Pretratamiento de las muestras

Las muestras de los pacientes fueron recibidas en el laboratorio de Microbiología del CHUA. Se realizó un estudio inicial de la calidad de las muestras para valorar la idoneidad de su procesamiento. Si las mues- tras superaban este cribado inicial, entonces se les aplicaba dos procedi- mientos: la baciloscopia (mediante la tinción de BAAR) y el cultivo de micobacterias.

• Existen diferentes criterios de rechazo de muestras. Nosotros consideramos como muestras inaceptables para su cultivo aque- llas que cumplían las siguientes características:

• Saliva y esputos de los grupos 1 y 2 (Tabla 1). Son muestras de mala calidad procedentes de descargas nasofaríngeas o saliva y sólo se procesaron para cultivo si la baciloscopia era positiva.

• Orinas en cantidad insuficiente (menos de 30 ml) y remitidas en contenedor inadecuado (tubo con conservante para cultivo aero- bio).

• Muestras en escobillón. Únicamente se aceptaban si la muestra no había podido ser recogida de otra forma.

• Heces. No fueron procesadas para cultivo pero sí se les realizaba la tinción BAAR.

• Sangre o médula ósea recogidas en tubo con EDTA. Estas mues- tras debían ser recogidas en tubos con heparina.

• Aspirados gástricos sin neutralizar con carbonato sódico de for- ma inmediata (antes de 4 horas tras la recogida de la muestra).

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• Más de una muestra del mismo paciente y del mismo origen reco- gidas en un intervalo menor de 24 horas.

• Esputos para control de tratamiento remitidos antes de 3 semanas post-tratamiento. No se procesaron para cultivo pero sí se les rea- lizó tinción BAAR.

A. Muestras de esputo

El caso de los esputos requiere una mención especial, ya que es nece- saria una valoración de su calidad previa a su procesamiento. Para ello, realizamos un examen microscópico directo de las muestras, siguiendo el siguiente procedimiento:

1. Las muestran fueron extendidas en un portaobjetos y teñidas me- diante la tinción de Gram. Esta técnica presenta los siguientes pasos:

• Fijación de la muestra con metanol (MERK) durante un minuto.

• Tinción con cristal violeta (Francisco Soria Melguizo S.A) o vio- leta de genciana fenicada (Pancreac Quimica Sau) durante 30 se- gundos, después lavar con agua y dejar secar a temperatura am- biente.

• Añadir lugol como mordiente (Francisco Soria Melguizo S.A) y dejar actuar 30 segundos. Lavar y dejar secar.

• Agregar alcohol acetona como decolorante (Quality Chemicals), dejar actuar 15 segundos, después lavar y dejar secar.

• Por último, añadir safranina (Francisco Soria Melguizo S.A) o fucsina fenicada (Química Analítica Aplicada S.A) durante un minuto, lavar y dejar secar a temperatura ambiente.

2. Una vez teñida la muestra, fue observada con un microscopio óp- tico (Nikon Eclipse E400) con un objetivo de 10 aumentos y se realizó un recuento del número de leucocitos polimorfonucleares y de células epiteliales presentes por campo de visión.

3. En función de la cantidad de leucocitos y células presentes en la muestra ésta fue clasificada dentro de un grupo determinado. En la Tabla 1 podemos observar estos criterios de valoración y el sistema de clasifi- cación de los esputos en diferentes grupos.

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Tabla 1. Criterios de valoración de esputos

Grupo PMN1/campo 10x CEP2/campo 10x

G1 <10 >25

G2 10-25 >25

G3 >25 >25

G4 >25 10-25

G5 >25 <10

G6 <25 <25

1. Leucocitos polimorfonucleares. ². Células epiteliales

4. Los esputos de los grupos 1 y 2 presentan más de 25 células epitelia- les por campo y se consideran muestras de mala calidad; en este caso, los esputos no fueron procesados ni para cultivo ni para tinción BAAR. No obstante, se aplicó una excepción a estos criterios generales, en los casos de pacientes que se encontraban en alguna de las siguientes situaciones:

• Si existía por parte del médico solicitante una sospecha clínica fundada.

• Pacientes atendidos en Urgencias del hospital.

• Pacientes con hemoptisis.

• Pacientes con algún factor de riesgo de enfermedad tuberculosa:

extranjeros procedentes de países con alta incidencia, residentes en prisiones, consumidores de drogas parenterales, alcohólicos, convertores de la tuberculina, vagabundos, personas infectadas por VIH, radiografía pulmonar anormal, inmunodeprimidos por trasplante de órganos, en tratamiento con corticoides, trastornos hematológicos, insuficiencia renal crónica, carcinomas de cabeza, cuello y pulmón.

5. Los esputos de los grupos 3, 4 y 5 contienen más de 25 leucocitos polimorfonucleares por campo y se consideran muestras de buena cali-

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dad. Estas muestras fueron procesadas tanto para tinción BAAR como para cultivo.

6. Los esputos del grupo 6, a pesar de ser consideradas estrictamente muestras de mala calidad, pues presentan menos de 25 leucocitos por campo, si se trataba de pacientes con granulocitopenia, eran aceptados tanto para cultivo como para tinción BAAR.

B. Otras muestras:

• Los líquidos estériles, incluido el LCR, y las orinas fueron centrifu- gados a 4000 rpm durante 15 minutos, se separó el sobrenadante y nos quedamos con el sedimento.

• Los tejidos procedentes de biopsias fueron troceados con un escalpe- lo quirúrgico en una placa petri hasta alcanzar una consistencia ho- mogénea. Se añadió un poco de tampón fosfato o de agua destilada para mantener húmeda la muestra y fueron transvasados a un tubo cónico de 50 ml.

• Las muestras de sangre y médula ósea se transvasaron a tubos de centrífuga, a los que se añadió agua destilada estéril hasta alcanzar un volumen de 50 ml, y fueron agitados hasta obtener una hemólisis completa. Se centrifugaron durante 15 minutos a 4000 rpm y nos quedamos con 1 ml aproximadamente del sedimento.

• El resto de muestras no requirió ningún paso de tratamiento previo.