Rev. Latin. Perinat. 2016, 19 (2)
Resumen
Se examina el rendimiento del test prenatal no invasivo (TPNI) en una población general de Venezuela. Se obtuvieron 513 muestras de ADN fetal en sangre materna. A las pacientes con reporte de alto riesgo en TPNI se les ofreció un estudio invasivo confirmatorio por biopsia de vellosidades coriales en el primer trimestre o amniocentesis en el segundo trimestre de la gestación. A las pacientes con reporte de bajo riesgo se les realizó seguimiento ecográfico y se consideraron negativas posterior a la confirmación postnatal del fenotipo. 19 (3,7%) de las 513 muestras reportaron alto riesgo para aneuploidías. Se reportaron 5 trisomías 21, 2 trisomías 18, 1 caso de trisomía 13, 3 casos de monosomía X y 7 casos de trisomías de cromosomas sexuales. Un falso positivo (0,19%). La tasa de detección fue de 99,81%. La sensibilidad de la prueba fue de 100%, con una especificidad de 99,8%.
Asimismo, se obtuvo un valor predictivo positivo de 95% y valor predictivo negativo de 100%; con un cociente de probabilidad positivo de 495 y un cociente de probabilidad negativo de 0,00. El TPNI es una prueba con alta capacidad para la detección de trastornos cromosómicos que debe ser integrada al asesoramiento genético.
PALAbrAS cLAVE: Prueba prenatal de ADN no invasivo. ADN fetal en sangre materna. Defectos congénitos.
ABsTRACT
A cell-free DNA (cfDNA) testing for chromosomal anomalies in a general population of Venezuela is reported. 513 samples of cfDNA samples were scored in high or low risk for chromosomal abnormalities.
High-risk patients were presented with invasive confirmatory testing of fetal karyotype, either chorionic villus sampling in the first trimester or amniocentesis in the second trimester. Low-risk patients were followed with ultrasound screening and were scored as negative once normal phenotype was reported at birth. 19 (3.7%) of the 513 samples were reported as high-risk for aneuploidies. Fifteen cases were confirmed prenatally and two through postnatal karyotype. Five cases of trisomy 21, two of trisomy 18, one case of trisomy 13, three cases of X monosomy, and seven cases of trisomy of sexual chromosomes were reported. One false positive case (0.19%). Detection rate was 99,81%, with a sensitivity of 100%, and specificity of 99.8%. Positive predictive value and negative predictive value were 95% and 100%, respectively. Positive likelihood ratio of 495 and negative likelihood ratio of 0. cfDNA testing is a highly accurate and reliable test for the detection of chromosomal disorders and must be integrated to prenatal genetic counselling.
KEYWOrDS: DNA prenatal non invasive maternal blood test. congenital malformation diagnosis.
InTRoduCCIón
Desde la incorporación de los métodos de tamizaje destinados a la identificación de fetos con riesgo de padecer un trastorno cromosómico, se ha insistido enfáticamente en la necesidad de mejorar las tasas de detección y disminuir el número de procedimientos diagnósticos invasivos, lo que secundariamente incidiría en la reducción de la tasa de pérdida fetal atribuible a dichos procedimientos. Inicialmente, se consideró solo la edad materna como criterio de riesgo
1 Profesor Postgrado Perinatología. Hospital Universitario de caracas, Venezuela.
2 Unidad de Perinatología Policlínica Metropolitana.
ARTÍCuLo oRIGInAL
Adn fetal en sangre materna
Fetal dnA in maternal blood
Dr. Juan Andrés Pérez Wulff
1Dr. Daniel Márquez contreras
1Dr. ramiro Diaz Primera
2Dr. Jonel Di Muro Ortega
3Dr. Freddy González A.
4Dr. rodrigo Fernandez Diaz.
2Dr. Carlos Bermúdez.
2:(95) Fecha de recepción: 13 de octubre del 2015
Fecha de aceptación: 18 de marzo del 2016
para el asesoramiento genético. Así, una embarazada con una edad igual o mayor a 35 años, se calificaba como de alto riesgo para la concepción de un producto portador de aneuploidías. Estadísticamente, esta edad cronológica como punto de corte, arroja una tasa de detección (TD) de 30%; con una tasa de falsos positivos (FP) de 5% (1). Años más tarde se introducen los marcadores séricos maternos (2), donde el análisis de α-fetoproteína (AFP), estriol no conjugado (uE3) y gonadotrofina coriónica humana (hCG), en conjunto con la edad materna constituyen el triple screening; aportando una TD de 60%, con 5% de FP en madres menores de 35 años. Esto último de importante acotación, ya que dicho método de tamizaje, realizado en madres mayores de 35 años, evidencia un aumento de la tasa de FP a 25% (3- 7). El triple screening es actualmente el método de detección prenatal de mayor difusión en nuestro país y en algunos de Latinoamérica; incluso fue durante años el método de tamizaje estándar en los Estados Unidos (8). Con la incorporación de la inhibina-A y la consecuente constitución del cuádruple screening, se logra obtener un tamizaje más eficiente al alcanzar una TD de 78% manteniendo la misma tasa de FP (9).
La introducción del ultrasonido y en particular de la translucencia nucal en 1990 (10,11), ha contribuido con mejorar notablemente las tasas de detección prenatal de cromosomopatías. Sumando a este marcador ecográfico la edad materna y dos (02) marcadores séricos, la Proteína Plasmática A Asociada al Embarazo (PAPP-A) y la ß-hCG, se constituye la Prueba Combinada (PC), la cual ofrece una TD de 90% con 5% de FP, al realizarla entre las semanas 11 y 13 más 6 días de gestación (12). Se ha intentado adicionar otros marcadores ecográficos a la Pc o incluso asociarla al cuádruple screening a fin de mejorar la tasa de detección; sin embargo estas pruebas requieren la realización de ultrasonido por personal especialmente entrenado. En otros casos, la información se obtiene en forma tardía, sin lograr reducir por debajo del 5% la tasa de FP. Esta situación condiciona un incremento en el número de procedimientos invasivos con fines diagnósticos, reportando tasas de pérdida fetal atribuibles a los mismos entre 1 y 2% (13-14), importancia exacerbada por el hecho de que alguno de estos fetos cursarán con un cariotipo normal.
Investigaciones recientes han demostrado que un 3 a 13% del ADN fetal se encuentra circulante en suero materno(15,16); y a través de un mecanismo complejo y eficiente de secuenciación del ADN es posible
determinar la sobre-representación de los cromosomas 21, 18, 13, X y Y. Este estudio, nos permite conocer el riesgo de un trastorno cromosómico con tasas de FP de 0,1 % y TD de 99% para Trisomía 21, 98% para Trisomía 18 y 97% para Trisomía 13; empleando una muestra de sangre materna que puede ser obtenida desde la semana 10 de gestación. conocida como Test Prenatal No Invasivo (TPNI), la detección de ADN fetal en sangre materna permite disminuir de manera importante el número de procedimientos invasivos y en consecuencia, el número de pérdidas fetales potencialmente atribuibles a los mismos (17-20).
En nuestro análisis, reportamos como se ha comportado la prueba TPNI en Venezuela durante el lapso de tiempo comprendido entre enero 2013 y enero 2014; planteando un posible escenario comparativo con los métodos de despistaje tradicionales antes descritos.
mATeRIALes y méTodos
Se realizó un estudio retrospectivo, observacional, de corte transversal, descriptivo y comparativo, basado en distribuciones porcentuales y datos de asociación, realizado en Venezuela, donde se obtuvieron 513 muestras de ADN fetal en sangre materna, en pacientes con alto y bajo riesgo para cromosomopatías, entre enero de 2013 y enero de 2014, que consintieron realizarse el TPNI después de conocer los diferentes métodos de despistaje prenatal para cromosomopatías. La edad gestacional fue determinada a través del primer día de la fecha de última menstruación, en aquellas pacientes con ciclos regulares o por ecografía de primer trimestre temprano. El TPNI fue analizado por el laboratorio Ariosa Diagnostics Inc. california, Estados Unidos de Norteamérica a través su representante en Venezuela SouthGenetics®. A las pacientes cuyos resultados reportaron alto riesgo se les ofreció un estudio invasivo confirmatorio con obtención de cariotipo fetal por biopsia de vellosidades coriales (bVc) en el primer trimestre o amniocentesis en el segundo trimestre de la gestación. A las pacientes con reporte de bajo riesgo se les realizó seguimiento ecográfico y se consideraron negativas, posterior a la confirmación de fenotipo neonatal normal mediante evaluación clínica a cargo de Pediatras- Neonatólogos al momento del nacimiento. Se calculó la Sensibilidad, Especificidad, Valor Predictivo Positivo y Valor Predictivo Negativo de la prueba.
A fin de evaluar su utilidad clínica, se adicionó la estimación de los cocientes de Probabilidad Positivo
y Negativo; para finalmente comparar mediante una curva rOc (característica Operativa del receptor) el TPNI con otras pruebas estandarizadas de tamizaje antenatal, como la ultrasonografía con determinación de marcadores para cromosomopatías y las pruebas séricas disponibles en nuestro país.
ResuLTAdos
La edad materna osciló entre 18 y 46 años, con una media de 38 años. De ellas, 13 (68,42%) pacientes eran mayores de 35 años. De las 513 pruebas realizadas, 19 (3,7%) reportaron alto riesgo para aneuploidías. De las 19 pacientes, un caso se interrumpió voluntariamente ante una prueba con reporte positivo para Trisomía 18 (no confirmado por cariotipo), y otro resultó un óbito fetal, del cual se obtuvo cariotipo posnatal, confirmando una Trisomía 13. Los 17 casos restantes fueron confirmados; 15 de ellos prenatalmente, 4 con BVC y 11 con amniocentesis; y 2 casos con cariotipo posnatal. Se obtuvieron cinco Trisomías 21 (27,77%), dos Trisomías 18 (11,11%), un caso de trisomía 13 (5,55%). Tres casos de monosomía X (16,66%) y siete casos de trisomías de cromosomas sexuales (38,88%), dentro de los cuales se reportaron tres casos de XXX y cuatro XXY. Una de las pruebas con reporte de alto riesgo resultó ser cariotipo normal 46, XY (0,19%). La tasa de detección obtenida en nuestro estudio fue de 99,81%.
En nuestro estudio, la Sensibilidad de la prueba fue de 100%, con una Especificidad del 99,8%.
Asimismo, se obtuvo un Valor Predictivo Positivo
de 95% y Negativo de 100%. A fin de evaluar su utilidad clínica, se calcularon los cocientes de probabilidad (LH ratios), observándose un cociente de Probabilidad Positivo de 495 y un Cociente de Probabilidad Negativo de 0,00 (Tabla 2). Ante esta condición estadística, se concluye que un paciente con TPNI de alto riesgo, presenta una probabilidad 495 veces mayor de cursar con un feto portador de cromosomopatías; mientras que una prueba negativa o de bajo riesgo estima una probabilidad de cero (0) de que el feto en gestación sea aneuploide. Por último, comparamos mediante una Curva ROC (característica Operativa del receptor) el TPNI con otras pruebas de tamizaje antenatal, como la ultrasonografía con marcadores para aneuploidías y las pruebas séricas. En todos los casos, el TPNI resultó “siempre superior”.
dIsCusIón
Desde el primer informe en 1997 por Lo y colaboradores (21), donde destacaban la posibilidad de utilizar el ADN fetal libre de células circulantes en plasma de la madre para el diagnóstico fetal, se creó la expectativa de que algún día el complejo de marcadores múltiples y las pruebas de tamizaje operador dependiente, así como las pruebas invasivas para la determinación del cariotipo fetal, podrían ser reemplazados con sólo tomar una muestra de sangre materna (22).
El ADN libre circulante en la sangre materna es de origen tanto fetal como placentario y a partir de la semana 10 de gestación se encuentra en concentraciones suficientes para su análisis a través de diferentes técnicas validadas por varios laboratorios como prueba para la detección de aneuploidías fetales; todos los datos se basan en las tecnologías de secuenciación de reciente generación y el análisis bioinformático avanzado. Estas pruebas reportan en general una alta sensibilidad y especificidad para la trisomía 21, 18 y menor en la trisomía13, independientemente de la técnica molecular que se utiliza, y por lo general los resultados están disponibles dentro de los 7-10 días posteriores a la toma de la muestra materna (16). Nuestro estudio reporto similar TD, Sensibilidad, Especificidad,
TABLA 1
Edad materna 33 35 38 42 44 18 41 42 43 34 39 44 29 39 46 29 * 41 42 44
ADN Fetal Trisomía 21 Trisomía 21 Trisomía 21 Trisomía 21 Trisomía 21 Trisomía 18 Trisomía 18 Trisomía 18 Trisomía 13 Monosomía X Monosomía X Monosomía X XXX XXX XXX
XXY/XY (al nacer) XXY
XXY XXY
Edad Gestacional 17 semanas 12 semanas 12 semanas 5 días 14 semanas 2 días 11 semanas 2 días 12 semanas 2 días 13 semanas 2 días 11 semanas 12 semanas 2 días 14 semanas 11 semanas 10 semanas 1 día 11 semanas 18 semanas 2 días 11 semanas 3 días 17 semanas 6 días 14 semanas 5 días 13 semanas 3 días 11 semanas 4 días
Confirmación
Amniocentesis BVC Amniocentesis Amniocentesis BVC Amniocentesis No confirmado BVC Posnatal Amniocentesis BVC Amniocentesis Amniocentesis Amniocentesis Amniocentesis Posnatal Amniocentesis Amniocentesis Posnatal
*Falso Positivo
TABLA 2
Total Mues.
n
513 Alto Riesgo n
19
FP
%
0,19 Sensibi- lidad
%
100 VPP
%
95 Especi- ficidad
%
99,8 VPN
%
100 Cocien.
de Proba- bilidad posit.
495
Cocien.
de Proba- bilidad negat.
0,00 TD
%
99,81
además de VPP y VPN que las publicaciones internacionales que avalan la utilidad del TPNI (17- 20,22). En base a los datos obtenidos, el TPNI arroja datos de validación estadísticos comparables con una prueba diagnóstica, a pesar de estar concebido como un test de tamizaje. En la actualidad se conoce la secuencia de todos los cromosomas humanos e inclusive a través de la detección de ADN fetal en sangre materna se pueden conocer algunas microdeleciones y microduplicaciones, situación que amplía las fronteras del despistaje antenatal de aneuploidías (23).
Los análisis de ADN fetal en células libres es ahora ampliamente utilizado en el entorno clínico, especialmente en Norte América y China desde 2011, y posteriormente Europa. Las pruebas se han extendido, aunque su recomendación puede variar de un país a otro (24). La tendencia mundial es la unificación de criterios basados en evidencia siempre en beneficio del binomio madre feto. Latinoamérica, y por ende Venezuela, se ha integrado hacia las tendencias descritas previamente.
Situación en Venezuela.
Para el año 2013, la tasa de natalidad en Venezuela fue de 19,66 x 1.000 habitantes (25), esto se traduce en el nacimiento de 530.820 venezolanos durante ese año.
La mujer venezolana, al igual que en muchos otros países a nivel mundial ha postergado la maternidad.
Se estima que en Venezuela nacen 1,4 fetos con Síndrome de Down (SD) por cada 1.000 nacidos vivos, lo que se traduce en 743,14 recién nacidos con SD según las cifras de natalidad puntualmente reportadas (26). Tomando en cuenta que en nuestro país se utiliza el triple screening como método de tamizaje más frecuente y que éste reporta una TD de 60%; seguido en orden de frecuencia por la prueba combinada, con una TD de 90%, podemos asumir una TD promedio en Venezuela de 75%. Asumiendo en forma hipotética que alguna de estas estrategias de tamizaje se aplique a toda la población, solo detectaríamos 557,35 de los afectados. Por otro lado, se estima que en promedio se realiza amniocentesis al 4% de la población embarazada (27), lo que extrapolado a nuestro análisis implicaría realizar 21.232,8 procedimientos invasivos. Dichos resultados arrojarían un total de 20.675,45 fetos euploides, con una estimación de pérdida de 206 fetos sanos. Así, en nuestro escenario, si la política de despistaje de mayor dispersión fuese el TPNI, aplicado al 1% de
la población, se realizarían 530 pruebas y solo se perderían 5 fetos euploides.
Sin duda alguna que en estos momentos el TPNI en un método de despistaje de muy alto costo, por lo que el impacto económico frente a una economía en crisis, implicaría probablemente un panorama de entrada poco alentador. Sin embargo, la historia de todas y cada una de las diferentes pruebas aplicadas en medicina ha demostrado que con el pasar del tiempo y la replicación de la técnica por diferentes grupos de trabajo, los costos de operatividad, producción y masificación disminuyen en forma considerable;
es decir, que en términos netamente económicos se transforman en una muy básica relación entre oferta y demanda. Por otra parte, ante una futura y más razonable relación costo/beneficio, el TPNI está llamado a constituir un método de despistaje ideal en el embarazo, dada su validación estadística, lo temprano de su realización, lo rápido del resultado y más aun sabiendo que en la actualidad conocemos la secuencia de la totalidad de los cromosomas.
Es importante destacar que en nuestro país no existe legislación a favor del aborto, excepto en los casos en que sea realizado para salvar la vida de la gestante (Artículo 435 del código Penal Venezolano).
Tomando en cuenta esta situación, es importante conocer la opinión de la embarazada, en su justo derecho, si a pesar de la legislación desea conocer el cariotipo de su hijo (28). Un estudio chileno, país que tiene similar legislación que el nuestro en relación al aborto, reportó que un 38% de la población con una prueba de despistaje positiva decidirían someterse a una prueba confirmatoria (29); permitiendo así a los padres la oportunidad de conocer las consideraciones del estatus fetal desde el punto de vista cromosómico, sus implicaciones, sus asociaciones y evolución a futuro. Todo ello contribuye sin duda en orientar la debida preparación del grupo familiar en cuanto al cuidado y desarrollo del futuro recién nacido (30).
Se concluye que el TPNI es una prueba con alta capacidad para la detección de trastornos cromosómicos que debe ser integrada al asesoramiento genético independientemente de su costo, ya que la misma, gracias a su alta precisión, disminuye la tasa de pérdidas fetales como consecuencia de los procedimientos invasivos diagnósticos indicados para la obtención del cariotipo fetal, en sus diferentes técnicas. El tiempo de procesamiento de resultados en lapso prenatal, así como su correlación con el estudio de cariotipo posnatal resultó concordante en 99, 81 % de los casos estudiados en nuestra serie,
acreditando los datos de confiabilidad de la misma en una muestra estadísticamente significativa.
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dirección del Autor
dr. Juan Andrés Pérez Wulff email: [email protected] Caracas.Venezuela
