Producción y caracterización PEG-Albúmina

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(1)IQ-2008-I-7. PRODUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN PEG-ALBÚMINA. CAROLINA BELTRÁN PÉREZ. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA BOGOTÁ 2008. 1.

(2) IQ-2008-I-7. PRODUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN PEG-ALBÚMINA. CAROLINA BELTRÁN PÉREZ Proyecto De Grado Para Optar Al Título De Ingeniera Química. Asesor Juan Carlos Briceño. Co-Asesor Óscar Fernando Sánchez. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA BOGOTÁ 2008. 2.

(3) IQ-2008-I-7. AGRADECIMIENTOS. Gracias a mi mamá y a mi hermano por guiarme en todas las decisiones de la vida y por ser un apoyo incondicional. Gracias a mis asesores Juan Carlos Briceño y Óscar Fernando Sánchez por su confianza y apoyo; a Camila Castro, José María Robles y Luz Dary Rugeles por su colaboración durante el desarrollo del proyecto. Gracias a mis amigos por estar cuando los necesité.. 3.

(4) IQ-2008-I-7. CONTENIDO Página LISTA DE TABLAS. VI. LISTA DE FIGURAS. VII. RESUMEN. VIII. INTRODUCCIÓN. 9. 1. OBJETIVOS. 11. 1.1 OBJETIVO GENERAL. 11. 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 11. 2. MARCO TEÓRICO. 12. 2.1 HEMOSUSTITUTOS. 12. 2.2 FLUIDOS DE REANIMACIÓN. 13. 2.3 ALBÚMINA. 16. 2.4 POLIETILÉNGLICOL. 18. 3. METODOLOGÍA. 20. 3.1 PREPARACIÓN PEG-ALBÚMINA. 20. 3.1.1 Método I. 20. 3.1.2 Método II. 20. 3.2 MÉTODOS DE VALIDACIÓN. 21. 3.2.1 Electroforesis en Gel de Poliacrilamida. 21. 3.3.2 Cromatografía iónica. 26. 3.3 MÉTODOS DE CARACTERIZACIÓN. 26. 3.3.1 Medición de Viscosidad. 26. 3.3.2 Medición de Osmolalidad. 27. 4. RESULTADOS. 29. 4.1 PREPARACIÓN PEG-ALBÚMINA. 29. 4.2 VALIDACIÓN. 30. 4.

(5) IQ-2008-I-7. 4.2.1 Electroforesis en Gel de Poliacrilamida. 30. 4.2.2 Cromatografía Iónica. 31. 4.3 CARACTERIZACIÓN. 35. 4.3.1 Viscosidad. 35. 4.3.2 Osmolalidad. 36. 5. CONCLUSIONES. 38. 6. RECOMENDACIONES. 39. 7. BIBLIOGRAFÍA. 40. 5.

(6) IQ-2008-I-7. LISTA DE TABLAS Página Tabla 1: Cantidades para preparación de gel de poliacrilamida. 24. Tabla 2: Componentes del gel compactador. 24. Tabla 3: Resultados Cromatografía Iónica PEG activado. 31. Tabla 4: Resultados Cromatografía iónica Método I. 33. Tabla 5: Resultados Cromatografía iónica Método II 34. 34. Tabla 6: Rendimiento de las reacciones. 34. Tabla 7: Valores de viscosidad obtenidos. 36. Tabla 8: Valores de osmolalidad obtenidos. 36. 6.

(7) IQ-2008-I-7. LISTA DE FIGURAS Página Figura 1: Patrón de identificación de PM. 22. Figura 2: Partes de un gel de SDS-PAGE. 23. Figura 3: Monómero de PEG. 29. Figura 4: Reacción entre metóxido de polietilén glicol activado con. 29. cloruro cianúrico y albúmina humana Figura 5: Resultados electroforesis en gel de poliacrilamida. 30. Figura 6. Cromatograma PEG activado en solución. 32. Figura 7: Cromatograma Método I. 33. Figura 8: Cromatograma Método II. 34. 7.

(8) IQ-2008-I-7. RESUMEN La evaluación de diferentes metodologías para la producción de PEG-albúmina y la caracterización del producto obtenido es el objeto de este estudio. La electroforesis en gel de poliacrilamida y la cromatografía iónica fueron los métodos utilizados para validación. Se realizaron mediciones de viscosidad y osmolalidad para caracterizar el producto de la reacción. Se calculó el rendimiento de la reacción el cual fue 85.12% para el Método II y de 2.28% para el Método I.. The evaluation of different methods. to produce PEG-albumin and the. characterization of the final product is the aim of this study. The polyacrylamide gel electrophoresis and ionic exchange chromatography were the methods used in order to validate. Values of osmolality and viscosity were measured to characterize the product of the reaction. The yield of the reaction was calculated and it was observed that for the product with Method II the yield was 85.12% and 2.28% with Method I.. 8.

(9) IQ-2008-I-7. INTRODUCCIÓN. Desde finales del siglo XIX ha existido la inquietud a cerca de la mejor fórmula para tratar la pérdida de sangre. Durante la primera Guerra mundial, la hipovolemia por hemorragia era la principal causa del "shock circulatorio" y se descubrió que podía ser tratado administrando fluidos intravenosos. Los investigadores en el laboratorio y los clínicos han comprobado la efectividad de administrar coloides, cristaloides y/o sangre para tratar el shock hemorrágico, pero continúa la controversia sobre cuál es la elección óptima. En las últimas décadas ha adquirido gran importancia el riesgo relacionado con la patogénesis de las transfusiones (hepatitis, VIH) y el déficit de los bancos de sangre, todo aquello hace que los hemosustitutos (HS) sean considerados como una alternativa interesante. Estas sustancias podrían llegar a ser muy útiles en las próximas décadas por los problemas de consecución y almacenamiento de los productos sanguíneos. En el contexto de efectividad y seguridad, los HS podrían ofrecen grandes ventajas. [1] Se ha venido investigando cuál es el mejor HS experimentando con diferentes sustancias como lo son la hemoglobina, la hemoglobina encapsulada en liposomas y los perfluorocarbonos entre otros. Sin embargo, desafortunadamente, los sustitutos mencionados anteriormente no han logrado dar una respuesta efectiva al problema debido a los efectos secundarios generados. Por otro lado, se debe tener en cuenta, que los HS deben, además de cumplir con la función de transportar oxígeno, lograr mantener el volumen arterial para que sea un fluido de reanimación óptimo.. 9.

(10) IQ-2008-I-7. Hasta el momento en Colombia no se han reportado estudios en la elaboración y caracterización de fluidos de reanimación motivo por el cual una primera evaluación en la producción y caracterización de éstos fluidos es importante ya que puede brindar una posible solución a los casos de hipovolemia.. 10.

(11) IQ-2008-I-7. 1. OBJETIVOS 1.1 OBJETIVO GENERAL Caracterizar el producto de la reacción entre polietilén glicol (PEG) activado con cloruro cianúrico y albúmina humana.. 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS . Evaluar dos métodos reportados para la producción de polietilén glicolalbúmina.. . Caracterizar el producto PEG-albúmina obtenido evaluando la viscosidad y osmolalidad.. 11.

(12) IQ-2008-I-7. 2. MARCO TEÓRICO. 2.1 HEMOSUSTITUTOS La principal función de la sangre es la de transportar oxígeno. Los hemosustitutos (HS) no solo cumplen dicha función sino que además son expansores plasmáticos. Por otro lado ofrecen una solución a los problemas de seguridad que conllevan las transfusiones de sangre para los médicos durante su manipulación. [1, 2, 3] En 1930, Amberson inicia las primeras investigaciones con Hemoglobina (Hb) bovina en solución salina intravenosa, empleando animales con sobrevida de 36 días. La mortalidad fue causada por la disminución en la Hb circulante, observando también hipertensión arterial (HTA) sin variación en el consumo de oxígeno. Posteriormente se experimentó en humanos para tratar la anemia, restaurando en un 25% la volemia en pacientes con shock hemorrágico y observando una rápida recuperación de la presión arterial. Se encontraron como efecto secundario un aumento agudo de la presión arterial media (PAM) y disfunción renal. Adicionalmente a la restauración del volumen, observaron un aumento en la capacidad de transporte de oxígeno. Sin embargo, tuvo efectos secundarios debidos a una inadecuada purificación que podía activar la cascada del complemento por lo que era necesario remover los estromas de las células de los glóbulos rojos de la solución de Hb. La falla renal se debía a que cuando se filtra la Hb, se precipita en la rama ascendente el asa de Henle. Los desechos de glóbulos rojos permanecen en la Hb por una inadecuada purificación. [4]. 12.

(13) IQ-2008-I-7. Perfluorocarbonos Los trabajos pioneros de Clark y Collan fueron publicados en 1966. Ellos demostraron que las emulsiones fluorocarbonadas (PFC) tienen la capacidad de transportar. oxígeno,. cuando. reportan. la. sobrevida. de. un. ratón. que. accidentalmente estuvo sumergido en una solución perfluoro química por un periodo prolongado de tiempo. Los PFC son componentes sintéticos, soluciones aceitosas compuestas por hidrocarbonos donde se reemplazan dos átomos de carbono, por un ión bromuro y un ión cloruro. Químicamente son inertes y actúan como solventes de oxígeno, nitrógeno y dióxido de carbono. El componente fluorocarbonado puede disolver 40 a 50 volúmenes por ciento de oxígeno a una presión parcial de 160mmHg a 37°C, esto quiere decir, que el transporte de oxígeno es directamente proporcional a la presión parcial de oxígeno por lo tanto a mayor presión parcial mayor oxígeno se transporta. Son insolubles en agua pero se pueden infundir si se emulsifican y se separan con un surfactante. Los PFC al igual que las soluciones de Hb, tienen baja viscosidad mejorando su capacidad de entregar oxigeno a nivel tisular. [1] 2.2 FLUIDOS DE REANIMACIÓN El ambiente clínico es fundamental en la elección de los fluidos a reponer. El paciente en shock hipovolémico que ingresa al servicio de urgencia presenta un cuadro fundamentalmente distinto al del paciente que está séptico en la Unidad de Tratamiento Intensivo. La mayoría de los estudios clínicos sobre reposición de volumen provienen del campo de la medicina de urgencia y las recomendaciones clínicas son más claras en este tipo de pacientes. Sin embargo, el límite entre un paciente agudo (politraumatizado) y uno crónico (séptico) no siempre es claro, haciéndose muchas veces difuso en el tiempo. Más aún, la reanimación inicial. 13.

(14) IQ-2008-I-7. puede ser un factor fundamental en las alteraciones posteriores de la permeabilidad de un determinado paciente. [5] El principal objetivo de la reposición de volumen es mantener o restaurar el suministro de sangre a los tejidos. Es básico comprender que cualquier solución puede lograr este objetivo y ninguna en especial ha demostrado disminuir la mortalidad. De este modo, la elección del agente debe basarse en factores que involucren, además del costo y de las características propias del fluido, la magnitud y velocidad con que se presenta el déficit de volumen. En segundo lugar, es necesario evaluar el tipo de paciente. Las personas sanas, con mecanismos de compensación intactos, pueden tolerar por períodos más prolongados situaciones de hemorragia o hipovolemia y aceptar grandes aportes de volumen. Por otra parte, en presencia de insuficiencia cardiaca, el aporte de volumen debe hacerse de una forma más cuidadosa. En pacientes con deterioro previo de la función renal o hepática, pequeñas caídas del transporte de oxígeno tisular por hipovolemia pueden desencadenar insuficiencia renal o hepática respectivamente. La reanimación en ellos es más enérgica y con monitorización más estricta. Finalmente, es importante evaluar el efecto del trauma o de la patología basal sobre la regulación del agua corporal y el comportamiento de los distintos fluidos. Los pacientes sépticos (en quienes existe una alteración importante de la permeabilidad vascular) tienen un aumento del líquido extracelular (LEC) con un volumen circulante efectivo normal o disminuido y la vida media de los coloides en ellos está considerablemente disminuida. En pacientes con falla respiratoria el aporte excesivo de volumen puede ser mortífero en términos de oxigenación. En pacientes con patología neurológica, el manejo de la osmolaridad juega un rol. 14.

(15) IQ-2008-I-7. fundamental en el aporte de volumen. En todos estos casos, el uso de coloides versus cristaloides aún es tema de debate. [4] Los cristaloides son el fluido de reanimación de primera línea en todos los ambientes clínicos. Independiente de la causa que origina una hipovolemia, ya sea absoluta o relativa, los cristaloides pueden iniciarse en forma rápida y segura. [6, 7] El suero fisiológico y el lactato de Ringer son los cristaloides más usados en clínica. Si bien este último es ligeramente hipotónico, en la clínica se comportan y son considerados ambos como líquidos isotónicos. Al ser infundidos por vía intravascular se produce una rápida distribución en el LEC, aumentando tanto el volumen intravascular como el intersticial. De este modo, su efecto es transitorio y a las dos horas no más del 20% del volumen infundido se encuentra en el volumen intravascular. En pacientes con permeabilidad normal, como en el perioperatorio de cirugía menor a moderada, esta situación no genera grandes problemas. Sin embargo, en pacientes con grandes cambios de volumen, alteración de permeabilidad (sepsis, quemaduras) o con reserva cardiovascular disminuida, el uso de grandes cantidades de soluciones isotónicas puede llevar a problemas posteriores. Los coloides, también llamados expansores del plasma, expanden en primera instancia el volumen intravascular por períodos más prolongados que los cristaloides. El tamaño de los poros vasculares es de aproximadamente 65 Å, con lo cual macromoléculas con peso molecular (PM) mayor a 10.000Daltons encuentran dificultades para cruzar al intersticio y ejercen de este modo una diferencia de presión oncótica que atrae agua al volumen intravascular. A nivel glomerular, la. 15.

(16) IQ-2008-I-7. insulina (PM 5.200) se filtra libremente hacia el sistema tubular, en cambio la mioglobina (PM 17.000) sólo lo hace parcialmente. La capacidad de mantener el volumen administrado en el espacio intravascular depende del PM y de la permeabilidad vascular. Mientras mayor sea el tamaño de la molécula mayor será su efecto sobre la presión parcial de CO y más tiempo permanecerá en el organismo hasta ser excretada o metabolizada. Sin embargo, a diferencia de la albúmina, los coloides sintéticos son suspensiones con moléculas de tamaños y pesos moleculares diferentes, y el PM que se describe es el PM promedio de las distintas moléculas. Así, la capacidad oncótica real de un coloide estará dada, más que por su peso molecular, por el número de moléculas con PM mayor a 20.000 o 30.000Daltons. [4] La gran ventaja del uso de coloides con respecto a los cristaloides está en su mayor capacidad de mantener el volumen intravascular. A igual volumen de solución infundida habrá mejores parámetros hemodinámicos y menor edema intersticial. Sin embargo, en pacientes con permeabilidad vascular aumentada los coloides filtran con mayor facilidad hacia el espacio extravascular, ejerciendo una presión oncótica en ese compartimiento incrementa el edema intersticial y hace más difícil su manejo. En pacientes con insuficiencia respiratoria grave, el uso de coloides puede significar un deterioro grave en los parámetros de oxigenación. [4] 2.3 ALBÚMINA La albúmina humana es el expansor plasmático natural contra el cual los coloides sintéticos son comparados. A diferencia de éstos, la albúmina posee una característica única al ser una solución monodispersa, o sea todas las moléculas son del mismo tamaño (69.000Da). Su vida media es de 18 horas y la duración clínica de 6 a 12 horas dependiendo de la patología subyacente. La gran ventaja. 16.

(17) IQ-2008-I-7. del uso de albúmina y otros coloides con respecto a los cristaloides está en su mayor capacidad de mantener el volumen intravascular. A igual volumen de solución infundida habría mejores parámetros hemodinámicos y menor edema intersticial. Sin embargo, en pacientes con permeabilidad vascular aumentada, los coloides filtran con mayor facilidad hacia el espacio extravascular, ejerciendo su presión oncótica en ese compartimiento e incrementando el edema intersticial. A pesar de que la albúmina al 3-5% es considerada por muchos como el "coloide ideal", su uso es restringido por el alto costo de la solución. [8, 9] De las proteínas del plasma, la albúmina es la más importante para determinar la presión oncótica. La albúmina ejerce gran fuerza osmótica que se considera únicamente debido al número de moléculas disueltas en una unidad de volumen en el plasma. Por lo tanto, no puede ser reemplazada en su totalidad por sustancias inertes de peso molecular apropiado, como dextrán. La fuerza osmótica puede volverse mucho mayor a altas concentraciones de albúmina, como en el caso del plasma, y dicha fuerza es débil cuando hay ausencia de albúmina en soluciones diluidas de un fluido intersticial. La razón del comportamiento de la albúmina, es su carga negativa cuando el pH de la sangre es normal. La albúmina enlaza un pequeño número de iones cloruro que aumentan la carga negativa, y por lo tanto tiene la habilidad de retener iones de sodio dentro de los capilares. Este aumento en la concentración de electrolitos en el plasma sobre el fluido intersticial producido por la carga negativa de la albúmina incrementa la fuerza osmótica a la de una solución ideal que contiene un soluto de peso molecular 37.000. Si la albúmina tuviera un peso molecular de 37.000 no sería retenida en el endotelio capilar por su bajo peso molecular. De cualquier forma, si la albúmina no ejerce un incremento en la presión osmótica, una concentración de 12g de albúmina por decilitro de plasma se requeriría para alcanzar una presión oncótica en el plasma de 25mmHg. Mayor concentración de. 17.

(18) IQ-2008-I-7. albúmina incrementa la viscosidad de la sangre y por lo tanto aumenta también la resistencia del flujo sanguíneo a lo largo del sistema vascular. [10] 2.4 POLIETILÉN GLICOL El polietileno glicol (PEG) es un compuesto que ayuda a aumentar la dilución de oxígeno en el plasma. Normalmente, la mayoría del oxígeno se diluye en los glóbulos rojos y sólo una pequeña fracción en el plasma, por lo tanto, es importante suministrar un fluido que propicie la dilución de oxígeno en el plasma y que de ésta forma, la pérdida de sangre no cause daños adicionales en órganos vitales por falta de oxígeno. [10] El PEG de peso molecular 5.000daltons está compuesto por una cadena de 113 monómeros que tiene una estructura (O-CH2CH2-)n. Usualmente es un polímero que tiene una estructura lineal para pesos moleculares por debajo de los 10kDa, sin embargo, para pesos moleculares mayores puede presentar algunas ramificaciones. PEG de diferentes pesos moleculares están siendo usados en numerosas aplicaciones, incluyendo el. incremento. en. la. solubilidad. de. medicamentos. Durante las tres últimas décadas, el PEG ha sido altamente investigado para transporte de proteínas por vía parenteral. El PEG activado es susceptible de reaccionar con diferentes grupos funcionales tales como el grupo hidroxilo, grupo amino o grupo tiol, resultando en la formación de bio-polímeros. Esos grupos funcionales se derivan de péptidos, proteínas, sacáridos, polisacáridos y oligonucleótidos. Los bio-polímeros son utilizados en aplicaciones. químicas,. alimenticias,. dermofarmacéuticas. [11]. 18. cosméticas,. farmaceúticas. y.

(19) IQ-2008-I-7. El metóxido de polietilén glicol (mPEG) generó mucho interés cuando se utilizó por primera vez para modificar la superficie de las proteínas y enzimas con el objeto de reducir la inmunogenicidad para sus potenciales aplicaciones como fluido de reanimación. El mPEG puede ser usado como un hemosustituto cuando se enlaza covalentemente a una proteína como la hemoglobina o en este caso a la albúmina. Cuando la superficie de la proteína se recubre con mPEG, la absorción de proteínas se ve reducida al igual que la agregación plaquetaria. Muchos de los hidrogeles a base de PEG son producto de la unión entre PEG y una proteína. Se ha demostrado que el PEG puede ser considerado por sí mismo, un polímero e hidrogel útil en muchas aplicaciones biomédicas por sus propiedades. Es un material no-trombogénico, presenta baja toxicidad, está aprobado por la FDA (Food and Drugs Agency) para uso en productos alimenticios y farmacéuticos que sean administrados vía intravenosa, oral o tópica. [12]. 19.

(20) IQ-2008-I-7. 3. METODOLOGÍA 3.1 PREPARACIÓN PEG-ALBÚMINA Se evaluarán dos métodos reportados para la producción de PEG-Albúmina con el fin de comparar los productos obtenidos por cada metodología. 3.1.1 Método I Disolver 2 gramos de albúmina humana en 45ml de fosfato de potasio (mono y di básico) 50mM con pH 7.4. Disolver 500mg de metóxido de polietilén glicol activado con cloruro cianúrico (G&G Sucesores) en 4ml de agua. Agregar 1.4ml de la solución de metóxido de polietilén glicol a los 45ml de la solución de albúmina humana. Agitar la mezcla por dos horas a temperatura ambiente. La mezcla se debe transferir a un tubo de diálisis (corte del peso molecular-12500) para ser dializada con 3000ml de fosfato de potasio a 4°C por 72 horas. El polietilén glicol modificado con albúmina (PEGA) debe ser almacenado a -20°C hasta su uso. [13] 3.1.2 Método II Disolver 50-60mg de albúmina por mililitro de fosfato de potasio 50mM pH 7.5. Agitar muy lentamente. Agregar 4 veces, en intervalos de 10 minutos, 0.2mg de metóxido de polietilén glicol activado con cloruro cianúrico por cada miligramo de albúmina a 22°C. Se continúa agitando la mezcla por 40 minutos después de la última adición de reactivo.. 20.

(21) IQ-2008-I-7. El producto final debe someterse a diálisis 48 horas antes de ser inyectado. La diálisis se realiza en una solución de fosfato de potasio usando una membrana de diálisis con corte molecular 50kDa y haciendo 3 cambios de solución. [13] 3.2 MÉTODOS DE VALIDACIÓN 3.2.1 Electroforesis en Gel de Poliacrilamida Los geles de poliacrilamida son un excelente medio de soporte para separaciones electroforéticas, debido a que poseen una serie de propiedades adecuadas: transparencia, elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad de compuestos químicos. La poliacrilamida se forma por copolimerización de dos compuestos, la acrilamida y la bis-acrilamida (N,N'-metilén-bis-acrilamida), en una reacción iniciada por la tetrametiletiléndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio. El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al monómero de acrilamida para que se polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bisacrilamida, formándose así una red de porosidad bastante uniforme, que puede ser regulada variando las condiciones de la reacción y las concentraciones de los monómeros. [14] De las diferentes técnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE, por sus siglas en inglés "polyacrylamide gel electrophoresis"), probablemente la más utilizada es aquella que se lleva a cabo en presencia del detergente duodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), tanto para analizar mezclas de proteínas, como para ser combinada con técnicas de inmunoelectrotransferencia. En la técnica de SDS-PAGE, se mezclan las proteínas con el detergente aniónico SDS para formar complejos desnaturalizados, cargados negativamente. La cantidad de SDS unido a las proteínas es proporcional a su tamaño: el SDS se une en una proporción aproximada de 1,4 g SDS/g proteína. Los complejos proteína-SDS poseen una estructura elipsoide o de bastón, donde la cadena proteica es. 21.

(22) IQ-2008-I-7. distendida y solubilizada por el detergente. Dado que la relación final carga/masa queda constante para las distintas proteínas (se anula su carga intrínseca), estas van a ser separadas en el gel poroso fundamentalmente con base en sus diferencias de peso molecular (PM): a menor tamaño, mayor movilidad de la proteína, y viceversa. [14] Esta técnica permite estimar el peso molecular (PM) de una proteína, comparando su movilidad electroforética con la de proteínas de PM conocidas. Ver Figura 1. La determinación posee un margen de error de aproximadamente 10%. La determinación del PM de proteínas mediante SDS-PAGE es válida cuando se analizan cadenas proteicas individuales (subunidades), en donde se han reducido todos los enlaces disulfuro y por lo tanto, se ha distendido toda la cadena proteica para su interacción con el SDS. Bajo estas condiciones, la migración de las moléculas obedece fundamentalmente a su PM. [14]. Figura 1: Patrón de identificación de PM. 22.

(23) IQ-2008-I-7. La técnica de SDS-PAGE posee un alto poder de resolución. Lo anterior se deriva del uso de un sistema electroforético discontinuo, formado de dos geles de distinta porosidad y pH, que primero compactan las muestras (en el gel superior o compactador) y luego las separan (en el gel inferior o separador). Ver Figura 2. Está compuesto de dos geles de distinta porosidad y pH, que cumplen funciones diferentes, para aumentar el poder de resolución.. Figura 2: Partes de un gel de SDS-PAGE. [14] En el gel separador, la movilidad es restringida por el tamaño del poro, el cual depende de la concentración de monómeros del gel. Así, si se requiere resolver componentes de muy alto PM, se utilizan geles al 5% o al 7,5%, mientras que los geles de poro menor, ej. 15-20% son útiles en la separación de péptidos y proteínas pequeñas. Los geles de poro intermedio (10-12%) proveen una separación adecuada para proteínas entre 10.000-90.000 Daltons. [14] Preparación de geles para SDS-PAGE [14] 1. Para la preparación del gel separador o inferior, mezclar los reactivos en un beaker de 50ml, según el porcentaje de gel deseado (Tabla 1),:. 23.

(24) IQ-2008-I-7. Tabla 1: Cantidades para preparación de gel de poliacrilamida Componente concentración final 20%. 15%. 12%. 10%. 7.5%. 5%. Agua desionizada (µl). 367. 1167. 1683. 2000. 2367. 2783. Amortiguador separador (µl). 1250. 1250. 1250. 1250. 1250. 1250. 50. 50. 50. 50. 50. 50. 3333. 2500. 2000. 1667. 1250. 833. SDS (µl) Archilamida / Bisacrilamida (µl). 2. Preparar el molde para el gel. Hacer una marca a 1-1.5 cm debajo del nivel de la peinilla de muestras. Retirar la peinilla. 3. Con la mezcla de reactivos a temperatura ambiente, iniciar la polimerización agregando 3ml de TEMED y 15ml de persulfato de amonio a la mezcla. Inmediatamente mezclar y verter la solución en los vidrios, hasta la marca hecha en el paso 2, sin atrapar burbujas. Posteriormente se debe eliminar el menisco en la superficie, agregando una delgada capa (1-2 mm) de agua destilada o de isobutanol. Dejar que polimerice el gel. 4. Una vez que la interfase entre el polímero y el agua es visible, esperar 10-15 min adicionales para que se complete la reacción. Después, decantar el exceso de líquido de la superficie, y colocar la peinilla para muestras. 5. Mezclar los componentes del gel superior o compactador como se indica en la Tabla 2. Tabla 2: Componentes del gel compactador Componente Cantidad Agua desionizada (ml). 1.500. Amortiguador superior (µl). 630. SDS (µl). 33. Archilamida / Bisacrilamida (µl). 330. TEMED (µl). 2. Persulfato de amonio (µl). 10. 24.

(25) IQ-2008-I-7. 6. Una vez agregados los catalizadores, mezclar y verter de inmediato en el molde, sin atrapar burbujas. Dejar polimerizar. 7. Quitar la peinilla deslizándolo suavemente, y lavar los hoyos llenándolos con agua y aspirando luego con una jeringa. Esto elimina residuos de componentes no polimerizados. 8. Preparar las muestras. Estas se pueden analizar en estado reducido o no reducido, mezclándolas con el respectivo amortiguador de muestras. Si las muestras son sólidas, se pueden disolver directamente en el amortiguador. Si son líquidas, se mezclan partes iguales de muestra y amortiguador. Para reducir los enlaces disulfuro de las muestras debido al amortiguador reductor, se colocan en baño de agua a ebullición durante 4-5 min. Para correr muestras no reducidas, se mezclan con amortiguador (sin reductor) y se aplican al gel directamente, sin calentamiento. 9. Sembrar las muestras en los hoyos (10µl). Es necesario realizar estos pasos sin que haya contaminaciones cruzadas entre los distintos hoyos. Se debe sembrar una muestra de marcadores de PM en uno de los carriles, como referencia. 10. Llenar la cámara con el amortiguador de cámara. Colocar el gel en la cámara y correr las muestras a 18mA hasta que el azul de bromofenol llegue casi al borde inferior del gel. 11. Sacar el gel y sumergirlo en una solución para fijar proteínas durante 1 hora con agitación suave en un recipiente tapado para evitar los vapores tóxicos del metanol. 12. Teñir el gel durante 30min con azul Coomassie. 13. Eliminar el exceso de colorante con varios cambios del decolorador. 14. Registrar los resultados. El gel puede secarse sobre un papel de filtro grueso, o entre trozos de celofán especial.. 25.

(26) IQ-2008-I-7. 3.3.2 Cromatografía Iónica La Cromatografía Iónica es una variante de la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). Es un método eficaz para la separación y determinación de iones, basado en el uso de resinas de intercambio iónico. Cuando una muestra iónica atraviesa estas columnas, los iones presentes sufren una separación debido a las diferentes reacciones que ocurren al interactuar con la fase estacionaria de las columnas analíticas: aquellos componentes que son retenidos con más fuerza por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario, los componentes que se unen más débilmente a la fase estacionaria, se mueven con más rapidez. Al salir de la columna, la muestra pasa a través de un detector (conductimétrico, amperométrico, etc) donde se registra la señal obtenida respecto al tiempo de retención. El resultado son unos cromatogramas donde la posición de los máximos nos indica el ión presente y su área indica la cantidad existente de dicho ión. [15] 3.3. MÉTODOS DE CARACTERIZACIÓN 3.3.1 Medición de viscosidad La medición de la viscosidad es un factor muy importante cuando se trata de un fluido de reanimación cuyo objetivo sea restaurar volumen arterial. La Presión Arterial. (PA). disminuye. radicalmente. cuando. hay. hipovolemia. y. como. consecuencia no llega sangre a los órganos blancos (cerebro, riñón y corazón) que son los que más la necesitan. La PA es una función del Gasto Cardíaco (GC) y de la Resistencia Vascular Periférica (RVP). El Gasto Cardíaco hace referencia al volumen de sangre que el corazón bombea por minuto y es un valor constante que se encuentra entre 5 y 6 Litros por min a condiciones normales. La RVP es función de la viscosidad y del diámetro del tracto vascular (4/3πr4). Para mantener la PA,. 26.

(27) IQ-2008-I-7. podría modificarse dos factores: el radio o la viscosidad. Cualquier cambio en el radio, por pequeño que sea, el corazón no podría soportarlo debido a que al estar elevado a una cuarta potencia tiene mayores repercusiones, sin embargo un incremento en la viscosidad puede ser la solución para mantener la RVP. La medición de la viscosidad se hizo mediante un reómetro AR-G2 (TA Instruments). Se requiere de una muestra de 700µl aproximadamente para hacer la medición. Teniendo en cuenta que la solución será suministrada a seres vivos se programó la medición a una temperatura de 37°C. [16] 3.3.2 Medición de osmolalidad La osmolalidad mide la concentración de las partículas en solución, aumenta con la deshidratación y disminuye con la sobrehidratación. En las personas normales, un incremento de la osmolalidad en la sangre estimula la secreción de hormona antidiurética (HAD) que produce un aumento de la reabsorción del agua, una orina más concentrada y un plasma menos concentrado. Una osmolalidad baja en el suero inhibe la liberación de HAD, lo cual produce una disminución de la reabsorción del agua y un plasma más concentrado. La osmolalidad es una medición de la concentración de en osmoles/litro en vez de moles/litro de solución usado en medicina. [17] La osmolalidad plasmática se mantiene constante en condiciones normales de 285± 4 mOsm/kg, cuando los líquidos corporales conservan dicha osmolalidad se los considera isotónicos, calificándolos como hipotónicos o hipertónicos, si la concentración osmótica es inferior o superior a dichos valores. En un individuo normal la osmolalidad es mantenida dentro de límites bastante rígidos, esa constancia es asegurada por la sensación de sed o la necesidad de ingerir sal, desde luego que esta necesidad no se presenta, debido a que la ingestión de. 27.

(28) IQ-2008-I-7. sodio cotidianamente supera los requerimientos.. Además de la ingestión de agua y sodio, se dispone de mecanismos especiales para el control de la osmolalidad, así por ejemplo la carencia de agua determina una concentración de los solutos que estimulan a los osmoreceptores, desencadenando la sobrecarga de hormona antidiurética (H.A.D.), eliminando una orina concentrada, la ausencia de H.A.D. determinará una eliminación de grandes cantidades de orina diluida. Además de la H.A.D., la aldosterona desempeña un papel importante en la regulación de la osmolalidad. Los electrólitos son los responsables en el 98% del control de la osmolalidad, constituyendo el sodio el principal catión extracelular, se puede afirmar que su concentración plasmática puede ser adaptada como índice de osmolalidad eficaz. También existen substancias no electrolíticas, que por su gran difusibilidad, como ser la glucosa y los compuestos nitrogenados no proteicos son capaces de influenciar sobre los osmoreceptores. [18] La medición de osmolalidad se realizó en un osmómetro, FISKE Model 110 OSMOMETER. [19] Se toman 15µl de la muestra para ser analizados en el osmómetro.. 28.

(29) IQ-2008-I-7. 4. RESULTADOS 4.1 PREPARACIÓN PEG-ALBÚMINA El PEG que se utilizó para el desarrollo de éste trabajo tiene en peso molecular aproximado de 5000Da. Está compuesto por una cadena de 113 monómeros de PEG, ver Figura 3.. Figura 3: Monómero de PEG. [20] El PEG fue activado previamente con cloruro cianúrico, para facilitar la reacción posterior. El grupo amino de la proteína albúmina se disocia y libera un ión hidroxilo, el cual se une al ión cloruro que se libera del PEG activado formando por un lado PEG-Albúmina y por otro HCl como subproducto.. CH3(-O-CH2-CH2)n-O-. + H2N-PROTEIN (Albúmina). CH3(-O-CH2-CH2)n-O-. + HCl. Figura 4: Reacción entre metóxido de polietilén glicol activado con cloruro cianúrico y albúmina humana. [21] Es de gran importancia someter la mezcla final a una diálisis para remover el HCl remanente en la solución antes de ser suministrado al paciente.. 29.

(30) IQ-2008-I-7. 4.2 VALIDACIÓN 4.2.1 Electroforesis en Gel de Poliacrilamida En la Figura 5 se presenta la foto de la electroforesis realizada a las muestras obtenidas por las dos metodologías diferentes que se mencionaron anteriormente.. Figura 5: Resultados electroforesis en gel de poliacrilamida. En la Figura 5 se puede observar que la banda obtenida para la albúmina está perfectamente definida por tratarse de una proteína pura. A diferencia de la albúmina, la albúmina modificada con PEG activado, no es una proteína ideal, por lo tanto, este material no entra fácilmente al gel. Para las proteínas no ideales, la movilidad electroforética es básicamente un reflejo de su naturaleza y no exactamente de su peso molecular.. 30.

(31) IQ-2008-I-7. 4.2.2 Cromatografía Iónica Inicialmente se corrió una muestra de PEG activado disuelto en agua destilada para descartar que el cromatógrafo identificara iones cloruro en compuestos orgánicos como el PEG y así poder calcular el rendimiento de cada reacción. Tabla 3: Resultados Cromatografía Iónica PEG activado. No. 1. Time min 4.65. Peak Name. Type. Nitritos. BMB. Area µS*min 0.050 0.05. TOTAL:. Height µS 0.226 0.23. Amount mg /L n.a. 0.00. Como se observa en el cromatograma de la Figura 6, sólo hubo un pico que corresponde a nitritos, sin embargo la cantidad no es detectable por ser tan baja. En la muestra no se esperaría la detección de ningún ión en la muestra por ser de carácter orgánico, es posible que la cantidad de iones nitrito detectada, sea residuo de algún blanco corrido antes de la muestra. Una vez hecha la prueba al PEG activado se procedió a correr las muestras resultantes de los dos métodos en el cromatógrafo.. 31.

(32) IQ-2008-I-7. 0,350 ANIPICCAP13-06-08 #19 µS. ECD_1. 1 - Nitritos - 4,647. 0,300. 1083-08. 0,250. 0,200. 0,150. 0,100. 0,050. 0,000. -0,050 0,0. min. 2,0. 4,0. 6,0. 8,0. 10,0. 12,0. 14,0. 16,0. Figura 6. Cromatograma PEG activado en solución. Las muestras obtenidas por los diferentes métodos fueron diluidas por un factor de 20 de tal manera que la cantidad de muestra fuera suficiente para hacer la corrida. La cantidad de cloruro en la muestra que se obtuvo por el método I es muy baja en comparación con el Método II.. 32.

(33) IQ-2008-I-7. Tabla 4: Resultados Cromatografía iónica Método I. 1 2 4. Time min 4.20 4.62 10.00. Peak Name. Type. Cloruro Nitrito Fosfato TOTAL:. Area µS*min 0.015 0.024 0.004 0.04. BM M BMB. Amount mg/L 1.2570 3.0537 1.0188 5.33. 1086D. 1 - Cloruro - 4,200. 0,250. 0,200. 3 - 5,073. 0,150. ECD_1. 2 - Nitrito - 4,623. 0,300 PICCAP 18-06-08 #40 µS. Height µS 0.110 0.107 0.013 0.23. 4 - Fosfato - 10,000. No.. 0,100. 0,050. -0,000. -0,050. -0,100. -0,150 0,0. m in. 1,3. 2,5. 3,8. 5,0. 6,3. 7,5. Figura 7: Cromatograma Método I. 33. 8,8. 10,0. 12,0.

(34) IQ-2008-I-7. Tabla 5: Resultados Cromatografía iónica Método II No. 1 2 3. Time Min 4.21 4.63 5.38. Peak Name. Type. Cloruro Nitrito Sulfato TOTAL:. BM MB Rd. Height µS 48.567 0.775 0.071 49.41. Amount mg /L 580.1948 32.7730 1.2540 614.22. 1085D. ECD_1. 1 - Cloruro - 4,207. 70,0 PICCAP 18-06-08 #38 µS. Area µS*min 6.929 0.262 0.011 7.20. 60,0. 50,0. 40,0. 30,0. 2 - Nitrito - 4,627. 10,0. -5,0 0,0. 3 - Sulfato - 5,383. 20,0. min. 1,3. 2,5. 3,8. 5,0. 6,3. 7,5. 8,8. Figura 8: Cromatograma Método II. 34. 10,0. 12,0.

(35) IQ-2008-I-7. Conociendo la cantidad de PEG activado utilizado para cada experimento, se puede saber la cantidad de cloruro que se debería obtener posterior a la reacción. Utilizando los valores obtenidos por el método de cromatografía iónica, se calculó el rendimiento de cada una de las reacciones, ver Tabla 6. Tabla 6: Rendimiento de las reacciones Cantidad de Cantidad de Cantidad de Cl inicial en Muestra PEG en la la muestra Original (L) muestra (mg) (mg) PEG Método I Método II. Cantidad Cl inicial en la muestra (mg/L). Cantidad de Rendimiento Cl obtenido (%) (mg/L). 0.0007. 125. 1.775. 2535.71. 0. 0.00. 0.0225. 87.5. 1.2425. 55.22. 1.257. 2.28. 0.002. 96. 1.3632. 681.60. 580.1948. 85.12. El rendimiento obtenido por el Método II es mucho mayor que el rendimiento obtenido por el Método I. A pesar que el Método II, podría someterse a mejoras, el Método I debe ser estudiado a profundidad para evaluar el efecto del pH sobre el rendimiento de le reacción. 4.3 CARACTERIZACIÓN 4.3.1 Viscosidad La medición de la viscosidad es un parámetro importante a medir debido a que es el único factor modificable para mantener la RVP y aumentar la PA sin tener implicaciones negativas. Se tomaron los valores de la viscosidad por triplicado para cada muestra.. 35.

(36) IQ-2008-I-7. Tabla 7: Valores de viscosidad obtenidos Viscosidad (cP) @37°C Método I. 2.20 ± 0.02. Método II. 2.90 ± 0.01. Sangre. 1.0-1.8. En la Tabla 7, se puede observar que por el Método II se puede obtener valores de viscosidad que duplican el valor de viscosidad de la sangre, por lo tanto se puede decir que se logró el objetivo. 4.3.2 Osmolalidad Tabla 8: Valores de osmolalidad obtenidos Osmolalidad (mOsm) PEG Activado. 202 ± 2. Método I. 146 ± 2. Método II. 68 ± 2. Plasma. 285 ± 4. Se esperaba que la osmolalidad de la solución obtenida por el Método II fuera mayor debido a que al haber tenido un mayor rendimiento también debía dar una mayor osmolalidad a causa del HCl producido, sin embargo, el PEG activado en solución sin reaccionar tiene una osmolalidad de 202 mOsm, por tal motivo el Método I que tuvo un rendimiento bajo, posee una osmolalidad mayor. Para el estudio de las soluciones de PEG-Albúmina in-vivo, la solución debe ser sometida previamente a diálisis durante 48horas. Los valores obtenidos de la. 36.

(37) IQ-2008-I-7. medición de osmolalidad, posteriores a la diálisis se espera que sean menores ya que la solución debe estar libre de HCl. Es deseable que la solución utilizada como fluido de reanimación sea isotónica por tal motivo posterior a la diálisis se le debe adicionar electrolitos de tal forma que la formulación obtenida posea unos valores de osmolalidad cercanos a los del plasma, en un rango entre 285 y 295 mOsm.. 37.

(38) IQ-2008-I-7. 5. CONCLUSIONES Se logró producir PEG-Albúmina. Si se comparan los dos métodos utilizados, se podría decir que el Método II a las condiciones utilizadas es más eficiente que el Método I debido a que se obtiene mayor rendimiento de la reacción y una mayor viscosidad de la solución. Las soluciones obtenidas poseen valores de viscosidad mayores al valor de viscosidad de la sangre que se encuentra en un rango entre 1.0 y 1.8 cP. Para utilizar el producto PEG-Albúmina obtenido es necesario investigar cuál es la formulación adecuada. El resultado de ésta investigación es únicamente parte de la formulación para un fluido de reanimación a base de PEG-albúmina, sin embargo es necesario adicionar electrolitos a la solución que se vaya a suministrar a un paciente de tal forma que sea una solución isotónica. Si la solución es hipotónica, puede hemodiluir al paciente y causar su muerte. Por las características tanto del PEG como de la albúmina, se puede suponer que la solución obtenida puede llegar a funcionar como fluido de reanimación mientras haga parte de una correcta formulación. Adicionalmente se deben realizar ensayos in vivo para evaluar el comportamiento y evolución del paciente.. 38.

(39) IQ-2008-I-7. 6. RECOMENDACIONES La reacción que se lleva a cabo es relativamente sencilla, sin embargo se deben tener en cuenta varias recomendaciones: . Es muy importante guardar el metóxido de polietilén glicol perfectamente cerrado a -20°C. Por su carácter higroscópico no se recomienda dejar expuesto al ambiente. Al menor contacto con el agua se degrada rápidamente.. . El pH del Buffer debe estar alrededor de 7.5. Entre más básica sea la solución se favorece la reacción debido a que facilita la disociación del grupo amino de la proteína.. . La electroforesis en gel de poliacrilamida es una técnica muy sensible a la concentración, si la concentración de proteínas es muy alta se obtendrá una mancha en el gel, de ser muy baja, no se podrá identificar el peso molecular de la solución. Después de varios ensayos, utilizando una concentración para albúmina de 5mg en 1ml de agua y para la solución de albúmina modificada con PEG de 10µl en 1ml, se obtuvieron bandas perfectamente legibles.. . Se debe realizar una diálisis antes de suministrar el producto al paciente debido al contenido de HCl que se forma como subproducto de la reacción principal.. . Sería muy interesante poder producir el PEG activado debido a los costos tan altos que representa debido a la importación del producto.. 39.

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