Epidemiología molecular de la tuberculosis en el área sanitaria de Albacete / Julia Lozano Serra. Me gustaría expresar mi agradecimiento al Instituto de Estudios Albacetense "Don Juan Manuel" Excma.
NTRODUCCIÓN
Generalidades de la tuberculosis
- Reseña histórica
- Situación de la tuberculosis en el mundo
- Situación de la tuberculosis en Europa
- Situación de la tuberculosis en España
- Situación de la tuberculosis en Castilla-La Mancha
- Tuberculosis e inmigración
Durante siglos, este alimento fue considerado un elemento esencial en el tratamiento de la tuberculosis (4). En cuanto a la localización de la enfermedad (Figura 5), la tuberculosis respiratoria fue la forma más frecuente (77,2%; en Albacete 81,8%) y la meningitis tuberculosa la menos comunicada (3,3%).
Complejo Mycobacterium tuberculosis
- Características generales
- Patogenía
- Métodos de identificación
- Métodos fenotípicos
- Métodos moleculares
La PCR-RFLP de este gen carece de la capacidad de diferenciar entre especies de CMT y se utiliza en el estudio de micobacterias no tuberculosas. Los miembros de CMT tienen regiones variables o de diferenciación (RD) en su genoma, cuya presencia o ausencia es útil en la identificación de especies.
Epidemiología molecular
- Técnica IS6110 RFLP
- Spoligotyping
- MIRU-VNTR
Se basa en el polimorfismo de la región DR (Repetición Directa), específico de CMT y también presente en aislados sin ningún IS6110 (88). En 2006, Furnizimi y colegas publicaron una propuesta para la estandarización de la técnica MIRU-VNTR.
HIPÓTESIS
Este hecho hace necesario la realización de estudios epidemiológicos para conocer la situación de la enfermedad en nuestro entorno. En la provincia de Albacete no se ha realizado ningún estudio al respecto que nos haya incentivado a analizar la epidemiología desde el punto de vista microbiológico de la enfermedad en esta área sanitaria.
OBJETIVOS
Describir la epidemiología de la enfermedad tuberculosa en el área sanitaria de Albacete mediante métodos convencionales y moleculares. Estudiar la epidemiología molecular de la tuberculosis en nuestro medio mediante la detección de clusters (agrupaciones) de similitud genética.
MATERIAL Y MÉTODOS
Periodo y población de estudio
- Fuentes de información
- Protocolo de recogida de información
La investigación se centró en pacientes con enfermedad tuberculosa diagnosticada que fueron atendidos en el Nivel de Atención Hospitalaria del Área de Salud de Albacete. Según datos del Censo de población y viviendas de 2011 del Instituto Nacional de Estadística (INE) y del Servicio de Información Sanitaria del Ministerio de Sanidad.
Material microbiológico
- Procedencia de los aislamientos clínicos
- Técnicas de procesamiento
- Pretratamiento de las muestras
- Tratamiento de las muestras
La emisión de resultados se realizó según los criterios mostrados en la Tabla 5. Se recogió información sobre el tratamiento antituberculoso previo en el 88% de los pacientes (117/133). En los casos, los problemas asociados con los medicamentos llevaron a un cambio en el régimen terapéutico.
Los casos de tuberculosis incluidos en el estudio fueron declarados al Ministerio de Salud (Tabla 15). Características sociodemográficas y clínico-epidemiológicas de los casos cluster y no cluster en población indígena. La mayor dificultad en el manejo de pacientes de edad avanzada ha sido descrita en la literatura.
Más de la mitad de los pacientes tenían lesiones cavitadas en la radiografía de tórax, un patrón radiológico altamente sugestivo de tuberculosis pulmonar. Características sociodemográficas y clínico-epidemiológicas de los casos cluster y no cluster en población inmigrante ..127.
2.2.2.1. Métodos fenotípicos
2.2.2.2. Inoculación en medios de cultivo
Los tubos de medio MGIT líquido constan de medio Middelbrook clásico más un componente fluorescente (los tubos penta-MGIT se enriquecieron, antes de la inoculación, con una mezcla llamada ODAC-PANTA (Becton, Dickinson and Company). Finalmente, todos los tubos se colocaron en el Incubadora BD BACTECT MGIT 960 (Becton, Dickinson and Company).
Los tubos se incubaron en una estufa a 35-37°C, manteniéndolos inclinados para asegurar un mejor contacto de la muestra con el medio y con la tapa ligeramente abierta para facilitar el intercambio de aire.
2.2.2.3. Subcultivo
Métodos de caracterización del Complejo M. tuberculosis
- Caracterización fenotípica
- Velocidad de crecimiento
- Aspecto morfológico de las colonias
- Tinciones de ácido-alcohol resistencia
En el proceso de identificación de cepas se estableció un protocolo basado en el estudio de las características fenotípicas de las micobacterias y su análisis genético. Se analizó una muestra por paciente, excepto en el caso de un paciente en el que se analizaron dos muestras porque los episodios ocurrieron con más de un año de diferencia. Las cepas de las muestras clínicas estudiadas en este trabajo se sembraron en los medios adecuados y en todas ellas se registraron los tiempos de detección de crecimiento.
Observamos y registramos las características morfológicas de todas las colonias cultivadas a partir de muestras clínicas en medios sólidos.
3.1.3.1. Tinción auramina rodamina
Las especies de CMT muestran una gran heterogeneidad fenotípica, pero en general, las colonias de M. se utilizaron para revelar la morfología y la resistencia ácido-alcohol (AAR) de las micobacterias.
3.1.3.2. Tinción de Ziehl –Neelsen
Estudio de las características bioquímicas
- Reducción de nitratos
- Producción de catalasa a 68°C
Las micobacterias tienen diferentes capacidades para reducir nitratos a nitritos, dependiendo de la presencia y actividad de la enzima nitrato reductasa. Se elaboró una suspensión con una pequeña cantidad de colonia de micobacterias cultivada a partir de medio sólido Coletsos en un tubo que contenía 1 ml de reactivo 1. Es una enzima intracelular presente en todas las micobacterias y tiene diferentes características dependiendo de la especie.
Por otro lado se hizo una mezcla de tres partes de reactivo 1 con una parte de reactivo 2 y se agregaron 3 gotas de esta mezcla al tubo con la suspensión de micobacterias.
Caracterización genotípica
- Identificación mediante sonda de ADN
- Identificación molecular de las especies del
- Técnica MIRU-VNTR
El tamaño de los productos amplificados, como en el paso 1 (PCR-RFLP gyrB/RsaI), se analizó mediante electroforesis en geles de agarosa al 0,8% y análisis de patrones de restricción en geles de agarosa al 2%. La secuencia de cebadores y condiciones de cada PCR se resumen en la Tabla 7. Secuencia de cebadores y condiciones de amplificación utilizadas en las PCR de identificación de especies de CMT.
Las designaciones y alias convencionales de los loci MIRU-VNTR para ambos formatos se muestran en la Tabla 8.
3.3.3.1. Asignación de alelos
3.3.3.2. Cálculo de la diversidad alélica
3.3.3.3. Cálculo del poder discriminatorio de los
3.3.3.4. Cálculo de la tasa de agrupamiento
Estudio de sensibilidad a fármacos
Preparación del inóculo: Los tubos MGIT detectados como positivos por el sistema BACTEC MGIT 960 podrían usarse hasta 3 días después para el estudio de susceptibilidad; pero si habían pasado de 3 a 5 días era necesario diluir el tubo MGIT 1/5 con agua destilada. Después de más de 5 días fue necesario realizar un nuevo cultivo en MGIT antes de proceder al estudio de sensibilidad. Se añadió el inóculo: 0,5 ml del inóculo diluido 1/10 y 1/100 a los tubos GC PZA y GC SIRE, respectivamente, y 0,5 ml del inóculo inicial al resto de los tubos.
Lectura de resultados: los controles de crecimiento (SIRE o PZA) se detectaron positivos cuando alcanzaron las 400 unidades.
Procesamiento y análisis estadístico de los datos
RESULTADOS
Estudio descriptivo de los pacientes
- Estimación de la incidencia
- Características generales
- Datos sociodemográficos
- Comorbilidad
- Grupos de riesgo
- Datos específicos sobre tuberculosis
- Antecedentes de la enfermedad
- Manifestaciones clínicas
- Diagnóstico
- Forma de presentación de la enfermedad
- Tratamiento antituberculoso
- Otros aspectos
La duración de la estancia en España de los pacientes inmigrantes quedó registrada en el 71,8% de las historias clínicas (51/71). Sin embargo, en el 20,3% de los casos (27/133) se identificó un estado de alcoholismo activo, clasificado como moderado o profuso, y en 2 casos (1,5%) existía dependencia previa. Durante la hospitalización, todos los pacientes permanecieron en situación de aislamiento respiratorio.
Para el diagnóstico de la infección, la historia clínica indicó que se realizó la prueba de tuberculina en el 62,4% de los pacientes (83/133), utilizándose la reacción intradermor de Mantoux; El 80,7% de los casos (67/83) tuvieron resultado positivo (Figura 29).
Estudio descriptivo de las cepas de M. tuberculosis
- Muestras de origen de los aislamientos
- Baciloscopia
- Identificación de las especies del Complejo M. tuberculosis
- Perfil de resistencias a fármacos antituberculosos
En el estudio de las características bioquímicas de los aislados se obtuvo: la prueba de nitrato fue negativa en 3 cepas y positiva en las 116 restantes y la prueba de catalasa a 68°C fue negativa en todos los casos. Una de las cepas cumplía los criterios de tuberculosis XDR, que es resistente a todos los fármacos de primera línea y a un fármaco parenteral de segunda línea (kanamicina). El estudio de resistencia fue confirmado en el Centro Nacional de Microbiología (Instituto de Salud Carlos III) donde, además, se realizaron análisis de mutación genética de las cepas.
Los resultados del análisis genético de la farmacorresistencia de la tuberculosis no fueron incluidos en esta investigación porque no fueron objeto de análisis en esta tesis.
Epidemiología molecular
- Genotipificación por 12-MIRU-VNTR
- Genotipificación por 24-MIRU-VNTR
- Resultados obtenidos con los métodos
- Estudio de los casos en cluster
- Estudio del grado de transmisión reciente
Con el objetivo de incrementar el nivel de discriminación en este trabajo, tipificamos los aislados agrupados por 12-MIRU-VNTR (50/119) utilizando la técnica 24-MIRU-VNTR. La técnica 12-MIRU-VNTR tipificó 50 aislados asociados con 18 grupos de 2 a 8 aislados, mientras que la técnica 24-MIRU-VNTR produjo 17 aislados agrupados en 7 grupos de 2 a 4 aislados. En el cluster Tb4 encontramos un hombre español jubilado con antecedentes personales de tuberculosis en su infancia y otro caso de una joven española sin relación conocida con el primer caso.
La tasa de transmisión reciente en el conjunto de la población, obtenida calculando la tasa de clustering o clustering, da un resultado del 8,4%.
Análisis estadístico de los datos
- Análisis bivariado de los factores asociados a tuberculosis
- Análisis bivariado de los factores asociados a posible
Se analizaron las características sociodemográficas y clínico-epidemiológicas de 117 pacientes, agrupados y no agrupados, para establecer su posible asociación con la transmisión reciente de tuberculosis en la población. La relación entre edad y posible transmisión ha sido estudiada recientemente en el total de casos y de forma independiente en población autóctona e inmigrante (Tabla 26 y Tabla 27). Características sociodemográficas y clínico-epidemiológicas de los casos agrupados y no agrupados en la población general.
En el análisis bivariado de las características relacionadas con la distribución de casos cluster y no cluster en la población nacional no se encontró asociación estadísticamente significativa (Tabla 29).
DISCUSIÓN
- Estudio descriptivo de los pacientes
- Estudio descriptivo de las cepas de M. tuberculosis
- Epidemiología molecular
- Caracterización molecular de los aislados de
- Análisis de los casos en cluster y estudio del grado
- Limitaciones del estudio
También proporcionamos información clínica, diagnóstica y epidemiológica que puede ayudar a controlar la enfermedad tuberculosa en nuestro entorno. Lamentablemente, y como ocurre en la mayoría de los trabajos sobre este tema en nuestro país (72.135), la tuberculosis afecta sorprendentemente a personas jóvenes, lo que refleja un déficit en el control de la enfermedad. Análisis de grupos de casos y estudio reciente de la tasa de transmisión de la tuberculosis.
Finalmente, para este estudio sólo se consideraron los pacientes remitidos a Atención Hospitalaria en algún momento de la enfermedad.
CONCLUSIONES
El porcentaje de casos de tuberculosis diagnosticados en la población autóctona disminuyó paralelamente al aumento de casos de pacientes inmigrantes. Los UDI y los pacientes inmunocomprometidos se asociaron significativamente con la población autóctona. No se ha encontrado evidencia de una mayor transmisión de tuberculosis de la población inmigrante a la población nativa.
En la población indígena no se encontró ningún factor sociodemográfico ni clínico-epidemiológico asociado a una posible transmisión reciente; Sin embargo, en la población inmigrante, la presencia de antecedentes personales o familiares de tuberculosis se asoció significativamente con la pertenencia al grupo.
BIBLIOGRAFÍA
Peña MJ, Roadman JA, Fields-Blacksmith MI, Rodríguez-Gallego JC, García-Laorden MI, Cabrera P, et al. Lucerna MA, Rodríguez-Contreras R, Barroso P, Martínez MJ, Sánchez-Benítez ML, García de Viedma D, et al. Alonso Rodríguez N, Chaves F, Iñigo J, Bouza E, García de Viedma D, Grupo y Estudio de Epidemiología Molecular de la Tuberculosis en Madrid, et al.
Ruiz López FJ, Zarauz García JM, Ortiz Romero MM, Valero Martínez JR, Peñalver Mellado C, Sánchez Gascón F, et al.
ANEXOS
- Protocolo de recogida de información a partir de
- Tablas de asignación de los alelos de los loci MIRU-VNTR
- Índice de figuras
- Índice de tablas
- Índice de abreviaturas
Características sociodemográficas y clínico-epidemiológicas de los casos cluster y no cluster en la población nativa. RFLP: Longitud del fragmento de restricción Polimorfismo H: isoniazida.
