La detección de los geminivirus se ha realizado durante mucho tiempo por métodos tales como la valoración de los síntomas y la transmisión a plantas indicadoras (Harrison, 1985). Otros ensayos empleados han sido la visualización a través del microscopio óptico de los cuerpos de inclusión generados durante la replicación viral y la localización de los viriones en las células vegetales por microscopía electrónica de transmisión (Kim y Carr, 1982; Christie y col., 1986). Sin embargo, las variaciones en cuanto al tropismo y tipos de estructuras citopatológicas inducidas en diferentes combinaciones virus-hospedante, no son suficientes para distinguir entre diferentes geminivirus (Brown y Bird, 1992). En el caso del uso de las plantas indicadoras, se requiere de lapsos de tiempo grandes para conocer los resultados. Por las razones anteriores es que estos métodos son muy poco empleados en la actualidad.
Las técnicas inmunológicas como el ELISA, utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales contra la proteína CP geminiviral, se emplean en pocas ocasiones para detectar y distinguir geminivirus (Givord y col., 1994). Entre las limitaciones de la técnica, para estos casos, se encuentra la moderada o poca inmunogenicidad de las proteínas CP geminivirales y la baja cantidad de este antígeno en las plantas infectadas (Harrison, 1985). No obstante, existen algunos juegos diagnósticos en el mercado (por ejemplo Agdia, EE.UU.) y en dependencia de la selección del anticuerpo, los ensayos pueden detectar un rango de geminivirus o distinguir entre geminivirus o razas de una misma especie. En la detección de los begomovirus se observa con frecuencia reacciones cruzadas debido a que las proteínas CP de éstos presentan una elevada identidad entre si.
Los métodos más usados para la detección e identificación parcial de los geminivirus son los basados en la caracterización de su ADN genómico. Ellos son la hibridación de ADN y la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP). En el primer caso, el ADN fijado a las membranas absorbentes, se hibrida con sondas de ADN genéricas o heterólogas (que provienen de un virus distinto al que se va a identificar), o específicas (que se derivan del virus que se quiere identificar). En ambos casos los resultados son modulados por las condiciones en las que se realiza el ensayo. La especificidad de la hibridación puede ser controlada a través de la selección de la sonda de ADN y de las condiciones en las que se realizan los ensayos (temperatura en la hibridación y en los lavados, y la concentración de sales en los últimos). Las sondas se generan con isótopos radiactivos o se marcan no radiactivamente, lo que a su vez hace más versátil al método. Las hibridaciones se desarrollan en forma de Southern (Southern, 1975) o de aplicaciones puntuales sobre las membranas. Numerosos laboratorios en Cuba y en otros países han desarrollado la detección de los geminivirus tanto en plantas enfermas como en insectos vectores basados en esta técnica (Czosnek y col., 1988; Navot y col., 1989; Gilbertson y col., 1991a; Caciagli y Bosco, 1996; Herrera y col., 1999; Rodríguez y col., 2003). Por su parte, la RCP sólo necesita cantidades pequeñas de tejido de partida y es sensible. Su especificidad puede ser controlada por medio de la selección de los cebadores y la temperatura a la que se realiza la hibridación de éstos con el ADN molde. Los cebadores empleados pueden ser específicos para una especie viral determinada o degenerados, los que sirven para detectar un amplio espectro de virus. Se han diseñado varios juegos de cebadores degenerados teniendo en cuenta las zonas del genoma geminiviral que se conservan a través de las distintas especies (Rojas y col., 1993; Briddon y Markham, 1994; Brown, 2000). En el caso de los cebadores diseñados por Rojas y col. (Rojas y col., 1993), su uso permite distinguir la presencia de un begomovirus bipartito de uno monopartito. Sobre los fragmentos generados por RCP pueden practicarse análisis tipo RFLP (siglas del inglés “Restriction Fragment Length Polymorphism”), los que permiten profundizar en la caracterización del virus.
En muchas ocasiones la identificación de un geminivirus implica el aislamiento y la secuenciación de su genoma íntegro. La presencia del intermediario replicativo de ADNdc de los geminivirus es un punto de partida para el aislamiento de las moléculas genómicas. Éstas
pueden ser clonadas directamente en vectores de clonación de Escherichia coli, lo que representa la forma más segura de contar con un genoma viral natural. De otra manera, el genoma viral puede ser aislado a través de la RCP con el empleo de enzimas de polimerización con alta fidelidad de copia.
Para establecer el estatus taxonómico de una especie geminiviral se requiere conocer varias de sus características (Fauquet y col., 2003), entre ellas:
1. Número de componentes genómicos 2. Organización del genoma
3. Identidad nucleotídica del ADN A (menor a un 89% con otros miembros son consideradas especies distintas)
4. Producción de pseudorrecombinantes viables con otras especies 5. Porcentaje de identidad del gen y proteína de la cápside
6. Gama de hospedantes y sintomatologías
La toma de la decisión sobre si un aislamiento geminiviral dado representa una especie nueva en la familia o constituye una cepa de otra especie anteriormente descrita, se realiza teniendo en cuenta el análisis de conjunto de los factores antes mencionados. En muchas ocasiones una especie no cumple estrictamente con todas las reglas. Sin embargo, algunas de las reglas tienen mayor peso que las otras en la toma de las decisiones y por ejemplo, el grado de identidad del componente A es una de ellas (Fauquet, 2002). Existen otras características del genoma como el ordenamiento y la secuencia de los iterones en la región origen de la replicación, que también contribuyen en la identificación de los geminivirus.