MICROSCOPIO
Aumento total del microscopio
La magnificación o aumento total de un
microscopio es el resultado de multiplicar la magnificación del objetivo por la del ocular. Este valor es equivalente al resul- tado del cociente entre el tamaño de la imagen aumentada y la real, o al de la rela- ción entre los ángulos visuales de la imagen vista con el microscopio y el de la imagen vista directamente con el ojo. En microscopía óptica el rango más habitual de aumento del objetivo comprende desde 3x a 100x y el rango de aumento de los oculares de 5x a 15x, por lo que el aumento total abarca de 15 a 1500 veces el tamaño de la imagen real.
Aumento total =
aumento del objetivo x aumento del ocular Figura 2.4. Dibujo esquemático de la trayectoria
seguida por los rayos lumínicos. A: plano del diafrag- ma de campo, B: plano del diafragma del condensa- dor.
FUNDAMENTOS DE NEUROCIENCIA. MANUAL DE LABORATORIO
Poder de resolución y apertura numérica
El término resolución hace referencia a la distancia mínima que debe separar a dos puntos para que éstos se vean indepen- dientemente. Por tanto, el poder resolutivo
de un microscopio es su capacidad para separar dos puntos muy próximos. El poder de separación o resolución de un microscopio depende de la longitud de onda de la luz utilizada y de la propiedad óptica de las lentes del objetivo denomi-
nada apertura numérica. La apertura
numérica de la lente determina el ángulo de incidencia de la luz. Como normalmente la longitud de onda de la luz se mantiene constante, se puede afirmar que la resolu- ción depende principalmente de la aper- tura numérica del objetivo. Existe una correlación directa entre la apertura numé- rica y el aumento del objetivo en cuestión. El rango de apertura numérica puede variar desde 0,3 en objetivos de bajo aumento hasta 1,4 en los objetivos de 100x. Cuanta más apertura numérica tenga el objetivo más luz difractada recogerá, mayor reso- lución tendrá la imagen y más detalles podrán distinguirse en ésta. Normalmente en los objetivos se indica su apertura numérica, siendo más costosos y complejos los sistemas de lentes de los objetivos de mayor apertura.
Existen otros modos de incrementar el poder de resolución de un microscopio. En este sentido, y como ya se ha comentado anteriormente, es muy importante realizar un ajuste adecuado de la iluminación que llega al objetivo. Para conseguir este propósito se puede aumentar la apertura numérica del condensador.
El concepto de aumento útil alude a la relación entre el aumento de los objetivos de un microscopio, el poder de resolución y la apertura numérica. Debido a las propias características físicas de la luz
visible, existe un límite en el empleo de los aumentos por encima del cual se reduce el poder de resolución, no pudiendo ser observados los detalles más sutiles de los objetos. Por tanto, debe buscarse una fórmula de compromiso entre los aumentos a emplear y el poder de resolución que deseamos obtener. El rango de la magni- ficación útil en microscopía óptica se sitúa entre 500 y 1000 veces la apertura numé- rica del objetivo.
Poder de definición
El poder de definición es la cualidad de
los objetivos por la que se presentan más o menos contrastados los contornos de una imagen. Esta propiedad es inversa- mente proporcional al poder de resolución, por lo que a una mayor apertura numérica corresponde un poder de definición más bajo. Se produce, entonces, una pérdida de contraste con el incremento de la aper- tura numérica. Un bajo poder de defini- ción, derivado del empleo de un objetivo de elevada apertura numérica, puede mejorarse con tinciones que incrementan el contraste de las muestras objeto de análisis.
Profundidad de foco o profundidad de campo
Al hablar de resolución en microscopía óptica se suele hacer mucho énfasis en la resolución del eje perpendicular al eje óptico del objetivo. Sin embargo, un aspecto importante en la resolución del microscopio es el poder resolutivo axial del objetivo, lo que habitualmente se deno-
mina profundidad de campo. Al igual que
en fotografía, el concepto de profundidad de campo en microscopía hace referencia a la distancia que existe entre el plano más cercano y el más lejano al objetivo, que se 46
Cuadro 2.2. Aberraciones ópticas en microscopía
El concepto de aberración óptica hace referencia a las anomalías en la imagen del objeto obser- vado al microscopio, derivadas de los defectos ópticos de las lentes. Una aberración en un dis- positivo óptico consistente en una sola lente resulta difícil de eliminar. Sin embargo, la combi- nación de diferentes tipos de lentes y cristales permite reducir este fenómeno al contrarrestarse los defectos de una superficie con los defectos iguales y opuestos de otras. Se distinguen dos tipos principales de aberraciones: aberraciones geométricas y aberraciones cromáticas. Las pri- meras están relacionadas con la naturaleza esférica de las lentes utilizadas y la segunda deriva de la variación de los índices de refracción del amplio rango de frecuencias que constituyen la luz visible. La aberración esférica se produce cuando las ondas de luz que pasan por la perife- ria de la lente no se encuentran en el mismo foco que las ondas que pasan por el centro de la misma. Este fenómeno se debe a la diferencia en la desviación sufrida por los rayos que pasan por el centro de la lente y los rayos que pasan cerca de la periferia. Los rayos que pasan cerca de la periferia son refractados en un mayor grado, resultando en la producción de diferentes pun- tos focales a lo largo del eje óptico. La aberración esférica afecta seriamente a la resolución, puesto que provoca una dispersión de la imagen. Para corregir esta aberración se puede reducir la luz incidente en el borde de la lente haciendo uso del diafragma. Los objetivos modernos de alta calidad reducen este defecto usando lentes de diferentes curvaturas y controlando de forma exhaustiva el camino seguido por el haz de rayos de luz. Dentro de las aberraciones geométri- cas también se encuentran las siguientes: coma, astigmatismo y curvatura de campo. La aberra- ción de tipo coma se produce cuando las diferentes zonas concéntricas de una lente producen distintos aumentos. Una lente con esta aberración produciría una imagen en forma de cometa de cualquier objeto puntiforme desplazado del eje óptico. Normalmente esta aberración es corregi- da a la vez que se corrige la aberración esférica. El astigmatismo se produce cuando la imagen de un objeto puntiforme situado fuera del eje óptico aparece como dos imágenes lineales sepa- radas y perpendiculares entre sí. La curvatura de campo es una consecuencia de la curvatura que poseen la mayoría de las lentes. El resultado es la producción de una imagen curvada de un obje- to plano. Cuando la parte central está enfocada no lo está la periferia y viceversa. Usualmente no es un obstáculo demasiado importante puesto que el observador puede reenfocar continua- mente la muestra con el tornillo micrométrico. Sin embargo, constituye un serio problema a la hora de realizar fotomicrografías, puesto que una parte de la misma se encontrará fuera de plano. Tradicionalmente ha sido la aberración más difícil de eliminar con los objetivos acromáticos, pero se ha mejorado con la introducción de los objetivos de campo plano o planacromáticos. La aberración cromática se produce como resultado de la descomposición de la luz blanca en diferentes longitudes de onda. Cuando la luz blanca pasa a través de una lente convexa, las lon- gitudes de onda que la componen son refractadas de acuerdo con su frecuencia. La luz azul es la refractada en mayor grado, seguida de la verde y de la roja. La incapacidad de la lente para reunir todas las longitudes de onda en el mismo foco resulta en una pequeña variación en el tamaño de la imagen y en el punto focal diferente para cada una de las longitudes de onda pre- dominantes. Como consecuencia de este fenómeno aparece un halo de colores alrededor de la imagen observada. Esta aberración puede ser corregida utilizando parejas de lentes en las que cada una de las lentes constituyentes posee índices de refracción y propiedades dispersivas dife- rentes. Estos conjuntos de lentes son conocidos como lentes acromáticas. Con las lentes acro- máticas puede conseguirse que dos de los tres colores estén situados en el mismo plano focal. Para conseguir la coincidencia de la luz de las tres longitudes de onda en el mismo plano focal hay que usar lentes apocromáticas. Estas lentes son muy costosas y sólo las tienen los objetivos de muy alta calidad.
FUNDAMENTOS DE NEUROCIENCIA. MANUAL DE LABORATORIO
encuentran simultáneamente enfocados. Los objetivos de menor aumento tienen una mayor profundidad de campo. La profundidad de campo también es inver- samente proporcional a la apertura numé- rica. Por este motivo, para conseguir una buena observación en profundidad hay que renunciar a un buen poder de resolu- ción en el eje horizontal.
Contraste
Elcontraste es la diferencia de brillo entre distintos detalles de la muestra observada o entre el objeto observado y el medio. En el estudio del sistema nervioso mediante microscopía óptica es común encontrarse ante situaciones de bajo contraste. Sin embargo, como veremos en el capítulo siguiente, la aplicación de diferentes técnicas de tinción incrementa enorme- mente el contraste en la preparación.