NERVIOSO
La segunda etapa en la preparación del tejido nervioso es el corte en secciones finas de pocas micras de grosor. Esta operación tiene dos importantes ventajas. Por un lado facilita la difusión de los colo- rantes y otros reactivos que se usarán durante el procesado. Por otro lado, debido a que el haz de luz del microscopio atraviesa fácilmente las secciones finas, los elementos no teñidos del tejido nervioso aparecen casi transparentes. Generalmente, el grado de dureza obte- nido tras la fijación es insuficiente para poder cortar el tejido nervioso en secciones finas y homogéneas. Los proce- dimientos más utilizados para que el tejido adquiera la consistencia adecuada son la congelación de la pieza, la encastración y la inclusión de la misma en sustancias de mayor dureza, por ejemplo, celoidina o parafina (ver Cuadro 3.2).
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Formaldehído neutro tamponado al 10%
Fosfato de sodio monobásico……… 4 g. Fosfato de sodio dibásico……… 6.5 g. Formaldehído al 37%……… 100 ml. Agua destilada……….. 900 ml. Solución de Bouin
Acido pícrico saturado………. 600 ml. Formaldehído………... 200 ml. Ácido acético glacial……… 4 ml. Alcohol 95º
Alcohol absoluto………. 950 ml. Agua destilada……… 50 ml.
Cuando la pieza de tejido ha adquirido la consistencia y dureza adecuadas, se procede a su corte mediante el empleo de un microtomo. Aunque existen distintos tipos de microtomos (rotatorio de tipo Minot, de deslizamiento, de congelación, vibratomo, ultramicrotomo, etc.), todos ellos comparten el mismo principio de funcionamiento mecánico. Una vez que se fija la muestra, una cuchilla pasa por el tejido realizando un corte del grosor selec- cionado. Esta operación, que se puede repetir tantas veces como sea necesario, permite obtener secciones aisladas o series completas de secciones del tejido objeto de estudio. A continuación, se describe el proceso de corte del tejido nervioso mediante dos de los microtomos
más habituales en los laboratorios de histología: el microtomo de parafina y el
microtomo de congelación.
Corte con microtomo de parafina
El corte con microtomo de parafina requiere la inclusión previa de la pieza de tejido nervioso en parafina (Cuadro 3.2). Mediante el proceso de inclusión se consigue la impregnación del tejido en parafina a nivel celular, obteniéndose un bloque homogéneo en cuyo interior se encuentra la pieza de tejido nervioso. Si el proceso se realiza correctamente, el bloque de parafina no presenta disconti-
Figura 3.2. La fijación mediante perfusión transcardíaca permite obtener un tejido limpio de células sanguíneas. Las fotomicrografías muestran una sección de tejido fijado mediante inmersión directa (A) y otra sección de la misma región cerebral fijada mediante perfusión transcardíaca (B). A la derecha de cada imagen se presenta un detalle a mayor aumento de la zona encuadrada en la fotografía de la izquierda. Obsérvese que en la muestra del tejido no perfundido aparecen teñidas numerosas células sanguíneas (flechas).
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nuidad física con el tejido incluido en él y ambos elementos ofrecen una resistencia similar al avance de la cuchilla. De este modo, se pueden obtener secciones muy finas, de hasta 4 µm de grosor. Además, gracias a la homogeneidad y calidad de las secciones es posible cortar el bloque completo, con una mínima pérdida de
secciones. Este hecho permite reconstruir la muestra de forma fiable cuando, poste- riormente, se montan las secciones en orden seriado. A pesar de estas ventajas, el uso del microtomo de parafina también presenta algunos inconvenientes. En primer lugar, aún cuando la inclusión de la pieza haya resultado 62
Figura 3.3. Microtomo de parafina. A. Principales componentes del microtomo de parafina. B-C. Imágenes ilus- trativas del procedimiento a seguir para la recogida de una sección (B) y para su posterior transferencia al porta- bobjetos (C).
satisfactoria, no es aconsejable cortar secciones de grosor superior a 30 µm. Si se desean secciones más gruesas es conveniente usar el microtomo de conge- lación. En segundo lugar, es difícil conse-
guir una inclusión perfecta cuando se trabaja con grandes bloques de tejido. Además, dado que la parafina es una sustancia hidrófoba, para que pueda pene- trar en el tejido, éste debe ser deshidra- Cuadro 3.2. Procesado y corte del tejido mediante el microtomo de parafina
Para seccionar el tejido nervioso mediante el microtomo de parafina es necesario procesarlo ade- cuadamente. Puesto que la parafina no es miscible con el agua, para realizar la inclusión de una pieza de tejido en parafina resulta imprescindible eliminar previamente todo el agua que contie- ne. Para conseguir este objetivo, la pieza de tejido debe ser deshidratada mediante su introducción en una serie de alcoholes de graduación creciente. Sin embargo, la parafina tampoco es miscible con el alcohol, por lo que ha de emplearse un líquido intermediario que lo sea tanto con el alco- hol como con la parafina (xilol, butilo, toluol, benceno, cloroformo, etc). Para asegurar la efica- cia del procedimiento de deshidratación, es conveniente introducir la pieza en dos baños conse- cutivos de líquido intermediario. Finalizada la deshidratación, se transfiere la pieza directamente a un recipiente con parafina, que se mantiene líquida en el interior de una estufa. La inclusión se realiza mediante dos baños consecutivos en parafina líquida, el primero de 1 hora, y el segundo de 12 horas. Todo este proceso se realiza en el interior de una estufa a una temperatura 1 ó 2 gra- dos por encima del punto de fusión de la parafina (el punto exacto de fusión depende del tipo de parafina utilizado y aparece indicado en el envase). Este proceso concluye con la elaboración de un bloque de parafina. Para ello se rellena un molde de papel o de otro material con parafina líqui- da y a continuación, actuando con rapidez antes de que la parafina se solidifique, se introduce y se orienta la pieza de tejido. Una vez formado el bloque de parafina se deja endurecer a tempera- tura ambiente. En el momento del corte, se talla el bloque en forma de trapecio y se fija en la pinza del microtomo. Una vez obtenidas las secciones y montadas en portaobjetos, éstos pueden ser almacenados, durante el tiempo necesario.
Antes de la tinción las secciones deben ser desparafinadas y rehidratadas mediante un proceso inverso al realizado para la inclusión en parafina. En primer lugar, las secciones son bañadas en xilol con objeto de eliminar la parafina del tejido. A continuación, se pasan por una batería de alcoholes de graduación decreciente y finalmente se bañan en agua destilada.
Manipulación del tejido previa al corte. Deshidratación e inclusión en parafina. • Introducir la pieza de tejido durante 20 minutos en cada uno de los siguientes baños:
Alcohol 70º. Alcohol 80º.
Alcohol 96º (dos baños) Alcohol 100º (dos baños).
• Introducir la pieza de tejido durante 5 minutos en dos baños de xilol.
• Introducir la pieza de tejido en dos baños de parafina líquida: primer baño de 1 hora y segundo baño de 12 horas.
• Confección del bloque.
Manipulación del tejido posterior al corte. Desparafinado y rehidratación. • Baño de xilol... 5-10 minutos.
• Baño de xilol... 5 minutos.
• Baño de alcohol 100º... 2 minutos aproximadamente. • Baño de alcohol 96º... 2 minutos aproximadamente. • Baño de alcohol 70º ... 2 minutos aproximadamente. • Baño en agua destilada, al menos ... 10 minutos.
tado previamente. Finalmente, una vez obtenidas las secciones, éstas deben ser desparafinadas y rehidratadas antes de la tinción. Estas condiciones hacen que el corte mediante el microtomo de parafina sea más laborioso y requiera más tiempo que el corte mediante el microtomo de congelación.
Entre los diferentes elementos que componen un microtomo de parafina cabe destacar la pinza de sujeción del bloque, el mando de selección del grosor del corte, el tornillo micrométrico de avance del bloque, y la cuchilla (Fig. 3.3A). El funcio- namiento de este microtomo es sencillo: cada vez que se gira la manivela de avance, la pinza que sujeta el bloque de parafina avanza y al caer sobre la cuchilla se obtiene una sección del grosor selec- cionado.
Previamente al proceso de corte en sí, es preciso afianzar el bloque de tejido con las pinzas de sujeción y ajustar el ángulo de incidencia de la cuchilla (Fig. 3.4). La calidad de las secciones depende en gran medida del ángulo de incidencia de la cuchila. Un ángulo de incidencia adecuado es aquel que ejerce mínima compresión sobre sobre el tejido y permite obtener
secciones sin rasgaduras ni fracciona- mientos. Generalmente, a menor ángulo de incidencia de la cuchilla menor compresión sufren las secciones y, por tanto, mayor será la calidad de las mismas. Sin embargo, cuanto mayor sea la dureza de la pieza a seccionar mayor deberá ser el ángulo de incidencia de la cuchilla. Para elegir el ángulo adecuado se debe empezar con un ángulo de liberación de cero grados. Si las secciones resultantes no son de suficiente calidad, se debe aumentar el ángulo de incidencia en pasos discretos de dos grados hasta conseguir el resultado deseado. Una vez elegido, el ángulo de incidencia debe permanecer constante durante toda la sesión para que todas las secciones resulten en el mismo plano y evitar la pérdida de cortes. Las secciones obtenidas al hacer girar la mani- vela de avance quedan depositadas sobre la cuchilla. De aquí deben ser retiradas con un pincel fino y suave (Fig. 3.3B) para ser transferidas a un baño de agua con gela- tina a 37ºC (Fig. 3.3C). La gelatina facilita la adherencia de los cortes a la superficie del portaobjetos. Al estar en contacto con el agua caliente, las secciones se dilatan ligeramente y en ese momento deben ser recogidas desde abajo hacia arriba con el pincel y deslizadas sobre el portaobjetos (que se habrá introducido ligeramente en el agua para facilitar la recogida). Al montar las secciones sobre el portaobjetos se debe procurar que queden lo más exten- didas posible. Una vez montadas todas las secciones, los portaobjetos se introducen en una estufa a 37ºC durante 12 horas. Este paso permite que las secciones se sequen y se adhieran al portaobjetos. Una vez retirados los portaobjetos de la estufa, y antes de realizar la tinción propiamente dicha, las secciones deben ser sometidas a un proceso de desparafinado e hidrata- ción. En el Cuadro 3.2 se hace una descripción pormenorizada de este proceso.
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Figura 3.4. Representación esquemática del ángulo de incidencia de la cuchilla sobre el bloque de parafi- na.
Corte con microtomo de congelación
El corte mediante este tipo de microtomo requiere la congelación del tejido para que adquiera la consistencia necesaria y pueda ser seccionado en láminas finas mediante una cuchilla (Fig. 3.5). El proceso de congelación puede deteriorar el tejido nervioso ya que la formación de cristales de hielo produce desgarramientos micros- cópicos en el tejido y tras la descongela- ción éste presentará un aspecto espongi- forme. Para evitar este deterioro, la pieza de tejido debe ser previamente sometida a un baño en una solución de sacarosa al 30% p/v. Esta solución actuará como agente crioprotector y evitará la formación de cristales de hielo. La pieza de tejido debe permanecer en el baño de sacarosa el tiempo necesario para que se sumerja hasta el fondo del recipiente.
Al igual que sucede con el microtomo de parafina, el corte de tejido nervioso mediante el microtomo de congelación presenta ventajas e inconvenientes. En general, se puede afirmar que este tipo de aparato es muy útil para obtener secciones relativamente gruesas (20-200 µm). De hecho, haciendo uso del microtomo de congelación es prácticamente imposible obtener secciones de calidad aceptable con un grosor menor de 10 µm. Por otro lado, los requerimientos de ciertas técnicas de tinción impiden someter el tejido nervioso al procesado que conlleva el corte con el microtomo de parafina, siendo imprescindible el empleo del microtomo de congelación. Por ejemplo, si se desea realizar una tinción inmunohistoquímica el tejido debe cortarse necesariamente mediante el microtomo de congelación. A continuación, se describen los elementos más importantes del microtomo de conge- lación y algunos consejos prácticos sobre su uso. Entre los componentes del micro- tomo se incluyen el sistema de congela-
ción, el tornillo de selección del grosor de corte, el tornillo micrométrico, los torni- llos de la platina que permiten orientar la pieza en el plano deseado, y por último la cuchilla y su eje de deslizamiento. El sistema de congelación consiste en una bombona de anhídrido carbónico (CO2), un tubo de conducción del gas con llave de paso y una platina de congelación (Figura 3.5A).
Al inicio de la sesión, se coloca la pieza a cortar sobre la platina del microtomo, orientándola en el plano adecuado. Para fijar la pieza de tejido en la platina es conveniente depositar sobre su superficie una delgada capa de agua, colocar sobre ella la pieza de tejido y seguidamente abrir cuidadosamente la llave de paso del gas para congelarla. La congelación de la pieza es una operación clave ya que determinará la calidad de los cortes obtenidos. El grado óptimo de congelación depende de diversos factores, por ejemplo, el tipo de tejido, el grado previo de fijación y el procedimiento de fijación. Como regla general se puede decir que el tejido debe quedar en un estado tal que al cortarlo se advierta el paso de la cuchilla, sin nece- sidad de realizar una fuerza excesiva. Con objeto de que no varíe el grosor y otras características de las secciones obtenidas, el grado de congelación de la pieza debe mantenerse lo más constante posible a lo largo de todo el proceso de corte. En ningún momento debe permitirse que la pieza se descongele, ya que ésta se desprendería de la platina con la consi- guiente pérdida de secciones.
Una vez congelado el tejido, se selecciona el grosor de las secciones mediante el tornillo micrométrico de la platina y se ajusta el ángulo de incidencia de la cuchilla sobre la pieza. La calidad de las secciones depende en gran medida de este ajuste. El ángulo de incidencia debe permanecer constante durante todo el proceso de corte. Una vez realizadas todas estas operaciones, la cuchi-
lla puede deslizarse sobre la pieza de tejido obteniéndose así las secciones. En los microtomos de congelación, a diferencia de lo que ocurre en los de parafina, es la cuchi- lla la que avanza sobre el tejido. En el micro-
tomo que se muestra en la Figura 3.5 la cuchilla y su soporte se desplazan manual- mente sobre un sistema de guías (micro-
tomo de deslizamiento). Tras cada paso de
la cuchilla se obtiene una sección que queda FUNDAMENTOS DE NEUROCIENCIA. MANUAL DE LABORATORIO 66
Figura 3.5. Microtomo de congelación. A. Principales elementos del microtomo de congelación. B-C. Detalles del procedimiento de recogida de un corte desde la superficie de la cuchilla (B) y de su posterior transferencia al por- taobjetos (C).
depositada sobre la misma. Cada una de estas secciones debe ser recogida cuidado- samente con un pincel suave y húmedo (Fig. 3.5B) y depositada en un pocillo lleno de tampón fosfato salino, con objeto de mantenerlas en un medio isotónico. Una vez obtenidas las secciones deseadas, se reco- gen de los pocillos con un pincel y se "mon- tan" en los portaobjetos respetando el orden en el que fueron obtenidas para facilitar la completa reconstrucción de la muestra (Fig. 3.5C). Los portaobjetos deben estar gelatinizados para impedir que los cortes se desprendan en posteriores fases del pro- ceso de tinción. Una vez que las secciones se han montado en los portaobjetos y antes de proceder a teñirlas, éstas deben dejarse secar durante al menos 5 ó 6 horas.