A continuación se describen los princi- pales elementos que forman parte de un microscopio (Fig. 2.1). Los componentes del microscopio óptico pueden agruparse en dos categorías: elementos mecánicos y elementos ópticos. Aunque ambas clases de elementos son importantes para el funcionamiento y rendimiento del micros- copio, son los componentes ópticos los que realmente definen su calidad.
Elementos mecánicos
Base
La base constituye el pie sobre el que se apoya el microscopio y confiere estabi- lidad al mismo. Lleva incorporado el dispo- sitivo de encendido así como la fuente de iluminación.
Columna
Lacolumnatiene su origen en la base del
microscopio y es perpendicular a ella en su inicio, pero posteriormente se curva y discurre paralelamente a la base. Sirve de soporte para el resto de las piezas del microscopio, por ejemplo la platina y el tubo.
Platina
La platina consiste en una plataforma
rígida, orientada perpendicularmente al eje óptico del microscopio. La platina presenta una abertura, situada en el trayecto que siguen los haces luminosos de la fuente de iluminación, sobre la que se coloca la preparación. Asimismo, la platina de los microscopios modernos dispone de un sistema de pinzas o garras para sujetar el portaobjetos. Normalmente este sistema de sujeción es móvil y permite desplazar
el portaobjetos con precisión en dos ejes del plano horizontal perpendiculares entre sí, por medio de los dos tornillosdelporta-
objetos situados en el costado de la
platina. Estos tornillos no sólo permiten explorar distintas zonas de la preparación, sino que además, en combinación con las escalas graduadas (veáse Mediciones) permiten realizar mediciones o identificar de forma precisa lugares de interés en las preparaciones.
Tornillos macrométrico y micrométrico
Lostornillos macrométrico y micrométrico
accionan un mecanismo de cremallera que permite subir y bajar la platina (acercarla o alejarla del objetivo) con el fin de enfocar la imagen que se forma en el ocular. El tornillo macrométrico acciona un engra- naje de paso largo que permite efectuar desplazamientos de gran amplitud y largo recorrido. El tornillo micrométrico se emplea para realizar el ajuste fino del enfoque.
Tubo
Eltuboconsiste en una cámara oscura que contiene el ocular y los objetivos. A dife- rencia de lo que ocurría en los microsco- pios antiguos, en los microscopios modernos el tubo tiene una longitud fija.
Revólver portaobjetivos
El revólver portaobjetivos es un elemento
giratorio situado en la parte inferior del tubo, en el que se encuentran acoplados los diferentes objetivos del microscopio. La rotación del revólver permite la sustitu- ción de un objetivo por otro sin necesidad de retirar los ojos de los oculares cuando se desea observar la preparación a mayor aumento. Esta operación requiere un pequeño rectificado del enfoque de la preparación mediante el empleo de los tornillos macro y micrométrico.
Elementos ópticos
Objetivos
El objetivo consiste en un sistema de lentes convergentes dispuestas en el interior de un tubo. El objetivo se sitúa directamente sobre el objeto o muestra, entre el conden- sador y los oculares. La función del obje- tivo es producir una imagen magnificada de la preparación objeto de estudio. Dicha imagen magnificada se denomina imagen
intermedia oaérea. Puede visualizarse la
imagen aérea retirando el ocular y colo- cando una pantalla (por ejemplo un trozo de papel) en el mismo plano. Las lentes constituyentes de los objetivos están compuestas de diferentes vidrios dise- ñados para reducir las aberraciones de la
imagen. La buena factura del objetivo constituye un elemento crucial de la óptica de un microscopio, ya que cualquier defecto en este punto se acentúa cuando la imagen es aumentada por el ocular. Los objetivos pueden clasificarse en acro-
máticos y apocromáticos en función de
las aberraciones cromáticas que sean
capaces de eliminar (véase el Cuadro 2.2). Los objetivos más económicos y, por ello, los más empleados en los microscopios para iniciación a la microscopía, son los acromáticos. Estos objetivos eliminan la aberración cromática axial en dos longi- tudes de onda (azul y rojo). Los objetivos apocromáticos, más complejos, reducen la aberración cromática en tres longitudes de onda (azul, rojo y verde). Por otro lado, es posible que el objetivo esté dotado de un Cuadro 2.1. Orígenes de la microscopía
El término microscopio deriva de la combinación de los términos griegos mikro y scopeo que sig- nifican "pequeño" y "mirar". Prácticamente desde la edad media se sabe que los espejos conve- xos y las esferas de cristal llenas de agua tienen la propiedad de aumentar el tamaño de las imá- genes. Sin embargo, la primera ilustración conocida de un microscopio data de 1625. En el siglo XVII se comenzó a hacer un uso sistemático de los microscopios. De este modo, el sentido de la vista iba más allá de sus posibilidades naturales, y por lo tanto se abrían nuevas puertas para los naturalistas. Existían dos tipos de microscopios: el sencillo y el compuesto. El microscopio com- puesto consistía en una combinación de lentes y fue inventado por el holandés Zacharias Jensen. El microscopio sencillo estaba constituido por una sola lente y fue inventado por un comerciante holandés llamado Anton van Leeuwenhoek. Para construir este tipo de microscopios, Leeuwenhoek usaba lentes simples, las cuales, debido a su reducido tamaño, podían obtenerse de pequeños cristales perfectos. Puliendo cuidadosamente dichos cristales llegó a conseguir lentes que aumentaban hasta doscientas setenta veces un objeto con una nitidez considerable. Sin embargo, estos microsco- pios tenían el inconveniente de poseer un tamaño excesiva- mente reducido fruto de la pequeñez de las lentes utilizadas. Por otro lado, las lentes usadas producían un halo de color alrededor del objeto observado (aberración cromática) debi- do a que las lentes descomponían la luz blanca en las longi- tudes de onda de los distintos colores que la constituyen. Estos inconvenientes condujeron al mayor uso y a la evolu- ción del microscopio compuesto. En 1820, el inglés Joseph Jackson Lister diseñó un microscopio capaz de corregir el halo de colores que rodeaba al objeto observado. Este tipo de microscopio, denominado acromático, constituyó un gran avance y la serie de mejoras que sobre él se realizaron die- ron como resultado la aparición a finales del siglo XIX del microscopio óptico moderno.
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Microscopio simple utilizado por Leeuwenhoek
conjunto de lentes para corregir la curva-
tura de campo, otro tipo común de aberra-
ción. Dichos objetivos se denominan obje- tivos de campo plano y son muy usados hoy en día. Cabe destacar que existe una relación directa entre los tipos de aberra- ciones que es capaz de corregir un deter- minado objetivo, el número de lentes que lo componen y el costo del mismo. De este modo, los objetivos constituidos por el mayor número de lentes y los más costosos son los planoapocromáticos. Este tipo de objetivos se caracteriza por corregir tanto las aberraciones cromáticas en las longitudes de onda correspon- dientes al rojo, verde y azul, como la curva- tura del campo.
Además, los objetivos pueden clasificarse en secos y de inmersión, en función de que el medio existente entre la lente y la preparación sea aire o aceite. Al primer grupo pertenecen los objetivos de bajo aumento, mientras que en el segundo grupo se encuadran los objetivos de gran aumento (60x y 100x).
Otra característica importante de los obje- tivos modernos es que son parafocales. Esto significa que al cambiar de un obje- tivo a otro de mayor aumento, sólo es necesario realizar un pequeño ajuste con el tornillo micrométrico para conseguir una imagen enfocada. Además, el uso de este
tipo de objetivos aporta una ventaja adicional puesto que al cambiar de un objetivo a otro, la preparación no sólo se mantiene prácticamente enfocada, sino que también permanece centrada. En el cilindro exterior de los objetivos se encuentran impresas las características técnicas de los mismos (Fig. 2.2). Normalmente, aparece el nombre del fabri- cante, las aberraciones que el objetivo es capaz de corregir y, finalmente, figuran inscritas dos cifras separadas por una barra. La primera cifra indica los aumentos del objetivo y la segunda su apertura numérica. En ocasiones, también se indican la longitud del tubo y el grosor del cubreobjetos recomendado. Para la rápida identificación visual de los objetivos se les suele asignar un código de colores, en el que cada color define un aumento y una apertura numérica.
Oculares
El ocular está compuesto por el conjunto de lentes más cercano al ojo del observador. Su función consiste en aumentar la imagen aérea creada por el objetivo. La magnifica- ción de la imagen intermedia procedente del objetivo forma una imagen virtual. Los rayos de luz de esta imagen virtual son los que finalmente inciden sobre la retina (Fig. 2.3). En términos generales, el ocular funciona
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como una lupa y normalmente proporciona una amplificación adicional de 10x. Para que el rendimiento del microscopio sea máximo, las características técnicas de los oculares deben ser acordes con las de los objetivos empleados. Normalmente, los oculares dis- ponen de un sistema de corrección óptica con una escala de dioptría para compensar las diferencias de visión de cada uno de los ojos.
Fuente de iluminación
La fuente de iluminación es un elemento
de vital importancia en el microscopio, especialmente cuando se utilizan grandes aumentos. Se encuentra en el pie del microscopio y proporciona una luz fija y constante a la preparación. El microscopio suele disponer de un mecanismo para el control de la intensidad lumínica y de un diafragma de campo que permite la aper- tura y cierre del cono de luz que se proyecta sobre la preparación (Fig. 2.4).
Condensador y diafragma iris
Una correcta iluminación de la preparación aumenta las posibilidades funcionales del microscopio. La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparación para que la imagen se traslade de forma adecuada al objetivo y llegue con la mayor calidad posible al ojo del observador a través del ocular. Para ello los microsco- pios están dotados de un juego de lentes, denominadocondensador, situado entre la fuente de luz y los objetivos, cuya función es concentrar los rayos luminosos sobre la preparación (Fig. 2.4). Haciendo uso del condensador es posible conseguir una iluminación que se ajuste a la apertura numérica característica de cada objetivo. Para obtener una resolución óptima, las lentes que constituyen el condensador deben reconducir los haces de luz de forma que la iluminación del campo de visión del objetivo sea perfecta. Esta reconducción se puede hacer modificando dos parámetros. En primer lugar, es posible definir el plano del foco de la luz. Para ello se debe modificar la altura de las lentes del condensador, aproximándolo o distan- ciándolo de la preparación en el eje vertical. En términos generales, cuanto mayor sea el aumento del objetivo, más próximo deberá estar el condensador a la preparación. Un error muy común en la manipulación del condensador es intentar subir y bajar el mismo para controlar la intensidad lumínica. Esta maniobra es 44
Figura 2.3. Formación de una imagen virtual aumen- tada de una muestra microscópica a partir del sistema de lentes de un microscopio.
incorrecta puesto que el microscopio suele tener un mando para controlar la inten- sidad de luz que incide sobre la muestra. Cuando se emplean objetivos de bajo aumento, por ejemplo los de aumento 3x, es una tarea difícil conseguir iluminar todo el campo de visión del objetivo. Con este propósito, los condensadores modernos suelen estar provistos de una lente móvil situada en el extremo superior del mismo, que puede ser retirada cuando se emplean los objetivos de bajo aumento. En segundo lugar, la lente condensadora está equipada con un diafragma cuyo ajuste permite controlar el diámetro del cono de luz que incide sobre la preparación. La mayoría de los condensadores tienen grabada una escala mediante la cual es posible conocer la apertura numérica efectiva del haz de luz. Esta escala es muy útil, ya que permite adecuar dicha apertura a la del objetivo que se esté usando en cada momento. En muestras con poco contraste resulta acon- sejable disminuir el cono del haz de luz que incide sobre la preparación. En estos casos, el reducir la apertura del diafragma
del condensador alrededor del 75% de la apertura numérica del objetivo impide que la imagen aparezca borrosa.
Filtros selectivos
El contraste de la imagen de una prepara- ción microscópica puede también mejorarse mediante el empleo de filtros selectivoso coloreados para filtrar la luz de la fuente de iluminación. Estos filtros se caracterizan por permitir el paso de radiaciones luminosas de una determinada longitud de onda, en detri- mento de otras. Por ejemplo, el uso de filtros azules puede corregir una iluminación dema- siado amarillenta. Este tipo de técnicas para mejorar el contraste resulta muy útil en foto- micrografía.