. CA. haberse comprobado experimentalmente esta influencia se recomienda. TE. la realización de este ensayo dentro de los límites de temperatura. BI BL. IO. establecidos (14)(18).. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 5. CONCLUSIÓN Luego de determinar los parámetros de validación del método ELISA para la determinación cuantitativa de antígeno prostático específico, se concluye que el método es lineal, exacto, preciso y robusto dentro del rango de concentraciones que va de 0.0 a 15.0 ng/mL y a temperatura ambiente, además de poseer un límite de detección de 0.272 ng/mL y un. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. límite de cuantificación de 0.908 ng/mL.. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Trucco, C; Diaz, M; Moreno, S et al: “Antígeno Prostático Complejo. Su aporte en el diagnóstico de cáncer prostático”. Rev Chilena Urol. Santiago de Chile, Chile. Vol 69(2). 2004. Pág: 156. IC A. 2. Calderón, D y Pérez, J: “Determinación del antígeno prostático específico y fosfatasa ácida en el diagnóstico de cáncer e. UI M. hiperplasia prostática benigna en pacientes de 40-85 años”. Rev. BI. O. Q. Mexicana Urol. México D.F. México. Vol 63(2). Pág: 51 – 61. Y. 3. Rodríguez, G y Blanco R: “Aseguramiento de la calidad analítica. IA. y norma ISO 17 025 en laboratorios clínicos y químicos”. Rev. AC. Costarricense de Ciencias Médicas. San José, Costa Rica. Vol. FA. RM. 22(2). 2001. Pág: 25-29. 4. Sabater, J y Vilmara, A: Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP). DE. y Garantía de Calidad (Quality Assurence): Principios Básicos.. TE. CA. 1a ed. Ed Díaz Santos S.A. España.1998. Pág: 5-8. IO. 5. Camara, C: Toma y Tratamiento de muestras. 1 a ed. Ed. BI BL. Síntesis. España. 2004. Pág: 46-70. 6. Cortés, A; Sandino, C y Arias, J: “Validación de la prueba de esterilidad para vacunas virales preparadas en vehículos oleoso y acuoso”. Rev Facultad de Farmacia – Pontificia Universidad Javeriana”. Santa Fé de Bogotá, Colombia. Vol 45(1). 2003. Pág: 36-43.. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(43) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 7. Hurtado, R;. Medina, L y Domínguez R: “Validación de un. método analítico para la cuantificación de acetaminofén en orina”. Rev Mexicana de Ciencias Farmacéuticas. México. Vol 25(6). 1995. Pág: 21-24. 8. García, G; Arranz, C; Rodríguez, B et al: “Validación de un juego de reactivos (CUALINEN-HCG) para la detección cualitativa de gonadotropina coriónica humana en el embarazo”. Rev Cubana. UI M. IC A. Endocrinol. Cuba. Vol 13(3). 2002. Pág: 21-30. Q. 9. Loftus, B y Nash, R: Pharmaceutical Process Validation. 1 a ed.. BI. O. Ed Marcel Derer. USA. 1984. Pág: 7-15. IA. Y. 10. Tijerina, R; Bosques, F; Pérez, G et al: “Validación del Western. AC. blot para la detección del genotipo de Helycobacter Pylori”. Rev. FA. RM. Med Universitaria. México. Vol 4(17). 2002. Pág: 12-16 11. García, C; Fernández, D; Núñez, L et al: “Validación de los. DE. métodos analíticos para el control de la calidad y estudio de. CA. estabilidad del salbutamol 0,5 % en solución nebulizadora”. Rev. TE. Cubana de Farmacia. Cuba. Vol 39(2). Mayo-Agosto, 2005.. BI BL. IO. Pág: 32- 35. 12. Rosas, H: “Validación de la Metodología para la Determinación de Sb, As, Cd, Cu, Cr, Hg, Ni, Pb y Zn en Sedimentos por ICPMS”. Rev I & S. Bolivia. Vol 1(3). Enero-Junio, 2003. Pág: 8-11 13. Castillo, B y González, R: “Protocolo de validación de métodos analíticos para la cuantificación de fármacos”. Rev Cubana de Farmacia. Cuba. Vol 30(1). Enero-Abril, 2006. Pág: 11-16. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(44) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 14. Castro, M; Gascón, S; Pujol, M et al: Validación de Métodos Analíticos. Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria. (AEFI),. Sección. Catalana.. 1ra. ed.. Ed. Farma. Internacional. España. Pág: 1-74 15. Guyton, A y Hall, J: Tratado de Fisiología Médica. 10ma ed. Ed McGraw-Hill. España. 2002. Pág: 492 – 493 16. Toraño, G; Hernández, I; Baly, A y Toledo, M: “Validación de un. IC A. Ensayo tipo ELISA para la cuantificación de anticuerpos contra. UI M. el polisacárido capsular de Haemophilus influenzae tipo b”. Rev. O. Q. Cubana Med Trop. Vol 57(3). 2005. Pág: 7 – 11. BI. 17. Ferriol, X; García, A; Ochoa, R et al: “Validación de un ELISA. IA. Y. para la cuantificación de Ig G humana antiproteína de Neisseria. AC. meningitidis serogrupo B”. Rev Cubana Med Trop. Vol 51(2).. FA. RM. Mayo-Agosto, 1999. Pág: 18 – 21 18. Skoog, D y Leary, J: Principios de Análisis Instrumental. 5ta ed.. BI BL. IO. TE. CA. DE. Ed McGraw-Hill. España. 2001. Pág:674 - 747. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(45) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ANEXOS Anexo 1: Datos experimentales obtenidos en el ensayo de. Linealidad. . Para la determinación de la linealidad del método se obtuvieron y se emplearon los siguientes datos experimentales, a partir de los. Absorbancia (450 nm) y. xy. 0. 0,286. 0,000. 0. 0,272. 0. 0,307. 2. 0,375. 2. 0,327. 2 4. y2. 0. 0,082. 0,000. 0. 0,074. 0,000. 0. 0,094. 0,750. 4. 0,141. 0,654. 4. 0,107. 0,311. 0,622. 4. 0,097. 0,443. 1,772. 16. 0,196. 0,409. 1,636. 16. 0,167. 0,48. 1,920. 16. 0,230. 0,823. 12,345. 225. 0,677. 1,190. 17,850. 225. 1,416. 0,847. 12,705. 225. 0,717. 15. IO. 15. TE. 4. BI BL. 15. Y. IA. AC RM. FA. CA. 4. BI. x2. DE. Concentración (ng/mL) x. O. Q. UI M. IC A. cuales se sacaron los resultados de este ensayo:. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(46) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo2: Datos experimentales obtenidos en el ensayo de. Precisión: 1. Datos obtenidos en la determinación de la Repetibilidad: . Para la determinación de los resultados obtenidos en el ensayo de repetibilidad, se procesaron los siguientes datos obtenidos. Absorbancias (450 nm) 0,445. Q. UI M. Concentración Teórica. IC A. experimentalmente:. O. 0,442. BI. 0,458. IA. Y. 0,449 0,447 0,445 0,442. 0,440 0,433 0,461. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. 4 ng/mL. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(47) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2 Datos experimentales obtenidos en el ensayo de Reproducibilidad: . Los datos experimentales obtenidos en este ensayo se muestran en la tabla siguiente:. Absorbancias (450nm). Concentración Teórica: 4 ng/mL. Día 2. IC A. Día 1. UI M. 0,448. Analista 1. Q. 0,441. O. 0,451. Analista 2. 0,441 0,457 0,448. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. 0,439. 0,432. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(48) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 3: Datos experimentales obtenidos en el ensayo de. Exactitud: . Se presentan en la tabla siguiente los valores experimentales obtenidos en el ensayo de Exactitud, los cuales nos permitieron. b. 1.0. 0,313. 0,288. 2.0. 0,375. 0,327. 4.0. 0,443. 0,455. c 0,276 0,311 0,445. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. a. Q. UI M. Absorbancias (450nm). CC. Teórica (ng/mL). IC A. calcular los resultados correspondientes a este ensayo:. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(49) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 4: Datos experimentales obtenidos en la determinación. de los Límites de Detección y Cuantificación:. . Los datos experimentales obtenidos, se muestran en la siguiente tabla:. 0,362. UI M. 0,367. IC A. Absorbancia (450nm). CC. Teórica. Q. 0,358. O. 0 ng/mL. AC. IA. Y. BI. 0,365. RM. Media. 0,364 0,364 0,004. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. Desviación estándar. 0,370. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(50) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 5: Datos experimentales obtenidos en el ensayo de Robustez:. IC. A. 1. Resultados experimentales obtenidos en el ensayo de Robustez:. Q. UI. M. En este ensayo se obtuvieron los siguientes datos experimentales: Absorbancias (450 nm) 1. 2. 3. T=21º/30º. 21º. 21º. 21º. Analista1/2. Analista 1. Analista 1. Puntas n/v. nuevas. BI. 6. 7. 8. 21º. 30º. 30º. 30º. 30º. Analista 2. Analista 2. Analista 1. Analista 1. Analista 2. Analista 2. usadas. nuevas. usadas. nuevas. usadas. nuevas. usadas. 2,635. 2,551. 2,32. 2,668. 3,45. 3,107. 2,801. 3,038. 2,59. 2,534. 2,22. 2,639. 2,992. 3,13. 2,778. 3,195. 2,546. 2,557. 2,673. 2,644. 3,093. 3,076. 4,142. 3,039. AC IA. FA RM. TE CA. Y. 5. DE. 4. BI B. LI O. Resultados. O. CC. Teórica 50 ng/mL. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(51) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2. Concentraciones prácticas: Se muestran a continuación las concentraciones prácticas, calculadas a partir de los datos experimentales. UI. M. IC. A. mostrados en el cuadro anterior:. Concentraciones Prácticas 1. 2. 3. 4. T=21º/30º. 21º. 21º. 21º. 21º. Analista1/2. Analista 1. Analista 1. Analista 2. Analista 2. Puntas n/v. nuevas. usadas. nuevas. 51,9103478. 50,0695012. 45,007173. 50,92418. 49,6969489. 42,815689. 49,959927. 50,2009902. 50,9314849. 49,9891468. O. 7. 8. 30º. 30º. 30º. 30º. Analista 1. Analista 1. Analista 2. Analista 2. usadas. nuevas. usadas. nuevas. usadas. 52,6335375. 69,7709427. 62,2541525. 55,5482113. 60,7420285. 51,9980071. 59,7339458. 62,7581938. 55,04417. 64,1826584. 52,7431117. 52,1075813. 61,9473447. 61,5747924. 84,9360123. 60,7639433. 46,8553246. 52,2463753. 63,8174111. 62,1957129. 65,1761312. 61,8962101. Y. AC IA. FA RM. DE. TE CA. BI. 6. BI B. Res. Prom.. 5. LI O. Resultados. Q. CC. Teórica 50 ng/mL. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

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