I.I NTRODUCCIÓN
I.3. Epidemiología molecular
I.3.3. MIRU-VNTR
La técnica MIRU-VNTR (Unidad Repetitiva Intercalada Micobac- teriana - Número Variable de Repeticiones en Tándem, del inglés, Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-Variable Number Tan- dem Repeat) se basa en el estudio de minisatélites. Los minisatéli- tes están compuestos por secuencias de ADN de 10-100 pb que se repiten de forma consecutiva, en tándem, en un locus cromosómico específico. Los loci que presentan polimorfismo entre individuos de una especie reciben el nombre de VNTR (número variable de repeti- ciones en tándem) (99).
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Los primeros loci VNTR se localizaron en cósmidos de M. tuber- culosis H37Rv, antes de la publicación de su genoma. Estas secuen- cias se denominaron secuencias en tándem repetitivas exactas (ETR), presentaban una longitud de 53 y 79 pb y eran específicas del CMT (100).
En 1997 se detectó mediante secuenciación un locus VNTR en la región intergénica senX3-regX3 de M. tuberculosis (101). Esta región senX3-regX3 IR se encontraba compuesta por un nuevo tipo de secuen- cia repetitiva a la que se denominó MIRU (Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit) (102). Los MIRUs eran secuencias de fragmentos de un tamaño de 77 pb o de 53 pb que eran específicos de este tipo de micobac- terias y que permitían diferenciar entre especies del CMT (Figura 10).
Así por ejemplo se pudo diferenciar M. bovis-BCG, que no presentaba ningún 53 pb MIRU (103).
Figura 10. Secuencia VNTR localizada en el locus senX3-regX3 del cromosoma de M. tuberculosis.
Tras la publicación en 1998 de la secuencia completa del genoma de M. tuberculosis H37Rv (78) (Figura 11) y el constante desarrollo de herramientas bioinformáticas, se ha revelado hasta el momento la existencia de 1500 regiones potenciales que contienen repeticiones en tándem.
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43 Figura 11. Representación esquemática del cromosoma de
M. tuberculosis (91).
El equipo francés de Supply y colaboradores realizó una búsqueda de estas secuencias en todo el genoma de M. tuberculosis y detectaron 41 loci MIRU, que presentaban una secuencia central conservada y sus tama- ños oscilaban entre 40 y 100 pb. De estos 41 loci, sólo 12 ofrecieron polimor- fismo (MIRU 2, 4, 10, 16, 20, 23, 24, 26, 27, 31, 39 y 40) (Figura 12) (104).
Figura 12. Representación esquemática de la localización y estructura de los 41 loci MIRU del genoma de M. tuberculosis H37Rv. Los puntos negros indican los 12 loci polimórficos.
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La función biológica de los loci MIRU-VNTR en M. tuberculosis se desconoce. La mayor parte de ellos se localizan en regiones intergénicas del cromosoma de M. tuberculosis, aunque un número escaso se encuen- tra dentro de ORFs (Open Reading Frames), como el ETR-A que está situado en un ORF implicado en fenómenos de multirresistencia.
Por el momento no se ha determinado si las variaciones en el núme- ro de copias o en las secuencias afectan la expresión de genes vecinos, sin embargo, los loci VNTR localizados en ORFs podrían codificar para proteínas de superficie de M. tuberculosis y proteínas polimórficas invo- lucradas en la adaptación de la micobacteria al entorno, protegiendo al bacilo de los mecanismos defensivos del hospedador (105).
Los loci MIRU-VNTR descritos reciben distintos nombres según el estudio. Por ejemplo, ETR-D (100) se llama también MIRU 4 (104) y VNTR 0580 (105). Por este motivo, en el año 2000 se propuso estan- darizar la nomenclatura para denominar los loci VNTR nombrándolos con los 4 dígitos que indican la posición del locus correspondiente en el genoma de H37Rv (106).
El sistema basado en 12 loci MIRU (104,107) ha sido el más utilizado hasta el momento. Sin embargo, aunque muestra la estabilidad adecuada para su empleo en epidemiología molecular, su capacidad discriminato- ria sigue siendo inferior a la del método estandarizado IS6110 (95,108).
En el año 2006, Supply y colaboradores publicaron una propuesta de estandarización de la técnica MIRU-VNTR. Se investigó por primera vez el poder de resolución, la estabilidad clonal y aplicabilidad técnica de 24 loci MIRU-VNTR en una colección de 824 aislados representativa de los principales linajes del CMT. Elaboraron un set de 24 loci MIRU-VNTR que incluía un subset de 15 loci MIRU-VNTR que concentraba el 96%
de la resolución del primero. La propuesta se basaba en la aplicación del sistema 15 loci como nuevo estándar para la discriminación epidemio- lógica rutinaria de aislados de M. tuberculosis y del sistema de 24 loci por su alta resolución para la realización de estudios filogéneticos (98).
Diversos estudios confirman el elevado poder de resolución y la ca- pacidad para establecer vínculos epidemiológicos de este nuevo panel de loci, llegando incluso a superar a la proporcionada por el método de referencia IS6110 RFLP si se combina con el espoligotipado (109,110).
Entre las principales ventajas de esta técnica encontramos que es alta- mente reproducible, se obtiene un código numérico para cada cepa que permite el intercambio de información en bases de datos internacionales
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(http://www.miru-vntrplus.org) (111) y a diferencia del método de re- ferencia IS6110, es una técnica muy rápida, aplicable a extractos crudos de ADN poco crecidos y útil en todos los aislados de M. tuberculosis, incluidas las cepas con un bajo número de IS6110. A diferencia del spoli- gotipado, los polimorfismos MIRU-VNTR aparecen en múltiples zonas del genoma (análisis multilocus).
Además de su utilidad en estudios epidemiológicos, esta técnica per- mite diagnosticar infecciones mixtas (112), distinguir en casos de TB recurrente entre reactivación y reinfección (113,114) e identificar en el laboratorio contaminaciones en cultivos positivos para el CMT (115).
Todas estas ventajas frente al gold standard IS16110 hacen previsible que en un futuro cercano esta técnica se imponga como método de re- ferencia.
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