Taino virus
4.5 Clonación y organización del genoma de Tomato mottle Taino virus
La clonación del genoma de ToMoTV se realizó a través del aislamiento de su forma replicativa. Primero se procedió a identificar las enzimas de restricción que presentan sólo un sitio de corte en cada molécula del genoma viral. Para ello, el ADN total de las plantas de tomate infectadas con el geminivirus en estudio (sección 4.4), se digirió con una batería de enzimas de
restricción y las digestiones resultantes se analizaron en un ensayo tipo Southern (Figura 11). En el mismo análisis se incluyeron muestras de ADN total de plantas de tomate infectadas que se incubaron con la enzima Mung bean (nucleasa) y otras muestras sin digerir.
La digestión con la nucleasa Mung bean, que hidroliza selectivamente al ADN monocatenario, permitió reconocer la banda correspondiente a la isoforma de ADNsc del genoma viral (ausente en los carriles 12 y 11 de la Figura 11A y B, respectivamente). Esta
Figura 11. Autorradiografía del ensayo tipo Southern para la determinación de
las enzimas de corte único en los componentes genómicos de ToMoTV. El extracto de ADN (0,5 µg) de una planta infectada con ToMoTV se digirió con un conjunto de enzimas de restricción y la nucleasa Mung bean. En el panel A se empleó como sonda radioactiva el gen AV1 de PHYVV y en el B el gen BC1 de PHYVV. En ambos casos se emplearon condiciones pocos restringentes. A: Carril 1: ADN de una planta de tomate no infectada, 2: ADN de una planta de tomate infectada con ToMoTV, 3: Digestión con Apa I, 4: Bgl II, 5: BamH I, 6: Cla I, 7: Dra I, 8: EcoR I, 9:
EcoR V, 10: Hae II, 11: Hind III, 12: Mung bean, 13: Hinc II, 14: Kpn I, 15: Pvu II, 16: Pst
I, 17: Stu I, 18: Ssp I, 19: Sca I, 20: Sal I, 21: Sty I, 22: Sac I, 23: Spe I, 24: Xba I, 25:
Xho I, 26: ADN de una planta de tomate infectada con ToMoTV y 27: Marcador de peso
molecular Escalera de 1Kb (Gibco-BRL, EE.UU.). B: Carril 1: ADN de una planta de tomate infectada con ToMoTV, 2: Apa I, 3: Bgl II, 4: BamH I, 5: Cla I, 6: Dra I, 7: EcoR I, 8: EcoR V, 9: Hae II, 10: Hind III, 11: Mung bean, 12: Hinc II, 13: Kpn I, 14: Pvu I, 15: Pst I, 16:
Stu I, 17: Ssp I, 18: Sca I, 19: Sal I, 20: Sty I, 21: Sac I, 22: Xba I, 23: Spe I, 24: Xho I,
25: ADN de una planta de tomate infectada con ToMoTV, 26: Marcador de peso molecular Escalera de 1Kb (Gibco-BRL, EE.UU.) y 27: ADN de una planta de tomate no infectada.
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1,6 Kb
2,6 Kb A
B
dc sc dc sc 1,6 Kb 2,6 Kb
banda presenta una talla aparente de 1,6 Kb y es la más abundante entre las isoformas virales. El resto de las bandas observadas se corresponden con las isoformas del intermediario de ADNdc (lineal, circular abierto y superenrollado) (Figura 11A, carriles 2 y 26). El análisis de los patrones de restricción obtenidos con las diferentes enzimas permitió distinguir aquellas que no cortan el ADN viral, de las que lo hacen una o más veces. Se reconocieron a las enzimas de corte único por ser aquellas que modificaron el patrón de isoformas del ADNdc produciendo una sola banda a la talla de 2,6 Kb aproximadamente. Las enzimas de corte único identificadas para el componente A fueron: Dra I, EcoR I, Hinc II, Sca I, Xba I y Xho I; y para el componente B fueron: EcoR V, Hinc II, Hind III y Xba I. Los sitios de restricción de las enzimas Hinc II y Xba I se identificaron en ambos componentes, pero fue Xba I la seleccionada para la clonación de los dos segmentos genómicos de ToMoTV. Xba I es una enzima más barata y genera extremos cohesivos en la digestión, lo que la hace más atractiva. Después de la clonación, se purificaron los plasmidios de las colonias seleccionadas y se comprobó la presencia en ellos de un inserto de talla aproximada de 2,6 Kb (resultado no mostrado). Los plasmidios obtenidos se nombraron consecutivamente comenzando por pZ1 hasta pZ9.
La selección final de los clones correspondientes a los componentes A y B de ToMoTV se realizó después de comprobar que eran infectivos (observación de síntomas y pruebas moleculares) en plantas de tomate que se bombardearon con cada uno de los clones por separado y con todas las combinaciones en par entre ellos. Resultaron infectivos sólo aquellos dúos en las combinaciones apropiadas, que implicaban a los plasmidios pZ2, pZ3, pZ5, pZ6, pZ7, pZ8 y pZ9. Los análisis por la técnica de Southern con sondas derivadas de PHYVV, indicaron que los clones pZ3, pZ5, pZ6 y pZ9 se correspondían con el componente A y los restantes con el componente B. Los patrones de RFLP de los clones pertenecientes a cada componente no mostraron divergencias entre ellos (resultados no mostrados). Un clon de cada componente se seleccionó al azar (pZ5 y pZ7) para el resto de los análisis y se nombraron pZToMoTV A y pZToMoTV B, respectivamente. La secuenciación de los insertos en los plasmidios pZToMoTV A y pZToMoTV B mostraron que ellos poseían 2597 y 2562 nt, respectivamente. Las secuencias fueron numeradas tomando como referencia la primera posición del decanucleótido G(1)GCCATCCGC, que se encuentra en el extremo 5´ de la estructura de tallo con horquilla, elemento estructural conservado en todos los geminivirus (Lazarowitz, 1992). Las secuencias nucleotídicas de los componentes A y B de ToMoTV se depositaron en la base de datos EMBL con los números de acceso AF012300 y AF012301, respectivamente. La estructura genómica de ToMoTV es semejante a la de otros begomovirus bipartitos (Figura 12). Los análisis para identificar los marcos de lectura abiertos (MLAs) existentes en cada secuencia demostraron que en el componente A se presentan cinco genes, cuatro de ellos en la cadena complementaria (cc) y uno en la cadena viral (cv). Por otra parte, el componente B presenta dos MLAs, uno en sendas cadenas. La comparación de la secuencia nucleotídica de cada MLA con las secuencias conocidas de otros geminivirus permitió identificar a cada MLA con los genes característicos presentes en estos virus (Tabla 7). La región de 170 nt, compartida entre los componentes A y B de ToMoTV, y que presenta un 95% de identidad, se identificó como la
abajo del codón de inicio de la traducción del gen AC1, y el extremo 3´ de la estructura de tallo con horquilla (posición 33). En el caso del ADN B se localiza entre los nt de las posiciones 2428 y 33. En la región común se encontraron motivos repetidos con una secuencia consenso AATTGGGGG, que se reconocieron como los sitios de interacción con la proteína asociada a la replicación, los iterones (Argüello-Astorga y col., 1994a).
En el genoma viral también se identificó la secuencias AATAA, que comienza en el componente A en la posición 943 cv y en la 855 cc; y en el componente B, en las posiciones 1223 cv y 1170 cc. Éstas son, probablemente, las señales de poliadenilación del mensajero que codifica para el gen AV1, el mensajero policistrónico que codifica para los genes AC1, AC2 y AC3, y el de los genes BV1 y BC1, respectivamente. También se identificaron motivos con secuencias ricas en AT en las posiciones 150 cv, 1532 cc y 2550 cc del ADN A; y 290 cv y 2219 cc del ADN B. Estos motivos pueden representar las cajas TATA de los promotores transcripcionales presente en cada componente genómico.
Tabla 7. Marcos de lectura abiertos y su posición en el genoma de ToMoTV.
MLA Proteína codificada (No de residuos y PM estimado) Talla del gen (posición en el genoma*)
Componente A
AV1 Proteína de la Cápside (251 aa, 27,8 KDa) 756 nt (189-944) AC1 Proteína asociada a la replicación (361 aa, 40,1 KDa) 1086 nt (1387-2472) AC2 Proteína Transactivadora (129 aa, 14,3 KDa) 390 nt (1086-1475) AC3 Proteína Potenciadora de la Replicación (132 aa, 14,6 KDa) 399 nt (941-1339) AC4 AC4 (87 aa, 9,6 KDa) 261 nt (2058-2321) Componente B
BV1 Proteína de Movimiento (293 aa, 32,5 KDa) 777 nt (381-1157) BC1 Proteína del Transporte Núcleo-Citoplasma (258 aa, 28,6 KDa) 882 nt (1223-2104)
Se indican las proteínas codificadas por cada MLA. Todos los análisis se realizaron con los programas VECTOR NTI 6, BLASTN y GENE RUNNER. La asignación de la función a las proteínas codificadas se realizó por analogía con otros begomovirus caracterizados anteriormente. * La posición de cada gen está dada sobre la cadena viral. PM: Peso molecular, aa: Aminoácidos.
ToMoTV A
2597 nt AV1, CP AC3, REn AC1, Rep AC4, AC4 AC2, TrAP EEC BV 1, NSP BC1, MPToMoTV B
2562 nt EECFigura 12. Representación de los ADN A y B de Tomato mottle Taino virus (ToMoTV). El número de nucleótidos de
cada molécula se indica debajo del acrónimo que identifica a cada componente. Las flechas representan los marcos de lectura abiertos identificados. EEC: Elemento estructural conservado. AC1, AC2, AC3, AC4, AV1, BC1 y BV1, identifican a los genes que codifican para las proteínas Rep, TrAP, REn, AC4, CP, MP y NSP, respectivamente. La identificación de los marcos de lectura abiertos se realizó mediante el programa VECTOR NTI.