P
ROGRAMA DED
OCTORADO DEBIOLOGÍA MOLECULAR Y BIOMEDICINA
T ESIS D OCTORAL
Efectos sensibilizadores de la melatonina a la quimioterapia y a la radioterapia en el cáncer de
mama: acciones antiangiogénicas y adipogénicas
P H D T HESIS
Sensitizing effects of melatonin to chemotherapy and radiotherapy in breast cancer:
antiangiogenic and adipogenic actions
Alicia González González
Directores: Samuel Cos Corral y Alicia González Cabeza Escuela de Doctorado de la Universidad de Cantabria
Santander 2019
Universidad de Cantabria 39011 Santander
D. Samuel Cos Corral, Catedrático del Departamento de Fisiología y Farmacología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Cantabria y Dña. Alicia González Cabeza Profesora Contratada Doctora del Departamento de Fisiología y Farmacología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Cantabria
CERTIFICAN:
Que Dña. Alicia González González ha realizado el trabajo de investigación correspondiente a esta tesis doctoral titulada “Efectos sensibilizadores de la melatonina a la quimioterapia y la radioterapia en el cáncer de mama: acciones antiangiogénicas y adipogénicas” bajo nuestra dirección, en el Departamento de Fisiología y Farmacología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Cantabria.
Consideramos que el trabajo reviste las características de originalidad y calidad científica requeridas para ser defendido como Tesis Doctoral para optar al Grado de Doctor.
Santander 17 de junio de 2019
Director de la tesis: Directora de la tesis: Tutor de la tesis:
Fdo.: Samuel Cos Corral Fdo.: Alicia González Cabeza Fdo.: Samuel Cos Corral
A mi abuela María: siempre juntas, siempre amigas.
“La vida no es fácil, para ninguno de nosotros. Pero… ¡qué importa!
Hay que perseverar y, sobre todo, tener confianza en uno mismo.
Hay que sentirse dotado para realizar alguna cosa y que esa cosa hay que alcanzarla, cueste lo que cueste.”
Marie Curie
AGRADECIMIENTOS
Después de cuatro intensos años de dedicación plena al doctorado, esta importante etapa de mi vida llega a su fin. Me parecía una meta muy lejana y larga cuando comencé, pero volviendo la vista atrás, he de reconocer que se me ha pasado rápido, ya que en el mundo de la investigación, se pierde la noción del tiempo.
En primer lugar me gustaría expresar mi más sincero agradecimiento por el apoyo recibido por mis directores de tesis, por su entrega y tiempo dedicado a este trabajo y por hacerme progresar en mi formación científica. A Samuel Cos, por acogerme en su laboratorio y confiar en mis capacidades desde el primer momento.
Gracias por darme la oportunidad de realizar esta tesis y dejarme profundizar en el maravilloso mundo de la investigación; así como guiarme en mis primeros pasos científicos. Gracias también a Alicia González, por “aguantarme” cada día en su despacho y responder a mis dudas existenciales. No sólo te recordaré como mi codirectora, sino como una amiga con la que compartir más temas.
Además de mis directores, quiero agradecer a todo el Departamento de Fisiología por hacerme sentir tan a gusto durante este período. A Carolina, por todo el apoyo recibido durante estos años, por escucharme e intentar animarme siempre. A Javi, mi compañero de despacho, gracias por aportarme paz y tranquilidad en mis temporadas de nervios. Gracias a Mar y Mariajo, por dedicarme siempre una sonrisa en todo momento. ¡Cómo voy a echar de menos esas cenas! A Iñaki, porque aunque has llegado en mi último año de tesis, me has aportado mucho como persona. Eres un crack, y me alegro de que hayas llegado al departamento. Gracias también a José Antonio por su buena disposición para enseñarme en cultivos.
Asimismo y aunque ya no estén en el departamento, no me puedo olvidar de Lola y Emilio. Gracias a Lola, por apostar siempre por mí. No sabes lo que te he echado de menos estos últimos meses. Muchas gracias por dejarme formar parte de tu asignatura Fisiología Humana II. Has sido y serás una gran docente de la que he aprendido mucho. También quiero agradecer a Emilio, por darme la oportunidad de colaborar con él y confiar en mí, gracias.
A José Carlos Rodríguez Rey y Carlos Martínez Campa, por darme siempre tan buenos y constructivos consejos en las evaluaciones anuales y por guiarme en mi camino predoctoral.
Finalmente, no puedo olvidarme de Gema. Gracias por TODO; porque eres una fuente incansable de generosidad. Gracias, no solo por enseñarme todo lo que sé en el laboratorio, sino por escucharme y darme consejos acerca de mi vida en general.
Claramente sé que seguiremos en contacto, amiga.
También me gustaría dar las gracias a Noe, por explicarme los western. Eres una trabajadora ejemplar, compartiendo tus conocimientos conmigo. Gracias por apoyarme en este último tramo de mi tesis. Quiero agradecer también al laboratorio de Carmen Martínez Cue, por haberme acogido tan bien en estos últimos meses.
Al personal del Departamento de Anatomía y Biología Celular, en especial a Maite Berciano, por introducirme en el maravilloso mundo de las inmunohistoquímicas.
Gracias por intentar ayudarme y compartir conmigo vuestras valiosas enseñanzas.
Por supuesto, no puedo dejar de incluir en estos agradecimientos a mis compañeros durante esta etapa predoctoral: a Cris, mi compañera de fatigas, por todos los momentos compartidos, tanto dentro como fuera de la Facultad. Gracias por todos tus consejos. A Alba, mi compañera de western, gracias por transmitirme siempre esa
alegría. A Ale, porque siempre nos quedará Italia (o Mallorca). Quiero dar también las gracias a Omar, porque aunque tengamos ideologías muy distintas, en el fondo logramos entendernos muy bien.
A Fidel Madrazo, del servicio de microscopía del IDIVAL, y a Pepe, del área de Radiología y Física Médica, por prestarme en todo momento sus servicios.
Al Dipartamento de Medicina Molecolare e Traslazionale de la Università degli Studi di Brescia, en especial a Stefania Mitola, por acogerme y darme la oportunidad de realizar mi estancia del doctorado allí.
No puedo dejar de incluir en estos agradecimientos al Laboratorio de Oncología Molecular del CIMA, por darme la oportunidad de probar por primera vez qué era esto de la ciencia cuando aún era estudiante de Bioquímica en la Universidad de Navarra.
Gracias en especial a Mena, porque fuiste mi modelo de inspiración y por ser la primera persona que confió en mí y me animó a continuar este largo camino de la investigación.
Agradezco también al Área de Medicina Legal y Forense de la Universidad de Murcia por todas sus enseñanzas durante el Máster realizado allí.
Y como no, agradecer a mi grupo de “bioquímicos”, por estar siempre presentes tanto para dudas, como para memes, vacaciones y, en definitiva, buenos momentos.
¡Gracias chicos! Quiero agradecer también a Ixai, por compartir e intercambiar opiniones en la distancia en esta etapa predoctoral. A Andrea, mi ex compañera de piso, porque pese a encontrarnos lejos, siempre seguiremos poniéndonos al día. A mis murcianicas, por transmitirme siempre su positivismo y hacer que echara de menos en más de una ocasión el sol murciano estando aquí… A mis amigos de Santander, en especial a Cris, por aparecer en este último año y darme todo tu cariño. Y finalmente a mis amigas de Palencia, sobre todo a Alicia y Laura, por animarme en los momentos más difíciles y ayudarme a desconectar.
Por último, me gustaría expresar mi más profundo agradecimiento a mi familia.
A mis padres, a mi hermano y a María, por su amor incondicional y su apoyo tanto anímico como económico. Esta tesis no hubiera sido posible sin vosotros… Gracias por alegraros de mis éxitos y por apoyarme en los momentos difíciles. A mi madre, pilar fundamental de mi vida, porque eres la persona que más admiro. Eres una luchadora, y la razón por la que decidí dedicarme al mundo de la investigación y a realizar la tesis sobre el cáncer de mama.
En estos cuatro años han pasado hechos que marcarán para siempre mi vida.
Quién nos iba a decir que años después también José Manuel padecería esta maldita enfermedad… Gracias a Dios, no todo han sido malas noticias y pronto podremos conocer a la pequeña Chloé, ¡qué ganas de conocerte, sobrina! No me olvido tampoco del Aris, mi fiel compañero de piso que me ha aguantado, alegrado y animado cada día al llegar a casa.
Finalmente quiero agradecer a mi abuela María, a quien dedico esta tesis. No pasa ni un solo día sin que me acuerde de ti…
Por último, quiero agradecer a todas y cada una de las personas que, de una forma u otra, han contribuido a que esta tesis doctoral fuera posible.
¡Muchas gracias a todos!
ÍNDICE
RESUMEN………....
INTRODUCCIÓN………....
1. El cáncer de mama………....
1.1. Clasificaciones del cáncer de mama………...
1.2. Epidemiología y etiología………...
1.3. Papel de los estrógenos en el cáncer de mama………...
1.4. Tratamiento………
2. Mecanismos de síntesis de hormonas esteroideas………...
2.1. Las hormonas esteroideas………...
2.2. Variaciones fisiológicas en la producción de
esteroides ováricos……….………
2.3. Síntesis de estradiol y el resto de hormonas esteroideas……
2.4. Enzimas implicadas en la síntesis de estradiol………...
2.4.1. Aromatasa………
2.4.2. Sulfatasa y sulfotransferasa………..
2.4.3. 17β-hidroxiesteroide deshidrogenasa
(17βHSD)………
2.5. Síntesis local de estradiol en cáncer de mama………
3. Tejido adiposo y reacción desmoplásica……….
3.1. Qué es la reacción desmoplásica………
3.2. Interacción entre el tejido adiposo y el tejido epitelial tumoral………....
4. Angiogénesis………..
4.1. Angiogénesis fisiológica……….
4.2. Angiogénesis patológica……….
4.3. Sistema Angiopoyetina/Tie………
4.3.1. Expresión y estructura de Tie1 y Tie2……….
4.3.2. Expresión y estructura de las angio-
poyetinas……….
4.4. Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF)……….
4.4.1. Miembros de VEGF………
4.4.2. VEGFR………
4.4.3. Regulación de la expresión y síntesis de VEGF………..
4.5. Fases de la angiogénesis……….…….………
4.6. Rutas implicadas en la angiogénesis……….…….
4.6.1. La ruta de señalización de la supervivencia mediada por PI3K/AKT…………...
4.6.2. Ruta de señalización relacionada con la migración por la ruta Downstream of kinase- related (Dok-R)………...
4.6.3. Regulación de la permeabilidad vascular…….
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la inflamación en la vasculatura: ruta de NF-κβ………..
4.6.5. Ruta de las prtoteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs)………...
4.7. Progresión tumoral y metástasis en cáncer de mama……….
4.8. Terapias antiangiogénicas………...
5. La melatonina………...
5.1. Síntesis, secreción, circulación y metabolismo………..
5.2. Mecanismo de acción de la melatonina………..
5.3. Acciones de la melatonina………..
5.4. Melatonina y cáncer de mama………
5.5. La melatonina como antiestrógeno: propiedades SERM y SEEM………
5.6. Melatonina y Reacción Desmoplásica………
5.7. Melatonina y angiogénesis tumoral………
5.8. Melatonina y quimioterapia………
5.9. Melatonina y radioterapia………...
JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS……..………...
MATERIAL Y MÉTODOS...
1. Reactivos químicos empleados……….
2. Cultivos celulares………..
2.1. Líneas celulares………...
2.2. Condiciones de los cultivos……….
2.3. Subcultivos, contajes celulares y viabilidad de las células….
2.4. Eliminación de los estrógenos del medio de cultivo………...
3. Procedimiento de radiación de las células……….….
4. Cocultivos celulares………..
4.1. Cocultivos de células HUVEC y MCF-7 o MCF-10A...
4.2. Cocultivos de células BRF y MCF-……….
5. Medida de la viabilidad celular: método MTT……….………..
6. Estudios de expresión génica………..………..
6.1. Extracción de ARN total de las células…..……….
6.2. Determinación de la cantidad y pureza del ARN………
6.3. Síntesis de ADN complementario (ADNc)……….
6.4. Diseño de los cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR)………...
6.5. Detección de la expresión génica mediante PCR a tiempo real………...
6.6. Cuantificación y análisis de la expresión génica relativa
(valores de CT)………
6.7. Estudios de expresión génica en distintas líneas celulares….
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angiogénesis y enzimas implicadas en la síntesis de estrógenos en células HUVEC y MCF-7…...
6.7.2. Expresión de citoquinas antiadipogénicas y adipogénicas en células BRF cocultivadas con MCF-7………..
7. RT2 ProfilerTM PCR array de angiogenesis humana………
8. Medida de los niveles de proteína………
8.1. Ensayo de Inmunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA)…...
8.1.1. Cuantificación de la concentración proteica….
8.1.2. Cuantificación de los niveles de proteína de las angiopoyetinas y VEGF……….
8.2. Western Blot……….
8.2.1. Inmunodetección de los niveles de expresión proteica de AKT, pAKT, ERK y pERK mediante western blot en células endoteliales………..
9. Inmunofluorescencia……….
10. Determinación de distintas actividades de enzimas que intervienen en la síntesis de estrógenos……….
10.1. Medida de la actividad aromatasa………
10.2. Medida de la actividad sulfatasa (STS)………
10.3. Medida de la actividad 17β-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 1 (17β-HSD1)………
11. Determinación de la diferenciación de adipocitos: tinción Oil Red O……
12. Ensayo de migración celular: wound-healing assay………
13. Ensayo de tubulogénesis………..
14. Ensayo de permeabilidad vascular………..
15. Modelo de angiogénesis in vivo: membrana corioalantoidea del embrión de pollo (CAM assay)………..
16. Análisis estadístico de los datos………
RESULTADOS………..
Efectos de la melatonina sobre los niveles proteicos de Ang-1, Ang-2 y VEGF en el medio de cocultivos de células endoteliales y células tumorales mamarias……...
Efectos de la melatonina sobre la expresión de los genes Ang-1, Ang-2, Tie2 y VEG……….
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1. Estudio de la capacidad de la melatonina para modular los cambios que el docetaxel y la vinorelbina ejercen sobre el tejido endotelial y la formación de nuevos vasos sanguíneos………
1.1 Influencia de la melatonina en los efectos inducidos por el docetaxel y la vinorelbina en la proliferación de las células endoteliales…...
1.2 Efectos de la melatonina en los cambios inducidos por el docetaxel y la vinorelbina en la migración de las células endoteliales………...
1.3 Efectos de la melatonina sobre los cambios inducidos por el docetaxel y la vinorelbina en la capacidad de las células endoteliales para formar estructuras tubulares………..
1.4 Influencia de la melatonina en los efectos inducidos por el docetaxel y la vinorelbina en la actividad y la expresión de enzimas implicadas en la biosíntesis de estrógenos en las células endoteliales………
1.5 Efectos de la melatonina sobre los cambios inducidos por el docetaxel y la vinorelbina en la expresión de algunos de los principales factores pro-angiogénicos como VEGF y angiopoyetinas………..
1.6 Efectos de la melatonina sobre los cambios inducidos por el docetaxel y la vinorelbina en la expresión de distintos genes implicados en la angiogénesis………...
1.7 Influencia de la melatonina sobre los cambios inducidos por la quimioterapia en las rutas de señalización de AKT y ERK……..
1.8 Efecto de la melatonina sobre la expresión de MDR-1: posible mecanismo implicado en la potenciación de la quimioterapia mediada por la melatonina………
1.9 Influencia de la melatonina sobre los cambios inducidos por los quimioterápicos sobre la permeabilidad de las células endoteliales...
1.10 Influencia de la melatonina en los cambios inducidos por el docetaxel y la vinorelbina en la formación de nuevos vasos sanguíneos en un modelo in vivo: CAM assay……….
2. Estudio de la capacidad de la melatonina para modular los cambios que la radioterapia ejerce sobre el tejido endotelial y la formación de nuevos vasos sanguíneos………..………..
2.1 Influencia de la melatonina sobre los efectos inducidos por la radiación ionizante sobre la proliferación de las células endoteliales...
2.2 Efectos de la melatonina sobre los cambios inducidos por la radiación ionizante en la migración de las células endoteliales………
2.3 Efectos de la melatonina sobre los cambios inducidos por la radiación ionizante en la capacidad de las células endoteliales para formar estructuras tubulares………..
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enzimas implicadas en la síntesis de estrógenos a nivel de las células endoteliales………
2.5 Efectos de la melatonina sobe los cambios inducidos por la radiación en la expresión de algunos de los principales factores pro-angiogénicos como VEGF y angiopoyetinas………..
2.6 Efectos de la melatonina sobre los cambios inducidos por la radiación en la expresión de distintos genes implicados en la angiogénesis en células endoteliales……….
2.7 Influencia de la melatonina sobre los cambios inducidos por la radiación en las rutas de señalización de AKT y ERK…………
2.8 Efecto de la melatonina sobre los cambios inducidos por la radioterapia sobre la expresión de MDR-1………
2.9 Influencia de la melatonina sobre los cambios inducidos por la radioterapia sobre la permeabilidad de las células endoteliales………
2.10 Influencia de la melatonina sobre los efectos inducidos por la radiación en la formación de nuevos vasos sanguíneos en un modelo in vivo: CAM assay……….
3 Estudio de la capacidad de la melatonina para modular los cambios que la quimioterapia y la radioterapia pueden inducir en el tejido adiposo………
3.1 Efectos de la melatonina sobre los cambios inducidos por el docetaxel y la vinorelbina sobre la diferenciación de preadipocitos mamarios humanos……….
3.2 Efectos de la melatonina sobre los cambios inducidos por la radiación en la diferenciación de preadipocitos mamarios humanos………
3.3 Efectos de la melatonina sobre los cambios inducidos por la quimioterapia en la expresión de C/EBPα y PPARγ en preadipocitos mamarios humanos……….
3.4 Efectos de la melatonina sobre los cambios inducidos por la radiación ionizante en la expresión de C/EBPα y PPARγ en preadipocitos mamarios humanos………
3.5 Efectos de la melatonina sobre los cambios inducidos por la quimioterapia en la expresión de las citoquinas antiadipogénicas TNF-α, IL-6 e IL-11 en preadipocitos humanos………
3.6 Efectos de la melatonina sobre los cambios inducidos por la radiación en la expresión de las citoquinas antiadipogénicas TNF-α, IL-6 e IL-11 en readipocitos humanos………..
3.7 Efectos de la melatonina sobre los cambios inducidos por la quimioterapia en la actividad y expresión de la aromatasa y sus promotores en preadipocitos mamarios humanos……….
3.8 Efectos de la melatonina sobre los cambios inducidos por la radiación en la actividad y expresión de la aromatasa y sus promotores en preadipocitos mamarios humanos……….
3.9 Efectos de la melatonina sobre los cambios inducidos por la quimioterapia en la expresión de las ciclooxigenasas COX-1 y COX-2 en preadipocitos mamarios humanos………
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DISCUSIÓN………..
CONCLUSIONES……….
BIBLIOGRAFÍA………...
ANEXO………..
PUBLICACIONES REALIZADAS A LO LARGO DEL PERÍODO DE DOCTORADO………..
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ABREVIATURAS
3 17βHSD: 17β-hidroxiesteroide deshidrogenasa 3βHSD: 3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa 5-HTP: 5-hidroxitriptófano
AA-NAT: Arilalquilamina-N-acetiltransferasa ABC: Del inglés ATP-binding cassette
ABIN2: Proteína intracelular inhibidora de la unión A20 al NFkβ ADN: Ácido desoxirribonucleico
ADNc: Ácido desoxirribonucleico complementario AF: Dominios de funciones diferentes de activación ALAN: Luz artificial por la noche
AMPc: Adenosín monofosfato cíclico Ang-1: Angiopoyetina-1
Ang-2: Angiopoyetina-2 Ang-3: Angiopoyetina-3 Ang-4: Angiopoyetina-4
ANPEP: Alanil aminopeptidasa de membrana AP-1: Proteína activadora 1
AR: Receptor de andrógenos
ARNm: Ácido ribonucleico mensajero ARNr: Ácido ribonucleico ribosomal ATF: Factor de transcripción activador ATM: Gen de la ataxia telangiectasia mutado ATP: Adenosín trifosfato
BAD: Promotor de muerte asociado a Bcl2 Bax: Proteína X asociada a Bcl2
Bcl2: Gen de linfoma de células B2
BRCA-1: Proteína de susceptibilidad al cáncer de mama tipo 1 BRCA-2: Proteína de susceptibilidad al cáncer de mama tipo 2 BRF: Fibroblastos mamarios
BSA: Albúmina sérica bovina CaM: Calmodulina
CAM Assay: Ensayo de la membrane corioalantoidea del embrión de pollo CCL2: Ligando de la quimioquina 2 (motivo C-C).
CCD: Del inglés dominio coiled-coil
4 CD36: Receptor de trombospondina-1 CDK: Quinasa dependiente de ciclina
CDKN1A: Inhibidor de quinasa dependiente de ciclina C/EBPα: Proteína de unión al potenciador CCAAT α CDH1: Cadherina-1
CDH13: Cadherina-13
CHEK2: Gen de la quinasa de control 2 CoCl2: Dicloruro de cobalto
COX-1: Ciclooxigenasa-1 COX-2: Ciclooxigenasa-2
CREB: Proteína de unión al elemento de respuesta a AMPc CSF: Fluido cerebrospinal
CT: Ciclo umbral
CXCL6: Ligando de la quimioquina 6 (motivo C-X-C) CXCR4: Receptor 4 de la quimioquina (motivo C-X-C) CYP19AROM: Citocromo P450
DBD: Dominio de unión al ADN DHEA: Dehidroepiandrosterona DHT: Dihidrotestosterona
DMBA: 7,12-dimetil-1,2-benzantraceno DMSO: Dimetil sulfóxido
Dok-R: Señales activadas tras la actividad de la quinasa (del inglés downstream of kinase-related)
DSB: Rotura de la doble cadena de AND E2: Estradiol
ECM: Matriz extracelular EC: Célula endotelial
EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético EGF: Factor de crecimiento epidérmico EMT: Transición del epitelio mesenquimal eNOS: Isoforma endotelial de NOS
EphR: Receptor de efrinas
ER+: Receptor de estrógenos positivo
EREs: Elementos sensibles o de respuesta a los estrógenos ERK: Quinasas reguladas por señales extracelulares
5 EST: Estrógeno sulfatasa
ET-1: Endotelina-1
FAK: Quinasa de adhesión focal
FDA: Administración de drogas y alimentos de los Estados Unidos FGF: Factor de crecimiento de fibroblastos
FGFR3: Receptor 3 del factor de crecimiento de los fibroblastos FIGF: Factor de crecimiento endotelial vascular D
FKHR-1/FOXO1: Del inglés forkhead box
Flk1: Receptor del factor de crecimiento endotelial vascular Flt1: Receptor 1 del factor de crecimiento endotelial vascular FReD: Dominio similar al fibrinógeno
FSH: Hormona foliculoestimulante G1: Fase de crecimiento celular GAP1 G2: Fase de crecimiento celular GAP2
GnRH: Hormona liberadora de gonadotropina
GPCRs: Agonistas de receptores heterotriméricos acoplados a proteína G GRB14: Receptores de los factores de crecimiento unidos a proteína 14 GSH: Glutatión
GTP: Guanosín trifosfato
hCG: Gonadotropina coriónica humana
HER2: Receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano HIF: Factor inducible por hipoxia
HIOMT: Hidroxiindol-O-metiltransferasa HRE: Elemento de respuesta a hipoxia HSPG: Proteoglicano
hTERT: Telomerasa transcriptasa inversa humana
HUVEC: Células endoteliales de la vena de cordón umbilical humano ICAM-1: Molécula de adhesión intercelular
Ig: Inmunoglobulina
IGF-1: Factor de crecimiento insulínico tipo 1 IL-1β: Interleuquina-1β
IL-6: Interleuquina-6 IL-8: Interleuquina-8 IL-11: Interleuquina-11
6 JAG1: Del inglés jagged 1
JAM: Moléculas adhesivas transmembrana JNK: Quinasas c-Jun N-terminal
kb: Kilobases kDa: Kilodaltons
KDR: Receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular KLF2: Factor 2 de homología a Krüpell
LBD: Dominio carboxi-terminal de unión al ligando LECT1: Condromodulina-1
LH: Hormona luteinizante LL: Luz constante
LPA: Lipoproteína A M: Mitosis
MAPK: Proteína quinasa activada por mitógenos
MCF-7: Células tumorales epiteliales mamarias (Michigan Cancer Foundation) mDia: Del inglés mammalian diaphanous-related
MDR-1: Proteína de resistencia a múltiples fármacos 1 MEF2: Factor potenciador específico de miocito 2 MEK: MAPKK (quinasa de la MAPK)
MMP-1: Metaloproteínasa 1 MMP-9: Metaloproteínasa 9 MMP-14: Metaloproteínasa 14 MT: Metalotioneína
MTNR1A: Gen del receptor de la melatonina 1A MTNR1B: Gen del receptor de la melatonina 1B mTOR: Diana de rapamicina en mamíferos MUC: Mucina-1
NADPH: Adenina dinucleótido fosfato
NFkβ: Factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas
NK: Célula asesina NMU: Nitroso-metilurea NO: Óxido nítrico
NSCLC: Cáncer de pulmón de células no pequeñas P21waf1: Ciclina dependiente del inhibidor de quinasas 1
7 P450c17: 17α-hidroxilasa
PALB2: Del inglés partner and localizer of BRCA-2 PAK: Quinasa activadora de p21
PBS: Tampón fosfato salino
PDG: Fosfogluconato deshidrogenasa PGE2: Prostaglandina E2
PGI2: Prostaglandina I2 PHD: Prolil-4-hidroxilasa PI3K: Fosfoinositol 3-quinasa
PIGF: Factor de crecimiento placentario PK: Proteínquinasa del ADN
PKA: Proteínquinasa A PKB: Proteínquinasa B PKC: Proteínquinasa C
PPARγ: Receptor gamma activado por el proliferador de peroxisoma PR+: Receptor de progesterona positivo
pI.1: Promotor I.1 pI.2a: Promotor I.2a pI.3: Promotor I.3 pI.4: Promotor I.4 pI.6: Promotor I.6 pI.7: Promotor I.7 pI.f: Promotor I.f pII: Promotor II
PTEN: Gen homólogo de la fosfatasa y la tensina
pVHL: Proteína supresora de tumores de von Hippel-Lindau QR: Quinona reductasa
ROCK-1: Proteína asociada a Rho
RPE: Células epiteliales retinales pigmentarias
RT-PCR: Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real RTK: Receptor tirosín quinasa específico de las células endoteliales RZR/ROR: Receptores nucleares huérfanos del ácido retinoico S: Fase de síntesis del ADN
SAPK/JNKs: Proteín quinasas activadas por estrés/quinasas Jun-amino-terminales
8 scc: Del inglés side chain cleavage
SCD: Del inglés dominio de superclustering SCP: Proteína transportadora de esteroles SDF1: Factor derivado de las células estromales SDS: Duodecil sulfato sódico
SEEM: Modulador selectivo de las enzimas implicadas en la síntesis de estrógenos SEM: Error estándar de la media
SERM: Modulador selectivo de los receptores de estrógenos SFB: Suero fetal bovino
SHBG: Globulina fijadora de hormonas sexuales SHP2: Tirosina fosfatasa 2 con homología a Src
STAT3: Transductor de señal y activador de la transcripción 3 STK11: Serina/treonina quinasa 11
STS: Esteroide sulfatasa SULT: Sulfotransferasa TAG: Triglicéridos
TEM: Migración transendotelial
TGF-α: Factor de crecimiento transformante α TGF-β: Factor de crecimiento transformante β Tie1: Receptor 1 de angiopoyetina
Tie2: Receptor 2 de angiopoyetina
TIMP1: Inhibidor de la metaloproteínasa 1 TIMP3: Inhibidor de la metaloproteínasa 3 TM: Trombomodulina
TNF-α: Factor de necrosis tumoral TP53: Proteína tumoral p53
TRAIL: Ligando inductor de apoptosis relacionado con el TNF Trp: Triptófano
VCAM-1: Molécula de adhesión vascular VE-cadherina: Cadherina endotelial vascular VEGF: Factor de crecimiento endotelial vascular
VEGFR2: Receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular VE-PTP: Proteína tirosín fosfatasa endotelial vascular
WPB: Cuerpos de Weibel-Palade
9 ZO-1: Proteína 1 de unión estrecha
ZO-2: Proteína 2 de unión estrecha ZO-4: Proteína 4 de unión estrecha
SUMMARY
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Chemotherapeutic agents and radiotherapy are a treatment option in more than half of patients with cancer. Sometimes are administered with other drugs, like antiangiogenic compounds, that cause synergism and higher effectiveness of treatment.
Since melatonin can sensitize mammary tumor cells to both chemotherapy and radiotherapy through, among others, antiangiogenic and adipogenic actions, our aim was to study whether melatonin may modulate the sensitivity of human breast fibroblasts or endothelial cells, to chemotherapeutic agents (docetaxel or vinorelbine) and radiotherapy.
Therefore, in the first major objective of this thesis we studied whether melatonin could modulate the sensitivity of endothelial cells to chemotherapy and radiotherapy.
With regards to chemotherapeutics, melatonin (1 mM) enhanced the inhibition induced by docetaxel and vinorelbine on different steps of the angiogenic process: cell proliferation, migration and tubular network formation. In relation with local estrogen biosynthesis, melatonin impeded the negative effect of vinorelbine, by decreasing aromatase and sulfatase activity and expression and the aromatase promoter I.7 mRNA expression. Docetaxel and vinorelbine increased VEGF, Ang-1 and/or Ang-2 mRNA expression and melatonin inhibited these effects. In addition, melatonin prevented the stimulatory effect of docetaxel on other angiogenic factors like JAG1, ANPEP, IGF-1, CXCL6, AKT1, ERK1, ERK2, MMP-14 and NOS3 expression and counteracted the stimulatory effect of vinorelbine on FIGF, FGFR3, CXCL6, CCL2, ERK1, ERK2, AKT1, MMP-14 and NOS3 expression. Melatonin also neutralized the decrease induced by docetaxel on LECT1 expression and increased TIMP3 expression in combination with vinorelbine, an inhibitor of angiogenesis. Melatonin reduced the stimulatory effect induced by docetaxel and vinorelbine on MDR-1 expression. Melatonin potentiated the inhibitory effect on the activation of p-AKT and p-ERK exerted by docetaxel and vinorelbine. In addition, docetaxel and vinorelbine increased endothelial cell permeability and melatonin counteracted it by regulating the internalization of VE- cadherin. In CAM assay melatonin inhibited new vascularization in combination with docetaxel.
With respect to radiotherapy, melatonin also enhanced the inhibition induced by radiation at different levels of the angiogenic process. Radiation downregulated aromatase mRNA expression, aromatase endothelial-specific promoter I.7 mRNA expression, sulfatase and 17βHSD1 activity and expression and melatonin enhanced all these effects. Radiation and melatonin induced a significant decrease in VEGF, Ang-1 and Ang-2 mRNA expression. In Ang-2 and VEGF mRNA expression melatonin potentiated the inhibitory effect induced by radiation. In addition, in relation with other angiogenic factors, melatonin counteracted the stimulatory effect of radiation on FGFR3, TGF-α, JAG1, IGF-1, KDR, MMP-14, CXCL6, CCL2, ERK1, ERK2 and AKT1 expression, reduced ANPEP expression, increased TIMP1 expression, an angiogenesis inhibitor and enhanced the inhibitory effect of ionizing radiation on NOS3 expression.
Melatonin showed the same inhibitory effect in relation with the activation of p-AKT and p-ERK than in the case of the chemotherapy, as well as in the permeability. In CAM assay, melatonin enhanced the reduction of the vascular area induced by radiation.
In summary, chemotherapy and radiation have some side effects in angiogenesis that may reduce their effectiveness against tumor growth. Melatonin is able to neutralize these negative actions and potentiate antiangiogenic actions induced by chemotherapeutics agents and radiation, improving its antitumor action. Antiangiogenic
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effect of melatonin could be mediated through AKT and ERK pathways, since melatonin potentiated the inhibitory effect on the activation of p-AKT and p-ERK exerted by docetaxel, vinorelbine and radiation. Furthermore, melatonin can also inhibit angiogenesis by reducing cell permeability and influencing the internalization of VE- cadherin. By last, melatonin could also sensitize endothelial cells to chemotherapeutics by decreasing MDR-1 expression and therefore increasing chemotherapeutics concentration inside cells.
Since paracrine interactions between breast cancer cells and adjacent fibroblasts are also responsible for estrogen synthesis and lack of adipogenic differentiation in breast cancer tissue, in the second major objective of this thesis we studied the ability of melatonin to modulate the changes induced by chemotherapy and radiotherapy in human breast fibroblasts. Melatonin potentiated the stimulatory effect of docetaxel and vinorelbine on differentiation and its inhibitory effect on aromatase activity and expression, by increasing the stimulatory effect on C/EBPα and PPARγ and by increasing the downregulation of antiadipogenic cytokines and cyclooxygenases expression. In combination with radiation, melatonin counteracted the inhibitory effect of radiation on differentiation of preadipocytes, by increasing C/EBPα and PPARγ expression and by decreasing the TNF-α expression induced by radiation. Melatonin also potentiated the inhibitory effect exerted by radiation on aromatase activity and expression by increasing the downregulation of promoter II, COX-1 and COX-2 expression. Our findings suggest that chemotherapeutic drugs or radiation exert regulatory effects on preadipocytes (differentiation, aromatase activity and expression) and melatonin modulates these actions, what makes it a promising adjuvant for chemotherapy and radiotherapy sensibilization.
Taken together, our findings suggest that melatonin sensitizes endothelial cells and breast fibroblasts to chemotherapeutics and radiation, which may allow to decrease the dose of drugs or radiation used, reducing acute and chronic side effects and enhancing their antitumor actions.
RESUMEN
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Los agentes quimioterapéuticos y la radioterapia son una opción de tratamiento en más de la mitad de los pacientes con cáncer. Algunas veces se administran con otros fármacos, como los compuestos antiangiogénicos, que causan sinergia y una mayor eficacia del tratamiento. Dado que la melatonina puede sensibilizar a las células tumorales mamarias tanto a la quimioterapia como a la radioterapia mediante, entre otras, sus acciones antiangiogénicas y adipogénicas, nuestro objetivo fue estudiar si la melatonina puede modular también la sensibilidad de los fibroblastos mamarios humanos o las células endoteliales, a los agentes quimioterapéuticos (docetaxel o vinorelbina) y a la radioterapia.
Por ello, en el primer objetivo principal de esta tesis, estudiamos si la melatonina podría modular la sensibilidad de las células endoteliales a la quimioterapia y a la radioterapia. Con respecto a la quimioterapia, la melatonina (1 mM) mejoró la inhibición inducida por el docetaxel y la vinorelbina en las diferentes etapas del proceso angiogénico: proliferación celular, migración y formación de redes tubulares. En relación con la biosíntesis local de estrógenos, la melatonina neutralizó el efecto negativo de la vinorelbina, al disminuir la actividad y expresión de la aromatasa y la sulfatasa y la expresión del ARNm del promotor de la aromatasa I.7. Tanto el docetaxel como la vinorelbina aumentaron la expresión del ARNm de VEGF, Ang-1 y/o Ang-2 y la melatonina inhibió estos efectos. Además, la melatonina previno el efecto estimulante del docetaxel sobre otros factores angiogénicos como la expresión de JAG1, ANPEP, IGF-1, CXCL6, AKT1, ERK2, MMP-14 y NOS3 y contrarrestó el efecto estimulante de la vinorelbina sobre la expresión de FIGF, FGFR3, CXCL6, CCL2, ERK1, ERK2, AKT1, MMP-14 y NOS3. La melatonina también neutralizó la disminución inducida por el docetaxel en la expresión de LECT1 y aumentó la expresión de TIMP3 en combinación con vinorelbina, un inhibidor de la angiogénesis. La melatonina redujo el efecto estimulante inducido por el docetaxel y la vinorelbina en la expresión de MDR-1.
La melatonina potenció el efecto inhibitorio sobre la activación de p-AKT y p-ERK ejercida por el docetaxel y la vinorelbina. Además, el docetaxel y la vinorelbina aumentaron la permeabilidad de las células endoteliales y la melatonina lo contrarrestó regulando la internalización de la VE-cadherina. En el ensayo de la membrana corioalantoidea del embrión de pollo, la melatonina inhibió la nueva vascularización en combinación con docetaxel.
Con respecto a la radioterapia, la melatonina también potenció la inhibición inducida por la radiación en diferentes niveles del proceso angiogénico. La radiación redujo la expresión del ARNm de la aromatasa, la expresión del ARNm del promotor específico endotelial de la aromatasa I.7, la actividad y la expresión de la sulfatasa y la 17βHSD1 y la melatonina potenció todos estos efectos. La radiación y la melatonina indujeron una disminución significativa en la expresión del ARNm de VEGF, Ang-1 y Ang-2. En la expresión del ARNm de Ang-2 y VEGF, la melatonina potenció el efecto inhibitorio inducido por la radiación. Además, en relación con otros factores angiogénicos, la melatonina contrarrestó el efecto estimulante de la radiación sobre la expresión de FGFR3, TGF-α, JAG1, IGF-1, KDR, MMP-14, CXCL6, CCL2, ERK1, ERK2 y AKT1, redujo la expresión de ANPEP, aumentó la expresión de TIMP1, un inhibidor de la angiogénesis y aumentó el efecto inhibitorio de la radiación ionizante en la expresión de NOS3. La melatonina mostró el mismo efecto inhibitorio en relación con la activación de p-AKT y p-ERK que en el caso de la quimioterapia, así como en la permeabilidad. En el ensayo de la membrana corioalantoidea del embrión de pollo, la melatonina mejoró la reducción del área vascular inducida por la radiación.
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En resumen, la quimioterapia y la radiación tienen algunos efectos secundarios en la angiogénesis que pueden reducir su eficacia contra el crecimiento del tumor. La melatonina es capaz de neutralizar estas acciones negativas y potenciar las acciones antiangiogénicas inducidas por los agentes quimioterapéuticos y la radiación, mejorando su acción antitumoral. El efecto antiangiogénico de la melatonina podría estar mediado a través de las vías de AKT y ERK, ya que la melatonina potencia el efecto inhibitorio sobre la activación de p-AKT y p-ERK ejercida por el docetaxel, la vinorelbina y la radiación. Además, la melatonina también puede inhibir la angiogénesis al reducir la permeabilidad celular e influir en la internalización de la VE-cadherina. Por último, la melatonina también podría sensibilizar las células endoteliales a quimioterapéuticos al disminuir la expresión de MDR-1 y, por lo tanto, aumentar la concentración de quimioterapéuticos dentro de las células.
Dado que las interacciones paracrinas entre las células del cáncer de mama y los fibroblastos adyacentes también son responsables de la síntesis de estrógenos y la falta de diferenciación adipogénica en el tejido del cáncer de mama, en el segundo objetivo principal de esta tesis, estudiamos la capacidad de la melatonina para modular los cambios inducidos por la quimioterapia y la radioterapia sobre fibroblastos mamarios humanos. La melatonina potenció el efecto estimulante del docetaxel y la vinorelbina sobre la diferenciación y su efecto inhibitorio sobre la actividad y expresión de la aromatasa, al aumentar el efecto estimulante sobre C/EBPα y PPARγ y al aumentar la inhibición de la expresión de las citoquinas antiadipogénicas y de las ciclooxigenasas.
En combinación con la radiación, la melatonina contrarrestó el efecto inhibitorio de la radiación sobre la diferenciación de los preadipocitos, aumentando la expresión de C/EBPα y PPARγ y disminuyendo la expresión de TNF-α inducida por la radiación. La melatonina también potenció el efecto inhibitorio ejercido por la radiación sobre la actividad y expresión de la aromatasa al aumentar la inhibición de la expresión del promotor II de la aromatasa, de COX-1 y COX-2. Nuestros hallazgos sugieren que los agentes quimioterápicos o la radiación ejercen efectos reguladores sobre los preadipocitos (diferenciación, actividad y expresión de la aromatasa) y la melatonina modula estas acciones, lo que lo convierte en un adyuvante prometedor para la sensibilización a la quimioterapia y a la radioterapia.
En resumen, nuestros resultados sugieren que la melatonina sensibiliza a las células endoteliales y los fibroblastos mamarios a la quimioterapia y a la radioterapia, lo que puede permitir disminuir la dosis de los quimioterápicos o la radiación utilizada, reduciendo así sus efectos secundarios agudos y crónicos y mejorar sus acciones antitumorales.
INTRODUCCIÓN
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El objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido estudiar el papel sensibilizador de la melatonina a la quimioterapia y a la radioterapia en el tejido peritumoral mamario, centrándonos, fundamentalmente en las acciones a nivel del tejido endotelial y adiposo.
En primer lugar, en esta introducción, analizaremos las características principales del cáncer de mama, particularmente de aquellos que son hormono-dependientes. A continuación, describiremos las acciones de las hormonas esteroideas, centrándonos en las enzimas implicadas en la síntesis de estrógenos. Posteriormente, describiremos la reacción desmoplásica, donde analizaremos la comunicación paracrina existente entre los distintos tipos celulares que componen el tumor. Después, expondremos el proceso de angiogénesis, tanto fisiológica como tumoral. A continuación, dedicaremos un apartado a la melatonina, resaltando sus características generales más importantes. Por último, describiremos la melatonina como adyuvante a la quimioterapia y a la radioterapia.
1. El cáncer de mama
El cáncer de mama se origina cuando las células epiteliales mamarias comienzan a dividirse de forma descontrolada. Estas células normalmente forman un tumor, que es maligno cuando las células pueden crecer invadiendo los tejidos circulantes o se propagan a otras partes del cuerpo a través del sistema linfático o la sangre, produciéndose así el fenómeno llamado metástasis (American Cancer Society 2019).
1.1. Clasificaciones del cáncer de mama
Existen diversas clasificaciones del cáncer mamario en función de distintas características:
- En función de las células cancerosas: pueden ser sarcomas, si empiezan en las células del músculo, grasa o tejido conectivo, o carcinomas, si por el contrario, el origen está en las células epiteliales que revisten los órganos y tejidos. Además, dentro de los carcinomas, suelen ser muy frecuentes los adenocarcinomas si el origen comienza en el tejido glandular (American Cancer Society 2019).
- En función de las proteínas de la superficie de las células cancerosas (inmunohistoquímica):
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o Receptores hormonales positivos: receptor de estrógeno positivo (ER+) y/o receptor de progesterona positivo (PR+). Los estrógenos estimulan el crecimiento de los tumores de cáncer de mama, y las mujeres que desarrollan esta enfermedad tienden a tener niveles elevados de estas hormonas (Harfouche y cols., 2011).
o Receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 positivo (HER2+):
aquellos que tienen alta concentración de proteínas HER2/neu.
o Triple negativo: ER-, PR-, HER2-.
- De origen genético: mutaciones en la proteína de susceptibilidad al cáncer de mama tipo 1 (BRCA1) y/o a la proteína de susceptibilidad al cáncer de mama tipo 2 (BRCA2). Es muy interesante destacar que el producto del gen de susceptibilidad al cáncer de mama 1 (BRCA) se une al receptor de andrógenos (AR) potenciando sus efectos mediados por andrógenos. Esto podría indicar que mutaciones en este oncogén podrían interferir o anular los efectos de los andrógenos y por lo tanto un mayor riesgo de padecer cáncer de mama y ovario (Park y cols., 2000).
- Clasificación anatomopatológica: basada en la parte de la mama donde se origina.
La mayoría de los cánceres de mama son ductales, ya que comienzan en los conductos que llevan la leche hacia el pezón. En cambio, algunos cánceres se originan en las glándulas que producen leche, siendo cánceres lobulillares. Aparte de estos existen otros tipos menos comunes como pueden ser la enfermedad de Paget del pezón, el tumor filoides, el angiosarcoma, el carcinoma inflamatorio de mama, etc (American Cancer Society 2019).
1.2. Epidemiología y etiología
El cáncer de mama es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad más importante en todo el mundo (Organización Mundial de la Salud, OMS, 2019). Es la segunda causa principal de muerte por cáncer, después del cáncer de pulmón, en las mujeres. La probabilidad de que una mujer muera por esta enfermedad es aproximadamente del 2,7%. No obstante, las tasas de mortalidad han descendido en los últimos años debido a la detección precoz, un mejor acceso a la información y mejores tratamientos. El cáncer de mama fue el tumor maligno más frecuente diagnosticado en
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mujeres estadounidenses (sin contar el de piel) en 2017 (https://www.cancer.gov /types/breast/patient/breast-prevention-pdq). En el año 2018, según la Sociedad Americana contra el Cáncer, alrededor de 40.610 mujeres murieron de cáncer de mama en el mundo (American Cancer Society 2019).
El cáncer de mama es una enfermedad con distintos factores de riesgo, cabe destacar los siguientes:
- Sexo: ser mujer es el principal riesgo de padecer cáncer de mama. Los hombres también pueden padecer cáncer de mama, pero esta enfermedad es aproximadamente 100 veces más común en las mujeres que en los hombres (https://www.cancer.gov/types/breast/patient/breast-prevention-pdq).
- Edad: el envejecimiento incrementa el riesgo de sufrir cáncer de mama, ya que se van acumulando factores de riesgo y los mecanismos de reparación celular tienden a perder eficacia. La mayoría de los cánceres de mama ocurren en mujeres que superan los 55 años (Organización Mundial de la Salud, OMS, 2019).
- Exposición a estrógenos:
o Estado reproductor: las mujeres que tienen una menarquía temprana o una menopausia después de los 55 años presentan un riesgo ligeramente mayor de padecer cáncer de mama. Este aumento en el riesgo podría deberse a una exposición más prolongada a estrógenos y progesterona durante su vida. Otros factores de riesgo son las mujeres nulíparas o aquellas que tuvieron su primer hijo en edades avanzadas. Algunos estudios sugieren que la lactancia podría disminuir ligeramente el riesgo de cáncer de mama debido a que reduce el número total de ciclos menstruales en la vida de una mujer (https://www.cancer.gov/types/breast/patient/breast-prevention-pdq).
o Terapia hormonal sustitutiva: el uso de terapia hormonal sustitutiva después de la menopausia para prevenir la osteoporosis, aumenta la probabilidad de desarrollar tumores mamarios, especialmente durante la administración combinada de estrógenos y progesterona, que promueven el crecimiento y proliferación de las células tumorales mamarias (https://www.cancer.gov/types/breast/patient/breast-prevention-pdq).
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o Anticonceptivos orales: Son numerosos los estudios epidemiológicos que establecen una asociación entre el consumo de anticonceptivos orales formados por estrógenos y progestágenos sintéticos, y el aumento del riesgo de cáncer de mama (Davison y Davis, 2003). Estos tratamientos inhiben la secreción hipotalámica de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), la secreción hipofisaria de la hormona foliculoestimulante (FSH) y la hormona luteinizante (LH), no existiendo así la maduración del folículo y por lo tanto la ovulación.
- Factores genéticos: Mutaciones en oncogenes o en genes supresores de tumores pueden causar que las células normales de la mama se vuelvan cancerosas, por división descontrolada de las células. Existe un mayor riesgo de sufrir cáncer de mama si existe historia familiar, sobre todo si es familiar directo de primer grado (https://www.cancer.gov/types/breast/patient/breast-prevention-pdq). Se cree que alrededor del 5% de los casos de cáncer de mama son hereditarios, lo que significa que la mayoría de los cánceres de mama se originan de mutaciones genéticas adquiridas y no heredadas (Sánchez-Barceló y cols., 2002). La causa más común de cáncer de mama hereditario es una mutación heredada en los genes supresores de tumores BRCA-1 o BRCA-2, heredándose dichas mutaciones en una forma autosómica dominante y con alta penetrancia en causar cáncer, sobre todo en jóvenes. Otros genes en los que las mutaciones pueden aumentar el riesgo a sufrir cáncer de mama, aunque en menor medida, son los siguientes genes: gen de la ataxia telangiectasia mutado (ATM), proteína tumoral p53 (TP53), gen de la quinasa de control 2 (CHEK2), gen homólogo de la fosfatasa y la tensina (PTEN), cadherina-1 (CDH1), serina/treonina quinasa 11 (STK11), Partner And Localizer Of BRCA2 (PALB2).
- Antecedentes personales: una mujer con cáncer en una mama tiene un mayor riesgo de padecer un nuevo cáncer en la otra mama o en otra parte del mismo seno. Además, si una mujer posee afecciones benignas en la mama, existe un mayor riesgo de padecer cáncer de mama en el futuro (Sánchez-Barceló y cols., 2002).
- Tejido mamario denso: Las mamas que están formadas por una mayor proporción de tejido fibroso y glandular y menos tejido adiposo, tienen un mayor riesgo de
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padecer cáncer de mama (https://www.cancer.gov/types/breast/patient/breast- prevention-pdq).
- Factores ambientales: Dentro de los factores susceptibles de actuar como carcinógenos se incluyen agentes físicos, como radiaciones ionizantes (https://www.cancer.gov/types/breast/patient/breast-prevention-pdq) los cuales dependen de la dosis y la edad a la que se produce la exposición, afectando más si ocurre en la pubertad. Otros factores ambientales son los químicos, como los asbestos, los componentes del tabaco, las aflatoxinas o el arsénico. Finalmente los factores biológicos como las infecciones causadas por determinados virus, bacterias o parásitos también son factores de riesgo (Organización Mundial de la Salud, OMS, 2019).
Algunos estudios han destacado también las conductas laborales, ya que aquellas mujeres que trabajan durante la noche, podrían tener un mayor riesgo de padecer cáncer de mama por alteración de los ritmos circadianos. En muchos casos, el efecto de estos factores es demasiado bajo para que se puedan considerar carcinógenos por sí mismos. Sin embargo, sus efectos son aditivos y a largo plazo pueden causar alteraciones hormonales que derivarán en esta patología (Davis y cols., 2001; Zubidat y Haim, 2017).
- Estilo de vida: dietas ricas en grasas de origen animal están asociadas a un mayor riesgo de padecer cáncer de mama (Wu, 2000), como también lo están el consumo de alcohol (https://www.cancer.gov/types/breast/patient/breast-prevention-pdq) y el tabaquismo. Por otro lado, la actividad física está relacionada con la reducción en el riesgo de cáncer de mama, especialmente en las mujeres que han pasado por la menopausia, debido a sus efectos sobre el peso corporal, la inflamación, las hormonas y el balance energético (Organización Mundial de la Salud, OMS, 2019). Además, es posible que el ejercicio aumente la síntesis de melatonina, protegiendo así el riesgo de cáncer de mama (Sánchez-Barceló y cols., 2002).
- Talla y peso: la talla de los individuos está directamente relacionada con el riesgo de padecer cáncer de mama, aumentando este riesgo en un 10% por cada 10 cm de altura. La obesidad está asociada igualmente con el incremento del riesgo a sufrir cáncer de mama, especialmente en mujeres postmenopáusicas (Sánchez-Barceló y cols., 2002). Antes de la menopausia, los ovarios producen la mayor cantidad de
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estrógenos y el tejido adiposo produce solamente una pequeña cantidad. Por el contrario, después de la menopausia, la mayor parte de los estrógenos proviene del tejido adiposo. Un exceso de tejido adiposo después de la menopausia puede elevar los niveles de estrógenos y aumenta la probabilidad de padecer cáncer de mama. Además, las mujeres que tienen sobrepeso tienden a presentar niveles de insulina en la sangre más elevados, que a su vez están relacionados con el cáncer de mama (Sánchez-Barceló y cols., 2002). La insulina aumenta la proliferación de las células tumorales epiteliales mamarias (MCF-7) directa o indirectamente por aumentar los niveles del factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1), que a su vez regula la proliferación celular (Sánchez-Barceló y cols., 2002). Además, la insulina disminuye la síntesis de la globulina fijadora de hormonas sexuales (SHBG) que se une al estradiol, aumentando así la cantidad de estradiol libre (Sánchez-Barceló y cols., 2002). Muchas mujeres obesas poseen hipoadiponectinemia e hiperleptinemia, debido a una resistencia a la insulina, que estimula al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y al factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas (NFkβ) favoreciendo así la proliferación e invasión y por lo tanto el riesgo de cáncer de mama (Sánchez-Barceló y cols., 2002; Szewczyk-Golec y cols., 2015).
Por otro lado, la supresión de melatonina debido a la exposición a luz artificial por la noche (ALAN) junto a patrones de metilación del ácido desoxirribonucleico (ADN) se han identificado como biomarcadores de detección temprana de desórdenes metabólicos y desarrollo de cáncer de mama (Zubidat y Haim, 2017). Ambos síndromes están estrechamente asociados a la disrupción circadiana y al aumento de apetito por un déficit de melatonina (Chojnacki y cols., 2016).
- Raza: En general, las mujeres de raza blanca tienen ligeramente mayores probabilidades de padecer cáncer de mama que las mujeres africanas o asiáticas (Bernstein, 2002). Sin embargo, son estas últimas las que tienen más probabilidades de fallecer de cáncer de mama a cualquier edad, ya que suelen presentar tumores más agresivos (Morris y Mitchell, 2008).
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1.3. Papel de los estrógenos en el cáncer de mama
Existen múltiples evidencias epidemiológicas que relacionan una exposición prolongada a los estrógenos con un mayor riesgo de padecer cáncer de mama (Clemons y Goss, 2001). Esto es debido a que los estrógenos estimulan la proliferación de las células epiteliales en el sistema reproductor femenino y en la glándula mamaria (Dickson y Stancel, 2000). Alrededor de dos de cada tres cánceres de mama son cánceres con ER y PR, que al adherirse a estas hormonas, las células crecen y se propagan. Dentro de los receptores de estrógenos existen los receptores alfa y beta (dominante), que funcionan como factores de transcripción regulando la expresión de otros genes y son los encargados de modular y llevar a cabo los efectos de los estrógenos (Katzenellenbogen y Katzenellenbogen, 2000).
El mecanismo más estudiado a través del cual los estrógenos promueven la tumorogénesis es la proliferación de las células ER+ dentro de los tumores. Sin embargo, los estrógenos también son importantes reguladores de la angiogénesis, un marcador de peor pronóstico en pacientes con cáncer de mama (Van‘t Veer y cols., 2002). Los estrógenos pueden actuar directamente en las células endoteliales (ECs) del microambiente tumoral, que expresan ERs, para promover la supervivencia, proliferación y crecimiento de los vasos sanguíneos (Losordo y Isner, 2001). Sin embargo, la activación de la señalización ER en las células tumorales puede también afectar a la expresión de factores pro-angiogénicos como VEGF y las angiopoyetinas, modificando así el microambiente tumoral y estimulando la formación de nuevos vasos (Buteau-Lozano y cols., 2002).
Los estrógenos se pueden unir a distintos ERs de la familia de receptores nucleares de factores de transcripción, ERα (NR3A1) y ERβ (NR3A2), para mediar sus efectos biológicos (Heldring y cols., 2007). Ambos receptores tienen similar afinidad por los estrógenos, unen los mismos elementos de respuesta al ADN y comparten un alto grado de homología de secuencia (Heldring y cols., 2007). El mayor subtipo ER en el epitelio mamario es el ERα, el cual regula el desarrollo de la glándula mamaria después de la pubertad, así como la progresión del cáncer de mama (Mueller y cols., 2002).
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Los ERs tienen un dominio de unión al ADN (DBD) requerido para el reconocimiento y unión al ADN, un dominio carboxi-terminal de unión al ligando (LBD) y un dominio amino-terminal que varía en secuencia y longitud (Heldring y cols., 2007). Dos dominios de funciones diferentes de activación (AF) facilitan la activación transcripcional por reclutamiento de varios complejos de proteínas correguladoras al receptor de unión al ADN: AF-1, localizado en la parte amino- terminal del receptor, está constitutivamente activo y AF-2, situado en el dominio LBD carboxi-terminal, es ligando-dependiente (Nilsson y cols., 2001).
La ruta de señalización de los estrógenos comienza con la unión del estrógeno al ER, lo que, a continuación, induce la transcripción de los elementos sensibles a los estrógenos (EREs) en secuencias de ADN cis-reguladoras para promover la expresión de genes que regulan el ciclo celular, como el factor de transcripción E2F1 (Wang y cols., 1999). La activación transcripcional de E2F1 y la activación de sus genes diana por ERα inducen la proliferación de las células de cáncer de mama y ha sido asociada con un grado mayor de agresividad del cáncer de mama y peor supervivencia (Wang y cols., 1999). Los ERs también interactúan indirectamente con el ADN a través de otros factores de transcripción como la proteína activadora 1 (AP-1) (Dahlman y cols., 2012).
AP-1 regula la proliferación de las células de cáncer de mama y la comunicación entre ERα y AP-1 ha sido asociada con invasión y resistencia al tamoxifeno en tumores de mama ERα+ (Zhou y cols., 2007).
En resumen, los estrógenos se unen a los ER, estimulando la proliferación celular y así incrementando la posibilidad de errores en la replicación del ADN, causando más mutaciones puntuales (Preston-Martin y cols., 1990). Además, los efectos genotóxicos directos del estradiol por sí mismo y sus metabolitos podrían también explicar la carcinogénesis inducida por estrógenos (Russo y Russo, 2006).
1.4. Tratamiento
Hay varias maneras de tratar el cáncer de mama, dependiendo de su tipo y etapa.
Algunos tratamientos son locales, lo que significa que tratan el tumor sin afectar al resto del cuerpo. Algunos tipos de terapia local utilizados para el cáncer de mama son la cirugía y la radioterapia. Otros en cambio, son tratamientos sistémicos ya que alcanzan las células cancerígenas en casi cualquier parte del cuerpo. Pueden ser administrados
