I.I NTRODUCCIÓN
I.2. Complejo Mycobacterium tuberculosis
I.2.2. Métodos de identificación
Para la identificación de las especies que conforman el CMT se han utilizado clásicamente las características fenotípicas propias de las mico- bacterias, si bien es cierto que su baja capacidad de discriminación pue- de llevar a cometer errores en la identificación; por tanto, actualmente se recomienda la combinación de métodos fenotípicos y genotípicos en dicho proceso de identificación.
I.2.2.1. Métodos fenotípicos
Constituyen el primer paso en la identificación de una micobacte- ria. Comprenden diferentes características que resultan de utilidad en el proceso de identificación.
a) Velocidad de crecimiento: Las micobacterias en general, tanto las tuberculosas como las no tuberculosas, se clasifican en especies de crecimiento rápido y de crecimiento lento. El CMT contiene especies clasificadas como de crecimiento lento, consideradas como aquellas que crecen en cultivo a partir de los 7 días de incubación (53). El crecimiento suele apreciarse en medio sólido tras 10-15 días, aunque en ocasiones puede llegar a demorarse hasta 6 semanas; sin embargo, la detección en medios de cultivo líquido es más precoz.
b) Morfología de las colonias: Macroscópicamente, las colonias de M. tuberculosis son rugosas, secas, de color cuero o ante, de crecimiento eugónico (abundante) y en aspecto de “miga de pan”. En cambio, M. bo- vis presenta un crecimiento disgónico, es decir, muy lento y el aspecto de las colonias es más liso. El resto de especies del CMT presentan mayor heterogeneidad fenotípica (53).
Microscópicamente, hay que recurrir a las tinciones para observar la morfología. A través de las tinciones de ácido-alcohol resistencia pode- mos identificar y diferenciar bacilos tuberculosos de otros microorganis- mos presentes en la muestra. Las técnicas más utilizadas son la tinción de auramina rodamina y la tinción de Ziehl-Neelsen. Ambas se basan en la dificultad que presentan las micobacterias para teñirse con los colo- rantes básicos habituales, debido al alto contenido de lípidos de su pared celular (ácidos micólicos). Para lograr la penetración de los colorantes al interior de la micobacteria se recurre al calor o al uso de determinados
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detergentes. Una vez dentro, el colorante (carbolfucsina en Ziehl-Neel- sen y fluorocromos en auramina-rodamina) se fija a los ácidos micólicos formando complejos estables que no pueden ser extraídos tras la exposi- ción a un ácido y un alcohol.
En el examen microscópico, M. tuberculosis aparece como bacilos áci- do-alcohol resistentes (BAAR) de 1 a 10 µm de largo y 0,2 a 0,6 µm de ancho, de aspecto recto o ligeramente curvados. Los bacilos se pueden encontrar aislados o en pequeños grupos. Las especies del CMT exhiben a menudo una distribución en cordones conocidos como “cuerdas ser- penteantes” o “coronas de espinas”. La tinción es en ocasiones irregular, debido a la presencia de granulaciones a lo largo de la bacteria; esta ca- racterística es más destacable con la tinción de Ziehl-Neelsen. Debe tam- bién tenerse en cuenta que existen otros microorganismos que pueden presentar cierto grado de AAR como son Nocardia o Rhodococcus (54).
La tinción con fluorocromos (auramina-rodamina) requiere un me- nor tiempo de observación (55) y aún hoy, aunque es un aspecto con- trovertido, se considera en muestras respiratorias de mayor sensibilidad que la tinción de Ziehl-Neelsen (56,57).
El examen directo de la muestra, si bien proporciona una gran especi- ficidad para determinar el género Mycobacterium, no es suficiente para realizar la diferenciación de una especie concreta a partir de una muestra clínica.
c) Métodos bioquímicos: Algunas de las características bioquímicas útiles para identificación son la reducción de nitratos y la ausencia de catalasa a 68°C.
Las micobacterias difieren cualitativamente en su capacidad de re- ducir los nitratos a nitritos por la presencia de una enzima nitrato-re- ductasa. Las cepas de M. tuberculosis producen esta reducción de forma significativa, lo que las diferencia del resto de especies del CMT, que dan esta prueba negativa.
Todas las especies integrantes del CMT poseen la enzima catalasa, a excepción de algunos aislados de M. tuberculosis y de M. bovis resisten- tes a isoniacida. Es una enzima intracelular capaz de descomponer el pe- róxido de hidrógeno en agua y oxígeno libre. La ausencia de catalasa ter- moestable, es decir, aquella capaz de seguir actuando tras ser sometida a altas temperaturas, es de utilidad para la identificación de las especies del CMT. Todas las cepas presentan ausencia de catalasa a 68°C.
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I.2.2.2. Métodos moleculares
Actualmente se tiende a la utilización de técnicas moleculares por su mayor precisión y rapidez.
Técnicas rápidas comerciales:
a) AccuProbe (GenProbe Inc., San Diego, California, USA): es una técnica basada en la liberación de ARNr del citoplasma celular por soni- cación y su posterior unión a ADN fijado sobre un soporte sólido, formando un híbrido ADN-ARNr que es detectado mediante quimioluminiscencia.
Esta sonda puede aplicarse a partir del crecimiento de micobacterias proce- dentes tanto de medio de cultivo sólido como líquido. Es una técnica rápida y sencilla pero sólo es capaz de detectar al CMT en global y a un número limitado de especies de micobacterias no tuberculosas.
b) INNO-LiPA v2 (Innogenetics NV; Gante, Bélgica): se basa en la hibridación inversa de la región 16S-23S ARNr, después de la amplifica- ción por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de un fragmento de 280 pb (pares de bases) utilizando iniciadores marcados. Los amplicones son hibridados con sondas inmovilizadas sobre una membrana y reve- lados por colorimetría. Se aplica a cultivos crecidos en medio líquido o medio sólido. Presenta una elevada sensibilidad y especificidad pero solo permite la identificación de un número limitado de especies de micobac- terias no tuberculosas y al CMT en global (58).
c) GenoType MTBC (Hain Lifesccience GmbH. Nehren. Alemania):
se basa, como en el método anterior, en una hibridación inversa sobre una membrana que contiene fijada sondas específicas; las sondas son fragmentos de un gen que codifica para el 16S ARNr. Este método tam- bién se aplica a cultivos crecidos en medio líquido o medio sólido y es el más específico de todos, ya que es capaz de identificar las diferentes especies del CMT (59).
Estudio de genes:
a) PCR-RFLP del gen gyrB: existen diversos métodos que analizan genes para identificar a nivel de especie el CMT. Uno de ellos, es el gen gyrB, que codifica para la síntesis de una girasa. Mediante una PCR- RFLP (polimorfismo de los fragmentos de restricción) se consigue di- vidir a las especies micobacterianas en dos grandes grupos, cepas que pertenecen al CMT que amplifican un fragmento de 1020 pb y cepas no tuberculosas que no amplifican ningún fragmento de este gen.
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A través de la combinación de las enzimas de restricción Rsal, SacII y TaqI se pueden identificar a nivel individual cuatro de las especies del CMT (M. tuberculosis, M. microti, M. africanum y M. bovis) (60). El es- tudio aislado de este único gen no es suficiente para la completa discri- minación entre especies (61).
b) PCR-RFLP del gen hsp65: este gen se encuentra altamente con- servado en todas las especies de micobacterias e incluso en otros géneros relacionados como Nocardia. Codifica para una proteína que está im- plicada en el shock térmico (denominada en inglés heat shock protein 65) y que posee un elevado poder antigénico. Es considerada como la proteína más inmunorreactiva de las micobacterias, es un componente crucial en la adhesión de M. tuberculosis a los macrófagos y se considera la principal diana en el complejo proceso inmune desencadenado en la infección tuberculosa (62).
El gen hsp65 contiene dos regiones hipervariables entre las posicio- nes 624-664 y 683-725, cuyas secuencias son utilizadas para la identifi- cación de las micobacterias (63).
La PCR-RFLP de este gen no presenta capacidad para discriminar entre las especies del CMT y es utilizada en estudio de las micobacterias no tuberculosas. No obstante, sí ha sido descrita su aplicación en la di- ferenciación de M. canettii, ya que todas las especies del CMT generan cuatro fragmentos de restricción tras un proceso de digestión, mientras que M. canettii solo genera tres fragmentos de diferente tamaño debido a la pérdida de una diana de restricción para la enzima HhaI (64,65).
Estudio de regiones variables:
Los miembros del CMT poseen en su genoma regiones variables o de diferenciación (RD) cuya presencia o ausencia resulta de utilidad en la identificación de las especies. Se ha evidenciado la presencia de 16 de estas regiones de diferenciación (66).
Las regiones RD3, RD5 y RD11 contienen elementos móviles con dis- tribución variable entre los miembros del CMT. Por el contrario, las re- giones RD1, RD9 y RD10 no contienen elementos móviles en sus secuencias y las deleciones ocurren como resultado de la escisión de genes (67).
La región RD 1 se encuentra presente en M. bovis y M. caprae y está delecionada en M. bovis-BCG. La región RD 9 está presente en todas las cepas de M. tuberculosis y ausente en M. africanum (68).
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La combinación del estudio de estas regiones variables mediante PCR-múltiple, con la técnica PCR-RFLP del gen gyrB y la PCR-RFLP del gen hsp65, vistas anteriormente, llevaron a Herrera-León y colaborado- res al diseño de un algoritmo capaz de identificar las especies del CMT de forma muy precisa (65).