mottle Taino virus
4.9 Reordenamientos entre los componentes genómicos de Tomato mottle Taino
virus, Potato yellow mosaic virus y Tomato mottle virus
La comparación de las secuencias de la proteína Rep y los iterones de ToMoTV (Tabla 8, sección 4.6) con las correspondientes a la de otros begomovirus generó dos observaciones. La primera de ellas es que la proteína Rep de ToMoTV exhibe los mayores porcentajes de identidad con las proteínas homólogas de ToMoV y CdTV, y estos tres virus muestran iterones distintos. La secuencia nucleotídica del núcleo de los iterones para ToMoTV, ToMoV y CdTV es GGGGG, GGAGT y GGGGW, respectivamente (Argüello-Astorga y Ruiz-Medrano, 2001). La segunda observación es que ToMoTV tiene iterones similares a los encontrados en Tomato dwarf leaf curl virus (ToDLCV), TYLCSC, Dicliptera yellow mottle virus (DiYMoV) y las cepas de Venezuela y Guadalupe de PYMV, aunque el cuarto iterón, localizado cercano al codón de iniciación de la traducción del gen AC1 en PYMV, está ausente en la región RC de ToMoTV (Figura 25).
El análisis de las observaciones anteriores en su conjunto, fue la premisa para la interrogante sobre la posibilidad de si ToMoTV puede formar entidades pseudorrecombinantes viables con las especies más cercanas filogenéticamente, que poseen las secuencias de sus iterones disímiles (ToMoV o CdTV), y/o con los que poseen iterones similares (PYMV o DiYMoV). De ellos se seleccionaron ToMoV y PYMV, por ser los disponibles en el laboratorio de la Dra. Jane Polston (Gulf Coast Research and Educational Center, Bradenton, Florida, EE.UU.).
Los experimentos para evaluar la capacidad de pseudorrecombinación entre ToMoTV, PYMV-GP y ToMoV se desarrollaron en tabaco (Nicotiana tabacum L.) por ser un hospedante común para los tres virus en estudio. El desarrollo de la infección viral se evaluó a través de la observación de la aparición de los síntomas (amarillamientos y deformación foliar) y por la técnica Southern, entre 14 y 21 días posteriores a la inoculación.
Los síntomas aparecieron en las plantas inoculadas con los virus en su forma salvaje (componentes A y B de un mismo virus, usados como testigos) y además en aquellas que se inocularon con las mezclas heterólogas (virus quiméricos) constituidas por los componentes pertenecientes a ToMoTV y a PYMV-GP (ToMoTV A + PYMV-GP B y PYMV-GP A + ToMoTV B)
A B C D E
Figura 24. Detección del ADN A de ToMoTV en impresiones de tejido de plantas de tomate infectadas con este virus.
La detección se realizó por medio de la hibridación no radiactiva en membranas de Nylon. Las flechas indican las manchas violetas como resultado de la hidrólisis del BCIP por la fosfatasa alcalina. A: Impresión de la sección transversal de un peciolo de una planta de tomate no infectada. B a la E: Impresiones de secciones transversales de peciolos con diferentes grados de desarrollo pertenecientes a plantas de tomate infectadas con ToMoTV. Fotografías tomadas a través del estereoscopio WILD M3Z (Leica, Alemania) con aumento 16x.
(Tabla 10 y Figura 26B y D). El resto de las combinaciones heterólogas (ToMoTV A + ToMoV B, ToMoV A + ToMoTV B, PYMV-GP A + ToMoV B y ToMoV A + PYMV-GP B) no mostraron síntomas visibles. Los ensayos moleculares confirmaron los resultados de las observaciones (resultados no mostrados para el caso de la RCP). La detección de la banda de ADNsc en las autorradiografías se consideró el criterio para confirmar una replicación viral efectiva. Esta banda se observó sólo en las plantas inoculadas con los virus salvajes y con las dos quimeras posibles entre ToMoTV y PYMV-GP (Figura 27).
Tabla 10. Pseudorrecombinación entre los begomovirus ToMoTV, ToMoV y PYMV-GP.
Combinación de ADN viral Porcentaje y N˚ de plantas infectadas* (infectadas/ inoculadas)
ToMoTV A + B 63,1% (12/19) PYMV-GP A + B 94,5% (35/37) ToMoV A + B 100% (29/29) ToMoTV A + ToMoV B 0% (0/6) ToMoV A + ToMoTV B 0% (0/6) ToMoTV A + PYMV-GP B 69,5% (16/23) PYMV-GP A + ToMoTV B 63,6% (14/22) PYMV-GP A + ToMoV B 0% (0/20) ToMoV A + PYMV-GP B 0% (0/20)
*El establecimiento de la infección se evaluó por la observación de los síntomas y la hibridación de ADN. El ADN total se extrajo de las hojas de crecimiento nuevo.
PYMV-GP CATTTTGGTAAAAATGT-ATGTT CCCCCAATA –TGTT CCCCCAATA GCTCT ToMoTV CATATTTGTAAATAT---ATG-- ---A –TGTT CCCCCAATT GCTCT ToMoV CATTTTTGTAATAAGAAGAGGT- ACTCCAGAT GAGTT ACTCCATTT GAGCC BDMV CATTTTTGTAATAAGAGCTGGT- ACTCCAGTT GAGTT ACTCCAATT CCCCC
PYMV-GP GGCTCTCAAAA—CTCCTATG AATTGGGGG AACTGGGGG AACT TATATA GT ToMoTV CTCTCACAAAA—CTCATATC AATTGGGGG AACTGGGGG AACA TTTATA CT ToMoV TTCTCAAACTTG-CTCATTC AATTGGAGT –ATTAGAGT AACT TATATA TA BDMV CTCTCAAAACTATCTCATTC TATTGGAGT –ATTGGAGT TACT TATATA CG
PYMV-GP AGAAGTTCCTAAAGG-C----A-GATCA---A CACGTG GC GGCCATCCG ToMoTV ACAACCCTCTATAGAACTTTTAATCTCATTCATA CACGTG GC GGCCATCCG ToMoV AGAACCCTCTATAGAACTATTAATCTGGTTCATA CACGTG GC GGCCATCCG BDMV TAAACCCTCAATCTG--G-TT--TCGGA---A CACGTG GC GGCCATCCG
PYMV-GP TTA TAATATTAC PYMV-GP AYTGGGGG ToMoTV CTA TAATATTAC ToMoTV AYTGGGGG ToMoV ATA TAATATTAC ToMoV ATTGGAGT BDMV -TA TAATATTAC BDMV ATTGGAGT
Caja TATA
Caja G Brazo izquierdo de la horquilla
Horquilla Secuencia del iterón Rep
Figura 25. Alineamiento de las secuencias nucleotídicas correspondientes a la región común de los begomovirus
PYMV-GP, ToMoTV, ToMoV y BDMV. El alineamiento múltiple se realizó con el programa CLUSTAL W y se tomaron como anclas algunos elementos conservados en las secuencias (ej. Codón de inicio de la traducción del gen AC1, la caja TATA, la caja G y el nanonucleótido de la horquilla). Los iterones han sido señalados con flechas. Nótese la ausencia del iterón invertido (flecha con línea discontinua), más cercano al codón de inicio de la traducción del gen AC1, en el caso de ToMoTV. En este alineamiento se ha incluido la secuencia de BDMV, lo cual será útil en los análisis de la sección 4.10.
El examen detallado de los síntomas producidos, reveló que las plantas inoculadas con ToMoTV mostraban una marcada deformación foliar, como se describió en la sección 4.7 (Figura 26A). En el caso de la inoculación con PYMV-GP, las plantas mostraron manchas amarillas y sus hojas permanecieron sin deformaciones, es decir, un fenotipo similar en este aspecto al de la hoja de una planta sana (Figura 26C). Las plantas de tabaco inoculadas con la quimera PYMV-GP A + ToMoTV B se caracterizaron por la formación de rugosidades leves en sus hojas, mientras que en
las inoculadas con la combinación ToMoTV A + PYMV-GP B se observó la presencia de manchas amarillas (Figura 26B y D). Los síntomas producidos por ambas quimeras no fueron tan fuertes como los mostrados por la infección con los virus salvajes.